[19]中華人民共和國國家知識產權局[21]申請?zhí)?00910135015.8[43]公開日2009年12月9日[11]公開號CN101597233A[22]申請日2009.4.15[21]申請?zhí)?00910135015.8[30]優(yōu)先權地址200083上海市中山北一路803號權利要求書2頁說明書23頁附圖4頁不與麻黃堿和偽麻黃堿交叉反應的甲基苯丙胺單抗試劑盒[57]摘要本發(fā)明公開了用于甲基苯丙胺檢測及抗體制備的半抗原、完全抗原。本發(fā)明還公開了用該完全抗原制備的抗甲基苯丙胺單克隆抗體，以及膠體金標記甲基苯丙胺單抗免疫檢測板，以用于檢測藥品或尿樣等人體標本中的甲基苯丙胺。與HPLC等色譜方法相比，本發(fā)明的檢測板簡單、輕便，易于攜帶，可以現場檢測，而且不需要昂貴的設備。使用本發(fā)明的檢測板檢測甲基苯丙胺，整個測試可在3-5min內完成，檢測的靈敏度可達300ng,且與60種常見藥物、毒品，尤其是麻黃堿和偽麻黃堿，沒有交叉反應。21.一種半抗原，其特征在于，所述半抗原具有式1所示的結構：式12.一種完全抗原，其特征在于，所述完全抗原具有式2所示的結構：3.一種制備式2所述的完全抗原的方法，其特征在于，所述方法包括步驟：(a)對甲基苯丙胺進行硝化，在其對位接入硝基基團，以形成對硝基-(c)將對氨基-甲基苯丙胺與蛋白質載體連接，以制得式2所示的完全抗原。4.一種權利要求1所述的半抗原或權利要求2所述的完全抗原的用途，其特征在于，用于制備甲基苯丙胺特異性單克隆抗體。5.一種單克隆抗體，其特征在于，它特異性結合于甲基苯丙胺。6.一種產生權利要求5所述的單克隆抗體的雜交瘤細胞系，其特征在于，它是小鼠雜交瘤細胞系CCTCCNO.C200914。7.一種權利要求5所述的單克隆抗體的用途，其特征在于，用于制備檢測樣品中甲基苯丙胺的試劑、檢測板或試劑盒。8.一種檢測生物樣品中是否存在甲基苯丙胺的方法，其特征在于，包括步(a)將樣品與權利要求5所述的單克隆抗體接觸；3(b)檢測是否形成抗原-抗體復合物，其中形成復合物就表示樣品中存在甲基苯丙胺。9.一種檢測板，其特征在于，所述的檢測板包括基片(支撐板)和測試條，所述的測試條含有權利要求5所述的單克隆抗體。10.一種試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒含有容器以及位于容器內的權利要求5所述的單克隆抗體，或者所述的試劑盒含有權利要求9所述的檢測板和使用說明書。4不與麻黃堿和偽麻黃堿交叉反應的甲基苯丙胺單抗試劑盒本發(fā)明涉及違禁藥品的檢測，尤其涉及甲基苯胺的酶聯(lián)免疫檢測。甲基苯丙胺，又稱甲基安非他明(Methamphtamine)、“冰毒”,是一種興奮劑新型毒品，非法濫用嚴重。隨著與甲基苯丙胺相關的刑事案件逐年上升和國家對甲基苯丙胺管理的日趨嚴格，本領域對甲基苯丙胺和濫用毒品者生物標本中甲基苯丙胺的檢測提出了更高的要求。目前，甲基苯丙胺的檢測主要是基于色譜分析方法，例如氣質聯(lián)用色譜分析(GC-MS)和高效液相色譜分析(HPLC)。這些色譜方法具有很好的靈敏度和特異性，但操作繁瑣，需要昂貴的儀器設備，且耗時長。特定的結合反應，例如抗原-抗體反應，已經廣泛用于檢測生物樣品中存在的各種物質的免疫測試中。其中，膠體金免疫層析技術是近年來發(fā)展起來的一種獨特的免疫診斷技術，具有免疫反應和色譜層析的特定，與GC-MS比較，膠體金層析技術具有特異性強、靈敏度高、簡單快速、易于操作、結果容易判讀、無需任何儀器設備等優(yōu)點。國內外現有的甲基苯丙胺單抗免疫試劑盒均與的麻黃堿和偽麻黃堿成分發(fā)生交叉反應，產生假陽性的結果。麻黃堿和偽麻黃堿是感冒藥、止咳藥水等正常治療藥物中含有的主要成分，在毒品尿檢、征兵體檢中經常發(fā)生當事人在正常服用上述含有麻黃堿和偽麻黃堿成分的藥物時被檢測出假陽性結果，嚴重影響了辦案工作，產生了嚴重的負面影響。因此，甲基苯丙胺單抗免疫試劑盒與麻黃堿和偽麻黃堿發(fā)生交叉反應的問題，是國內外長期為之研究的難題。