《外泌體提取與純化工藝規(guī)范》編制說(shuō)明一、工作簡(jiǎn)況（一）任務(wù)來(lái)源本文件由中國(guó)食品藥品企業(yè)質(zhì)量安全促進(jìn)會(huì)（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“促進(jìn)會(huì)”）提出并歸口，提交促進(jìn)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)化工作委員會(huì)申請(qǐng)立項(xiàng)，正式列入2025年團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)制修訂計(jì)劃，標(biāo)準(zhǔn)名稱(chēng)為《外泌體提取與純化工藝規(guī)范》。項(xiàng)目背景外泌體（exosome）作為細(xì)胞間通訊的關(guān)鍵介質(zhì)，已成為疾病診斷、藥物遞送及再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的核心原材料。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)外泌體產(chǎn)品的臨床前研究及IND申報(bào)數(shù)量呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)，但提取與純化工藝缺乏統(tǒng)一規(guī)范，導(dǎo)致批次間差異大、活性回收率低、雜質(zhì)殘留失控，嚴(yán)重制約了產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)化與監(jiān)管審評(píng)。目前，國(guó)內(nèi)尚無(wú)專(zhuān)門(mén)針對(duì)“外泌體提取與純化”這一完整工藝鏈的團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。藥典、ISO及FDA指南僅對(duì)外泌體終產(chǎn)品的質(zhì)量控制提出原則性要求，未對(duì)工藝步驟、關(guān)鍵參數(shù)、過(guò)程控制、驗(yàn)證方法等作出系統(tǒng)規(guī)定。促進(jìn)會(huì)基于2024年度“細(xì)胞外囊泡質(zhì)量提升行動(dòng)”專(zhuān)項(xiàng)調(diào)研結(jié)果，組織產(chǎn)學(xué)研檢多方力量啟動(dòng)本標(biāo)準(zhǔn)制定，旨在填補(bǔ)該領(lǐng)域空白，為外泌體原料藥、制劑及醫(yī)療器械注冊(cè)提供可操作的工藝規(guī)范。從時(shí)代背景分析：全球外泌體產(chǎn)業(yè)步入臨床轉(zhuǎn)化爆發(fā)期。2020—2024年，全球基于外泌體的臨床試驗(yàn)數(shù)量由86項(xiàng)增至312項(xiàng)（ClinicalT，2025-03數(shù)據(jù)），年復(fù)合增長(zhǎng)率38.1%。截至2024年底，美國(guó)FDA已受理11個(gè)外泌體新藥IND，其中3個(gè)進(jìn)入Ⅱ期；歐盟EMA受理7個(gè)，日本PMDA受理5個(gè)。市場(chǎng)端：全球外泌體治療與診斷市場(chǎng)規(guī)模2024年達(dá)14.7億美元，預(yù)計(jì)2030年將突破65億美元（CAGR28.4%，RootsAnalysis）。我國(guó)政策與監(jiān)管快速跟進(jìn)。2023年國(guó)家藥監(jiān)局將“細(xì)胞外囊泡”納入《生物制品分類(lèi)與申報(bào)技術(shù)要求（征求意見(jiàn)稿）》獨(dú)立章節(jié)；2024年12月發(fā)布《外泌體產(chǎn)品研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》，首次明確“工藝定義批”概念?！笆奈濉鄙锝?jīng)濟(jì)發(fā)展規(guī)劃明確提出“突破外泌體規(guī)?；苽?、質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)化評(píng)價(jià)瓶頸”。?京津冀、長(zhǎng)三角、粵港澳大灣區(qū)三地先后設(shè)立外泌體專(zhuān)業(yè)孵化器9家，注冊(cè)企業(yè)合計(jì)>260家，2024年融資總額68.3億元人民幣（中信證券生物藥小組統(tǒng)計(jì)）。產(chǎn)業(yè)鏈痛點(diǎn)——“前端工藝”成為最大卡脖子環(huán)節(jié)。來(lái)源復(fù)雜：血清、血漿、細(xì)胞上清、乳汁、尿液、植物等20余種起始物料，粒徑、表面標(biāo)志物、雜質(zhì)譜差異巨大，缺乏“統(tǒng)一語(yǔ)言”。工藝碎片化：實(shí)驗(yàn)室常用“UC-UC”兩步法，回收率25–40%，活性損失50%以上；放大到50L以上時(shí)，批次失敗率>15%。標(biāo)準(zhǔn)真空：藥典、ISO、FDA指南僅規(guī)定終產(chǎn)品質(zhì)檢項(xiàng)目，對(duì)“提取—純化”過(guò)程參數(shù)無(wú)量化要求，導(dǎo)致CDMO轉(zhuǎn)移困難、注冊(cè)發(fā)補(bǔ)率高。2024年國(guó)家藥監(jiān)局外泌體產(chǎn)品發(fā)布意見(jiàn)127條，其中81條涉及“工藝控制缺少關(guān)鍵參數(shù)”或“缺少工藝驗(yàn)證數(shù)據(jù)”。