因此，本領域迫切需要一種能夠更加快速、簡易、靈敏地檢測甲基苯丙胺，且與麻黃堿和偽麻黃堿沒有交叉反應的檢測方法和檢測試劑。5發(fā)明內容本發(fā)明的目的正是提供一種快速、簡易、靈敏地檢測甲基苯丙胺且與麻黃堿和偽麻黃堿沒有交叉反應的檢測方法和檢測試劑。在本發(fā)明的第一方面中，提供了一種半抗原，所述半抗原具有式1所示的結構：式1在本發(fā)明的第二方面中，提供了一種完全抗原，所述完全抗原具有式2所示的式2在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，所述蛋白質載體為選自下組中的任何一種蛋白質：血藍蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白或y球蛋白。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選例中，所述蛋白質載體是血藍蛋白或牛血清白蛋白。在本發(fā)明的第三方面中，提供了一種制備式2所述的完全抗原的方法，所述方(a)對甲基苯丙胺進行硝化，在其對位接入硝基基團，以形成對硝基-甲基苯丙;(c)將對氨基-甲基苯丙胺與蛋白質載體連接，以制得式2所示的完全抗原。在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，步驟(a)的條件如下：反應溫度為-20～20℃,優(yōu)選 6-10～10℃,更優(yōu)選-5～0℃;反應時間為1-24小時，優(yōu)選2-12小時，更優(yōu)選2-6在另一優(yōu)選例中，步驟(b)的條件如下：反應溫度為室溫～100℃,優(yōu)選50-70℃,更優(yōu)選60℃;反應時間為5-24小時，優(yōu)選8-12小時，更優(yōu)選8小時。在另一優(yōu)選例中，步驟(c)的條件如下：反應溫度為0-40℃,優(yōu)選4-25℃,更優(yōu)選20～25℃;反應pH為3.0-6.0,優(yōu)選4.0-5.0,更優(yōu)選4.5;反應時間為3-24小時，優(yōu)選6-12小時，更優(yōu)選6小時。在本發(fā)明的第四方面中，提供了一種本發(fā)明前述的半抗原或完全抗原的用途，其用于制備甲基苯丙胺特異性免疫球蛋白。在本發(fā)明中，所述免疫球蛋白優(yōu)選為甲基苯丙胺特異性的單克隆抗體。在本發(fā)明的第五方面中，提供了一種免疫球蛋白，所述免疫球蛋白特異性結合于甲基苯丙胺。在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，所述免疫球蛋白由小鼠雜交瘤細胞系產生，優(yōu)選所述雜交瘤細胞系為CCTCCNO.C200914(小鼠單抗雜交瘤細胞株，Met1,于2009年2月20日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC,中國，武漢，武漢大學))。在另一優(yōu)選例中，所述的免疫球蛋白與甲基苯丙胺的結合效價大于1:4000,優(yōu)選大于1:8000,更優(yōu)選大于1:16000。在另一優(yōu)選例中，所述甲基苯丙胺的效價為1:4000～1:16000,更優(yōu)選1:8000～1:16000。在另一優(yōu)選例中，所述的免疫球蛋白為單克隆抗體。在另一優(yōu)選例中，所述的免疫球蛋白還結合于MDMA。在另一優(yōu)選例中，所述的免疫球蛋白不結合于麻黃堿或偽麻黃堿。在本發(fā)明的第六方面中，提供了一種產生前述的免疫球蛋白的雜交瘤細胞系，所述雜交瘤細胞系是一種小鼠雜交瘤細胞系，優(yōu)選所述細胞系為CCTCCNO.在本發(fā)明的第七方面中，提供了一種前述的免疫球蛋白的用途，其用于制備檢測樣品中甲基苯丙胺的試劑、檢測板或試劑盒。在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，所述樣品是生物樣品，且優(yōu)選為血樣或尿樣。在本發(fā)明的第八方面中，提供了一種檢測生物樣品中是否存在甲基苯丙胺的 7方法，所述方法包括步驟：(a)將樣品與前述的免疫球蛋白接觸；(b)檢測是否形成抗原-抗體復合物，其中形成復合物就表示樣品中存在甲基苯丙胺。在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，所述免疫球蛋白帶有可檢測標記物。更佳地，所述的標記物選自下組：膠體金標記物、有色標記物或熒光標記物。在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，所述檢測方法為膠體金檢測法、比色檢測法、或熒光檢測法。在本發(fā)明的第九方面中，提供了一種檢測板，所述的檢測板包括基片(支撐板)和測試條，所述的測試條含有前述的免疫球蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的測試條還含有完全抗原點樣區(qū)含有固定化的式2所示的完全抗原。在另一優(yōu)選例中，所述的測試條由濾樣紙、層析材料、硝酸纖維素膜和吸水紙依次搭接組成。在另一優(yōu)選例中，所述層析材料預包被有經膠體金標記或有色標記的本發(fā)明的免疫球蛋白；所述硝酸纖維素膜上吸附有檢測線和質控線，所述的檢測線為式2所示的完全抗原；所述的質控線為羊抗鼠IgG多抗。所述層析材料預包被有濃度范圍為0.01-20.0mg/ml,優(yōu)選0.1-10.0mg/ml,更優(yōu)選為0.2-2.0mg/ml,最優(yōu)選0.5-1mg/ml,且包被量為5-150μI/cm2,優(yōu)選10-100μV/cm2,更優(yōu)選20-70μI/cm2的經膠體金標記或有色標記的本發(fā)明的免疫球蛋白。所述檢測線采用了濃度范圍為0.01-20.0mg/ml,優(yōu)選0.1-10.0mg/ml,更優(yōu)選為0.2-2.0mg/ml,且吸附量為0.01-100μI/cm2,優(yōu)選0.5-50μ1/cm2,更優(yōu)選1-20μV/cm2的式2所示的完全抗原。在本發(fā)明的第十方面中，提供了一種試劑盒，所述的試劑盒含有容器以及位于容器內的前述的免疫球蛋白，或者所述的試劑盒含有前述的檢測板和使用說明 8生物材料保藏說明本發(fā)明的小鼠單抗雜交瘤細胞株Met1,已于2009年2月20日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC,中國武漢，武漢大學),保藏編號為CCTCCNO.C200914。附圖說明圖1:甲基苯丙胺完全抗原制備示意圖。圖2:融合率測定示意圖。圖3:純化抗體經2-ME還原后的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜。圖4:甲基苯丙胺抗血清的效價(滴度)測定。圖5:甲基苯丙胺單克隆抗體MA-CH1的效價測定。圖6:甲基苯丙胺單克隆抗體MA-CH1與BSA交叉反應的測定圖7:檢測板中試條組成示意圖。圖8:檢測板組裝原理示意圖。圖9:毒品單抗免疫快速檢測板判定結果示意圖。具體實施方式本發(fā)明人經過長期而深入的研究合成了甲基苯丙胺活化衍生物對氨基-甲基苯丙胺，并將其與適當的蛋白質載體連接產生了完全抗原，以此為免疫原免疫Balb/C小鼠，將其脾細胞與小鼠骨髓瘤SP20細胞融合，獲得特異性分泌抗甲基苯丙胺的單克隆細胞株，并制備并純化得到了甲基苯丙胺單克隆抗體，其后進一步用所述完全抗原和甲基苯丙胺抗體制備了具有高靈敏度和甲基苯丙胺的免疫檢測板，從而完成了本發(fā)明。半抗原甲基苯丙胺(Methamphtamine)分子量很小(149.24道爾頓),是半抗原物質，只具備免疫反應性，沒有免疫原性，不能直接用于免疫動物而獲得抗體。因此，為了制備本發(fā)明的完全抗原，對甲基苯丙胺進行了活化并制得了本發(fā)明的半抗原。如本文所用，本發(fā)明的“半抗原”、“甲基苯丙胺活化衍生物”或“活化的小分子”是指經本發(fā)明的衍生反應得到的具有結構式1的對氨基-N-甲基苯丙胺 9完全抗原通常，半抗原需要和大分子如KLH(血藍蛋白)或BSA(牛血清白蛋白)以共價鍵方式偶聯(lián)，成為既具有免疫反應性，又具有免疫原性的完全抗原。