成本高昂。進(jìn)口超速離心機(jī)+密度梯度試劑，1000L規(guī)模單次耗材成本>300萬(wàn)元；因無(wú)統(tǒng)一規(guī)范，同一集團(tuán)內(nèi)部3家子公司設(shè)備利用率僅58%，重復(fù)投資嚴(yán)重。質(zhì)量事件敲響警鐘2024年8月，某Biotech公司外泌體創(chuàng)傷敷料因“粒徑分布超標(biāo)”導(dǎo)致Ⅱ期臨床暫停；根因調(diào)查：UC離心k因子未鎖定，批次間k值差異18%，造成粒徑D90漂移。2024年10月，國(guó)內(nèi)CDMO出口外泌體原料藥被歐盟QP拒絕放行，原因：未建立TFF超濾膜E/L評(píng)估，缺少可提取物數(shù)據(jù)。綜上，外泌體產(chǎn)業(yè)已從“科研藍(lán)?！笨焖偾腥搿爱a(chǎn)業(yè)化紅?！?，而“提取與純化”作為價(jià)值鏈最前端，卻無(wú)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)或團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)可依。制定《外泌體提取與純化工藝規(guī)范》團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)，是打通產(chǎn)業(yè)化“第一公里”、支撐監(jiān)管科學(xué)、降低行業(yè)綜合成本的迫切需求。（三）目的意義1.目的（1）建立外泌體提取與純化全工藝的通用技術(shù)語(yǔ)言，確保不同來(lái)源（血清、細(xì)胞上清、乳汁、尿液等）外泌體在工藝轉(zhuǎn)移放大時(shí)質(zhì)量可比、數(shù)據(jù)可追溯。（2）規(guī)定關(guān)鍵工藝參數(shù)（KPP）與關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA）的映射關(guān)系，為工藝驗(yàn)證、變更管理及現(xiàn)場(chǎng)核查提供量化依據(jù)。（3）為制造商、CDMO、檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)及監(jiān)管部門(mén)提供一套明確的工藝評(píng)估、檢測(cè)和驗(yàn)證方法，確保外泌體終產(chǎn)品符合《中國(guó)藥典》2025版（擬增）“外泌體總論”草案要求。2.意義（1）推動(dòng)行業(yè)發(fā)展統(tǒng)一工藝規(guī)范可降低技術(shù)壁壘，加速外泌體創(chuàng)新藥及Ⅲ類(lèi)醫(yī)療器械產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程，助力我國(guó)在細(xì)胞外囊泡治療領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)“彎道超車(chē)”。（2）提高批次一致性通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化離心序列、超濾/層析組合、除菌過(guò)濾等步驟，將外泌體粒徑回收率CV值由現(xiàn)行30%降至≤10%，活性保留率由平均65%提升至≥85%。（3）降低質(zhì)量管理成本工藝標(biāo)準(zhǔn)化可減少因批次失敗導(dǎo)致物料浪費(fèi)、返工及注冊(cè)發(fā)補(bǔ)，預(yù)計(jì)每1000L規(guī)模生產(chǎn)可節(jié)約直接成本超過(guò)百萬(wàn)元人民幣。（四）起草單位及起草人名單本文件起草單位：廣州潔特生物過(guò)濾股份有限公司、賽奧斯博生物科技（北京）有限公司和元和美（上海）生物技術(shù)有限公司、天根生化科技（北京）有限公司、北京三元基因藥業(yè)股份有限公司等。本文件主要起草人：待確認(rèn)。（五）主要起草過(guò)程1.文本調(diào)研2025年5月啟動(dòng)，收集國(guó)內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)/指南42份（ISO21498、FDACMCEVGuidance、USP<1046>等）。2.形成標(biāo)準(zhǔn)草案2025年6月召開(kāi)首次工作組會(huì)，確定框架。2025年8月9日完成草案V1.0。2.標(biāo)準(zhǔn)立項(xiàng)2025年9月9日向促進(jìn)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)提交立項(xiàng)建議書(shū)。于2025年9月21日獲得中國(guó)食品藥品企業(yè)質(zhì)量安全促進(jìn)會(huì)批準(zhǔn)立項(xiàng)。3.形成征求意見(jiàn)稿2025年10月16日，起草組根據(jù)反饋的意見(jiàn)和建議，召開(kāi)了團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)討論會(huì)，對(duì)草案內(nèi)容進(jìn)行了修改和調(diào)整，形成標(biāo)準(zhǔn)征求意見(jiàn)稿，提交中國(guó)食品藥品企業(yè)質(zhì)量安全促進(jìn)會(huì)進(jìn)行意見(jiàn)征集。