如本文所用，本發(fā)明的“完全抗原”是指本發(fā)明的半抗原與適當的蛋白質載體結合后的產物。如本文所用，本發(fā)明中的“蛋白質載體”是指任何在免疫學上可接受的用于形成完全抗原的蛋白質，其可為例如，血藍蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白或Y球本發(fā)明用于甲基苯丙胺檢測及抗體制備的完全抗原的結構如式2所示：其中，X為蛋白質載體，本發(fā)明中優(yōu)選血藍蛋白(KLH)或牛血清白蛋白(BSA);在本發(fā)明的一個優(yōu)選的方案中，X為血藍蛋白，完全抗原為甲基苯丙胺-KLH,作為免疫用抗原，用于制備分泌抗甲基苯丙胺單克隆抗體的雜交瘤細胞。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的方案中，X為牛血清白蛋白，完全抗原為甲基苯丙胺-BSA,作為檢測用抗原，用于制備檢測甲基苯丙胺的單克隆抗體免疫檢測板。本發(fā)明的完全抗原的制備包括如下步驟：步驟(a):200910135015.8說明書第7/23頁步驟(c):具體而言，在步驟(a)硝化反應中，對甲基苯丙胺進行硝化，即在其苯環(huán)上接入一個硝基基團；步驟(b)還原反應中：將接上去的硝基還原為氨基，使其具有活潑的化學性質；步驟(c)偶聯(lián)反應中：采用同源雙功能氨基偶聯(lián)劑將活化的甲基苯所具有的免疫原性。其中所述的硝化和還原反應可以本領域技術人員條件進行。例如，本發(fā)明的硝化反應可在如下條件下進行：反應溫度為-20～20℃,優(yōu)選-10～10℃,更優(yōu)選-5～0℃;反應時間為1-24小時，優(yōu)選2-12小時，更優(yōu)選2-6小時；本發(fā)明的還原反應條件可在如下條件下進行：為-20～20℃,優(yōu)選-10~10℃,更優(yōu)選-5～0℃;反應時間為1-24小時，優(yōu)選2-12小時，更優(yōu)選2-6小時；本發(fā)明的載體連接反應可在如下條件下進行：反應溫度為0-40℃,優(yōu)選4-25℃,更優(yōu)選20～25℃;反應pH為3.0-6.0,優(yōu)選4.0-5.0,更優(yōu)選4.5;反應時間為3-24小時，優(yōu)選6-12小時，更優(yōu)選6小時。本領域普通技術人員可根據具體操作或對產物的要求對這些條件進行適當調整。本發(fā)明的半抗原和蛋白質載體的連接可使用本領免疫原性，能刺激小鼠產生強烈的免疫反應血清效價可達1:16000;完全抗原甲基苯丙胺-BSA很好的保留了甲基苯丙胺的免疫反應性。本文所用的術語“單克隆抗體”是指獲自基本上同源的抗體群的抗體，即，組成該群體的抗體個體都相同，除了可能存在少“單克隆的”是指該抗體的性質不是離散抗體的混合物。 本發(fā)明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行制備。例如，本發(fā)明完全抗原，可被施用于動物以誘導單克隆抗體的產生。對于單克隆等人，Eur.J.Immunol.6:511,1976;Kohler等人，Eur.N.Y.,1981)或可用重組DNA法(美國專利號4,816,567)制代表性的骨髓瘤細胞是有效融合、通過選擇的抗體產生細胞支持抗體的穩(wěn)定高水平產生、且對培養(yǎng)基(HAT培養(yǎng)基基質)敏感的那些骨髓瘤細胞，包括骨髓瘤細胞系，例如鼠類的骨髓瘤細胞系，包括衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠腫瘤的骨髓瘤細胞系(可購自SalkInstituteCellDistributionCenter,圣地亞哥，加利福尼亞，美克維爾，馬里蘭，美國)。人骨髓瘤和小鼠-人雜合骨髓瘤細胞系也已被描述用于產生人單克隆抗體[Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984);Brodeur等，單克隆抗體的生產技術和應用(MonoclonalAntibodiesProductionTechniquesandApplications),51-63頁(MarcelDekker,Inc.,紐約，1987)]。對雜交瘤細胞生長于其中的培養(yǎng)基進行分析以檢測具有所需特異性的單克隆抗體的產生，如，通過體外結合分析例如，酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫分析(RIA)。表達抗體的細胞的位置可用FACS進行檢測。然后，可將雜交瘤克隆通過有限稀釋步驟形成亞克隆(subcloned),并通過標準方法生長(Goding,單克隆抗Press(1986)59-103頁)。為了達到這一目的而使用的適合的培養(yǎng)基包括，例如，DMEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。此外，雜交瘤細胞可在動物體內作為腹水瘤生長。由亞克隆分泌的單克隆抗體從培養(yǎng)基、腹水或血清中通過常規(guī)的免疫球蛋白純化工藝適當地得到分離，這些純化工藝為例如，蛋白A-瓊脂糖法(proteinA-Sepharose)、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析。本發(fā)明提供了一種抗甲基苯丙胺的單克隆抗體MA-CH1,經鑒定為IgG1型，K(kappa)亞型。在一個實施方式中，完全抗原上的蛋白質載體為KLH,所述MA-CH1稱為MA-KLH-CHI(CCTCCNO.C200914)。在另一個實施方式中，完全抗原上的蛋白質載體為BSA,所述MA-CH1稱為MA-BSA-CH1。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的方案中，單克隆抗體MA-CH1采用培養(yǎng)雜交瘤細胞方法制備。取雜交瘤細胞培養(yǎng)的上清液，經飽和硫酸銨沉淀法粗提出IgG,再將粗提的抗體經親和層析柱(ProteinG-Sephrose)純化。本發(fā)明的一個優(yōu)選的方案中，單克隆抗體MA-CH1采用Balb/C小鼠腹水生產單克隆抗體的方法制備。將約10?-10?個雜交瘤細胞接種到致敏的小鼠腹腔內，2-4周 內可見腹部明顯脹大。抽取腹水，經飽和硫酸銨沉淀法粗提出IgG,再將粗提的抗體經親和層析柱(ProteinG-Sephrose)純化。標記的本發(fā)明的單克隆抗體在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，所述單克隆抗體帶有可檢測標記物。更佳地，所述的標記物選自下組：膠體金標記物、有色標記物或熒光標記物。屆全國毒物分析學術交流會論文選，289-294,中國人民公安大學出版社2000年9DavidLane,UsingAntibod膠體金標記可采用本領域技術人員已知的方法進行。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的方案中，抗甲基苯丙胺的單克隆抗體MA-CH1用膠體金標記，得到膠體金標記的MA-CH1單克隆抗體。本發(fā)明的抗甲基苯丙胺單克隆抗體MA-CH1有很好的特異性，與60種常見藥物、毒品(尤其是麻黃堿或偽麻黃堿)沒有交叉反應；MA-CH1與蛋白質載體沒有交叉反應。在一個優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的單克隆抗體與甲基苯丙胺-BSA的載體BSA沒有交叉反應。在另一個優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的單克隆抗體與甲基苯丙胺-KLH的載體KLH沒有交叉反應。本發(fā)明的單克隆抗體MA-CH1有很高的效價，在甲基苯丙胺-BSA包被的酶標板檢測中，效價達到1:2000,優(yōu)選1:4000,更優(yōu)選1:8000。檢測試劑盒本發(fā)明的檢測試劑盒是指含有本發(fā)明的免疫球蛋白或單克隆抗體并可用于甲基苯丙胺檢測的試劑盒。