二、確定標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容的論據(jù)（一）編制原則本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》以及《中國(guó)食品藥品企業(yè)質(zhì)量安全促進(jìn)會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)工作程序》起草。（二）標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容及適用范圍本文件規(guī)定了外泌體提取與純化過(guò)程中的一般要求、系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能、技術(shù)要求、試驗(yàn)方法、質(zhì)量控制。本文件適用于來(lái)源于細(xì)胞培養(yǎng)上清液、體液（如血清、尿液、乳汁）等樣本的外泌體提取與純化，適用于科研、臨床前研究及產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。范圍：適用樣本（細(xì)胞上清、血清等）與場(chǎng)景（科研、臨床前、產(chǎn)業(yè)化）。規(guī)范性引用：列出蛋白測(cè)定、用水、生物安全、細(xì)胞計(jì)數(shù)等9項(xiàng)國(guó)標(biāo)/藥典。術(shù)語(yǔ)定義：給出“超速離心法”“NTA”等關(guān)鍵術(shù)語(yǔ)。一般要求：實(shí)驗(yàn)室分區(qū)、設(shè)備校準(zhǔn)、人員培訓(xùn)、原輔料溯源、生物安全處置。系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能：五大模塊（前處理、提取、純化、濃縮換液、質(zhì)控）及高效、高純、可擴(kuò)展、生物相容四項(xiàng)功能指標(biāo)。技術(shù)要求：①屬性：粒徑30–150nm、杯托狀形態(tài)、陽(yáng)性標(biāo)志物CD9/63/81、雜蛋白≤10%。②性能：回收率≥60%、雜蛋白去除≥80%、內(nèi)毒素≤0.25EU/mL、無(wú)菌、無(wú)病毒。③過(guò)程：BSL-2環(huán)境、4h內(nèi)處理、全程4℃、緩沖液符合一級(jí)水標(biāo)準(zhǔn)。試驗(yàn)方法：對(duì)應(yīng)6.1–6.2項(xiàng)目，明確NTA、TEM、WB、BCA、鱟試劑、qPCR等執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)。質(zhì)量控制：①批次一致性：粒徑偏移≤10nm、濃度CV≤10%、標(biāo)志物灰度差≤15%。②穩(wěn)定性：–80/–20/4℃30d內(nèi)粒徑變化≤10%、濃度下降≤20%。附錄A（資料性）：提取與純化流程示意圖。附錄B（規(guī)范性）：五種提取方法（差速超速離心、密度梯度、超濾、SEC、TFF）原理、優(yōu)缺點(diǎn)、適用場(chǎng)景對(duì)照表。（三）確定標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容的論據(jù)1.保障工藝一致性通過(guò)限定離心轉(zhuǎn)速允差≤±2%、UCK因子≤150、TFF切向流速200–400mL/min、SEC柱效N≥3000m?1等量化指標(biāo)，確保不同產(chǎn)地、不同規(guī)模設(shè)備所得外泌體粒徑分布（D90/D10≤3.0）與標(biāo)志蛋白（CD63+CD81+TSG101+）表達(dá)水平CV≤10%。2.規(guī)范過(guò)程檢驗(yàn)與驗(yàn)證方法引入《中國(guó)藥典》通則3208“納米顆粒跟蹤分析（NTA）”《生物制品無(wú)菌試驗(yàn)法》2020版作為規(guī)范性引用文件；新增“外泌體活性保留率—β-NAG釋放法”作為資料性附錄B，填補(bǔ)國(guó)內(nèi)空白。3.適應(yīng)快速變化的行業(yè)需求設(shè)置“工藝放大變更分級(jí)表”（見(jiàn)附錄C），將變更分為微小、中等、重大三級(jí)，對(duì)應(yīng)驗(yàn)證深度與監(jiān)管報(bào)備路徑，滿(mǎn)足企業(yè)從實(shí)驗(yàn)室0.1L→中試10L→生產(chǎn)1000L的快速放大需求。主要試驗(yàn)[或驗(yàn)證]情況分析、技術(shù)經(jīng)濟(jì)論證、預(yù)期經(jīng)濟(jì)效果（一）驗(yàn)證方案1.起草單位對(duì)同一批HEK293上清（50L）采用本標(biāo)準(zhǔn)草案進(jìn)行三中心驗(yàn)證：a）粒徑回收率：均值87.3%，CV8.1%（n=9）；b）總蛋白去除率：≥99.2%；c）活性保留率（PC-12細(xì)胞攝取）：91.4%±3.6%；d）細(xì)菌內(nèi)毒素：≤0.25EU/mL；e）無(wú)菌檢查：0/10陽(yáng)性。（二）技術(shù)經(jīng)濟(jì)論證以1000L規(guī)模為例，采用標(biāo)準(zhǔn)推薦的“DC-TFF-SEC-除菌”四步工藝，設(shè)備折舊、耗材、人工、能耗合計(jì)成本約1.8萬(wàn)元/升，較傳統(tǒng)UC-UC兩步法降低22%；批次成功率由85%提升至98%，減少失敗返工損失約120萬(wàn)元/年。（三）預(yù)期經(jīng)濟(jì)效果1.縮短CMC研究周期6–9個(gè)月，加速I(mǎi)ND申報(bào)；2.統(tǒng)一工藝接