所述的試劑盒可根據需要包括容器、使用說明書、緩沖劑、免疫助劑等。本發(fā)明的檢測試劑盒可采用多種形式，例如檢測板、含有各種測試所需試劑的測試盒等。以下以檢測板為例對本發(fā)明的試劑盒進行說明，但不應理解為本發(fā)明僅限于檢測板，甲基苯丙胺檢測用膠體金標記-免疫檢測板檢測原理甲基苯丙胺的檢測采用競爭抑制法。本發(fā)明將甲基苯丙胺-BSA固定于硝酸纖維膜上的檢測區(qū)(固相抗原),待檢樣品溶液中的甲基苯丙胺(游離抗原)與固相抗原200910135015.8說明書第10/23頁 競爭結合膠體金標記的抗甲基苯丙胺單抗(標記抗胺，將抑制標記抗體與固定抗原的結合，抑制在硝酸纖維素膜的檢測區(qū)形成色帶。測定后檢測區(qū)如果形成色帶，則結果為陰性，待測樣形成色帶，則結果為陽性，檢測樣品含有甲基苯丙胺。通常，在檢測中設置內質控。本發(fā)明在硝酸纖維膜的檢測區(qū)臨近的質控區(qū)設置羊抗鼠IgG多抗，在層析載體玻璃纖維紙上預包有被膠體金標記或有色標記的甲基苯丙胺單克隆抗體。無論待檢樣品中是否含有甲基苯預包被的膠體金標記或有色標記的甲基苯丙胺單克隆抗體總能與硝酸纖維素膜上的羊抗鼠IgG多抗結合形成一條有色質控帶，該條色帶是判定層析過程是否正常和檢測板本發(fā)明的檢測板可采用本領域常用的檢測板材料本發(fā)明檢測甲基苯丙胺的免疫檢測板，包括測試條和支撐測試條的支撐板，如可采用PVC聚脂膠板等；所述的測試條由濾樣紙、層析材料、硝酸纖維素膜和吸水紙依次搭接組成，搭接部位可以采用常規(guī)的方析材料預包被膠體金標記或有色標記的甲基苯丙胺被膠體金標記的甲基苯丙胺單克隆抗體(MA-CH1),硝酸纖維素膜上吸附檢測線和質控線；所述的檢測線為完全抗原甲基苯丙胺，檢測線所在的區(qū)域為檢測區(qū)；所述的質控線為羊抗鼠多克隆抗體，質控線所在的區(qū)域為質控區(qū)；因此，測試條上的檢測物依次為：預包被膠體金標記的甲基苯丙胺單克隆抗在一個優(yōu)選的方案中：層析材料上預包被膠體金標記的甲基苯丙胺單克隆抗硝酸纖維膜上吸附的本發(fā)明完全抗原是采用濃度為0.5～1mg/ml的完全抗原胺一個優(yōu)選實施方式中，所述完全抗原中的蛋白質載體為BSA或KLH檢測板的靈敏度在250ng～300ng之間。 免疫檢測板的性能本發(fā)明的膠體金標記甲基苯丙胺單抗免疫檢測板具有如下性能：靈敏度高：調節(jié)試劑條上預包被的膠體金標記的MA-CH1單抗溶液、本發(fā)明完全抗原的量，測試尿樣中含有的甲基苯丙胺，進行靈敏度測試。結果表明，本發(fā)明的膠體金標記的甲基苯丙胺單克隆抗體和完全抗原制備的檢測板，甲基苯丙胺的最低檢測量可達到250ng/ml。穩(wěn)定性好：將膠體金標記的甲基苯丙胺單克隆抗體試劑條，靈敏度為1000ng/ml置于65℃下分別保溫0.5d、1d、1.5d、2d、2.5d、3d、4d、5d,然后按上述靈敏度試驗方法進行1000ng/ml的靈敏度測試。結果表明，膠體金標記的甲基苯丙胺單抗在65℃下能夠耐受5天，具有良好的穩(wěn)定性。特異性佳：用甲基苯丙胺單克隆抗體免疫檢測板檢測共60種毒品或藥品，結果僅甲基苯丙胺和MDMA為陽性，其它均為陰性。綜上所述，本發(fā)明的膠體金標記甲基苯丙胺單抗免疫檢測板與HPLC等色譜方法相比，本發(fā)明的檢測板簡單、輕便，易于攜帶，可以現場檢測，而且不需要昂貴的設備。使用本發(fā)明的檢測板檢測甲基苯丙胺，整個測試可在3-5min鐘內完成，檢測的靈敏度可達250-300ng,與60種常見藥物、毒品(尤其是麻黃堿或偽麻黃堿)沒有交叉反應。檢測方法與結果判定：平放檢測板，將試樣滴在濾樣紙上，適量試樣(通常約120μ1),3~5min內觀察層析結果。根據出現的條紋位置來判斷結果，示意圖見圖9。陰性：質控區(qū)、檢測區(qū)均出現明顯的色帶，示為陰性；陽性：只在質控區(qū)出現明顯色帶，而在檢測區(qū)無色帶，示為陽性；無效：質控區(qū)、檢測區(qū)無任何色帶或在質控區(qū)未出現色帶而在檢測區(qū)出現色帶，表明檢測方法錯誤或檢測板變質或失效，應重新?lián)Q取檢測板檢測。如果檢測線較淺于質控線說明被測者吸食過此毒品但已代謝到末尾或用量較小，所以質控線也是檢測板判別吸毒狀況的標準。吸毒閾值設定用本發(fā)明的膠體金標記后的甲基苯丙胺單克隆抗體和完全抗原制備的檢測板，甲基苯丙胺的最低檢測量可達到250-300ng/mL。考慮到某些正常使用的藥物中也含有甲基苯丙胺成分，實際工作中為避免假陽性的出現，參照國際通行的濃度值，設定檢測板的閾值以1000ng/mL為好。 調節(jié)試劑條上預包被的膠體金標記的MA-CH1單抗溶液、完全抗原的量，使得檢測板對甲基苯丙胺的最低檢測量為1000ng/ml。當尿液中的甲基苯丙胺濃度<1000ng/ml,膠體金標記抗甲基苯丙胺單抗通過層析作用，向上移動，與固相于硝酸纖維素膜上的完全抗原相結合，形成色帶，測試結果呈陰性；當尿液中的甲基苯丙胺濃度>1000ng/ml,膠體金標記的抗甲基苯丙胺單抗完全與尿液中的甲基苯丙胺相結合，不能與固相于硝酸纖維素膜上檢測區(qū)的完全抗原相結合，檢測區(qū)不能形成色帶，測試結果呈陽性。與現有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：(1)本發(fā)明的完全抗原具有高免疫原性，且保留了甲基苯丙胺的免疫反應性；(2)本發(fā)明的抗甲基苯丙胺單克隆抗體MA-CH1的特異性優(yōu)異且效價高；(3)本發(fā)明的膠體金標記甲基苯丙胺單抗免疫檢測板具有靈敏度高、特異性強、簡便快捷，可進行現場檢測等優(yōu)點，為打擊毒品犯罪提供了有力的武器。實施例下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?NewYork:ColdSpringHarborLabo的條件。實施例1甲基苯丙胺的活化及半抗原的制備在反應瓶中加入甲基苯丙胺原料0.52g和10mL濃硫酸，攪拌使之溶解，置于冰鹽浴中冷卻至-5℃,在1小時內分4次加入由濃硝酸(0.25mL)和濃硫酸(0.75mL)1:3組成的混合酸液。加完后，0℃條件下反應2小時，然后倒入10g碎冰中，待碎冰融化后，再在0℃條件下反應半小時，當有白色固體析出時，抽濾得白色固體物0.62g(粗品，不必純化即可直接用于下一步反應),反應得率：53%,反應產物經MNR分析為目標物。濃鹽酸，逐漸升溫，30-40℃時開始加入鋅粉(分4批)共0.62g,直至50-60℃,加完后，在此溫度下反應2小時，過濾，濾液用20%NaOH溶液中和至偏堿性(pH=8),抽濾，濾出白色固體(為氫氧化鋅)并用溫水洗滌，濾液合并用二氯甲烷提取(30ml*3 次),二氯甲烷層用飽和食鹽水洗至中性，無水硫酸鈉干燥，溶劑抽干，得半固體狀黃色物質，用硅膠柱層析(展開劑比例乙酸乙酯：石油醚=1:2),得淺黃色固體lHNMR(DMSO)δ6.38～6.95(m,4H,ArH)3.44(m,1H,-CH-)2.44~2.63(m,2H,-CH2)2.41(s,2H,-NH2)2.31(d,3H,-NCH3)實施例2甲基苯丙胺-血藍蛋白(KLH)以及甲基苯丙胺-牛血清白蛋白(BSA)完全抗原的制備將對氨基-甲基苯丙胺(p-NH2-Methamphtamine)與血藍蛋白(KLH)或牛血清白蛋白(BSA)在EDC的作用下進行偶聯(lián)。稱取100mg對氨基一甲基苯丙胺，在攪拌下溶解于10ml雙蒸水中，然后緩慢加入400mg的EDC,邊加邊搖，用0.1M鹽酸將pH值調節(jié)至4.5,在室溫下(20～25℃)繼續(xù)反應10分鐘。取100mg血藍蛋白(KLH)或牛血清白蛋白(BSA)溶于5ml雙蒸水中，加入到對氨基一甲基苯丙胺溶液中，室溫下(20～25℃)繼續(xù)反應2-4小時。反應產物對0.01M磷酸鹽緩沖液4℃進行透析。除去未反應的對氨基一甲基苯丙胺和EDC,更換緩沖液3～4次。獲得的反應產物即為甲基苯丙胺-KLH或甲基苯丙胺-BSA完全抗原。實施例3甲基苯丙胺單克隆抗體MA-KLH-CH1的制備及性質測定3.1Balb/C小鼠免疫操作3.1.1試劑配制先將抗原與CPG佐劑乳化，把完全抗原甲基苯丙胺-KLH用PBS配制成1mg/mL的溶液，然后將完全抗原溶液與CPG佐劑等體積混合，用高速震蕩器震蕩形成均勻乳濁液，將此乳濁液用于動物的免疫。3.1.2小鼠免疫選擇8周齡的小鼠進行注射免疫。取8周齡的健康Balb/C小鼠12只，在第0天，每只腹腔注射CPG佐劑乳化抗原100uL。第14天，每只小鼠腹腔再注射CPG佐劑乳化抗原100uL。第21天，以摘小鼠眼球法采血，用ELISA方法檢測血清中抗體效價(滴度)。第28天，再次腹腔注射CPG佐劑加甲基苯丙胺抗原100uL。在細胞融合反應前一周，用100ug/100uL抗原生理鹽水再次加強免疫。采血后經測定，所得抗血清效價在1:16000。3.2細胞融合操作3.2.1HAT培養(yǎng)基貯存液的制備3.2.1.110mM次黃嘌呤-16mM胸腺嘧啶核苷(100×HT)貯存液：稱取次黃嘌呤136.1mg和胸腺嘧啶核苷38.8mg,溶于100mL50～60℃的雙蒸水中；微孔濾膜過濾后按需要量分裝，—20℃保存。雙蒸水，滴加1NNaOH至氨基喋呤溶解。然后用1NHCl調節(jié)pH=7.5;用雙蒸水定容至100mL;過濾滅菌；分裝并避光于-20℃保存。3.2.2.1完全培養(yǎng)基：DMEM(改良的Eagle's培養(yǎng)基)或RPMI-1640培養(yǎng)基450mL;100mM丙酮酸鈉5mL;青-鏈霉素溶液(青霉素500IU/ml,鏈霉素5mg/mL)5mL;200mML谷氨酰胺5mL;滅活的胎牛血清50mL,4℃保存。3.2.2.2HT培養(yǎng)基的制備：每100mL完全培養(yǎng)基中，加入1mL100×HT貯存液即成。3.2.2.3HAT培養(yǎng)基的制備：每100mL完全培養(yǎng)基中各加入1mLHT貯存液3.2.350%(w/v)PEG的配制將固體PEG(MW1500或4000)高壓滅菌，PEG即融化，冷卻至50℃(在此溫度下仍為液體)。加入等體積無血清的DMEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。-20℃貯存。3.2.4細胞懸液的制備3.2.4.1小鼠脾細胞：將免疫好的小鼠引頸處死，70%酒精消毒皮膚后，無菌條件取出脾臟，移到盛有5ml無血清RPMI-1640的培養(yǎng)皿中。將脾臟無菌研磨成單細胞懸液，將細胞吸至一無菌管中，靜置使組織塊沉降。將無團塊的脾細胞懸液吸入另一試管，800rpm/min離心5min。用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌細胞2次。用Tris-NH?CI裂解紅細胞。計算每mL懸液中的有核細胞數。每只小鼠的脾臟可得108淋巴細胞。3.2.4.2小鼠腹腔巨噬細胞：處死小鼠，消毒皮膚，向腹腔內注入DMEM完全培養(yǎng)基2-3mL,輕壓腹部使細胞混懸。提起腹膜中心，插入注射器針頭，吸出全部細胞懸液。3000rpm/min離心5min,用DMEM洗滌2次，再離心后計數。一只小鼠可獲得3×10?個細胞。用加有10%胎牛血清和抗生素的培養(yǎng)基制成10?/mL的細胞懸液。3.3融合步驟200910135015.8說明書第15/23頁將融合用器材全部滅菌，將胎牛血清、HT和A貯存液化凍，連同其它培養(yǎng)基成分和PEG溶液置于37℃水浴中預熱。選擇處于對數生長期的SP2/0小鼠骨髓瘤細胞進行融合。計數(密度范圍應將用RPMI-1640洗滌過的小鼠脾細胞和骨髓瘤細胞按5:1的比例混合，用管使細胞沉淀松散，1min內邊搖蕩邊逐滴加入1.5mL的50%PEG4000溶液。用吸管將細胞懸液小心地混勻，隨后靜置1min。然后，在2min內，邊輕搖試管邊緩慢滴加10mL無血清RPMI-1640培養(yǎng)基。靜置放置約3min,800rpm/min離心10min,棄上清液。用含HAT和20%胎牛血清的RPMI1640將細胞配成100mL懸液，將細胞均勻鋪10塊96孔培養(yǎng)板(預先加入腹腔巨噬細胞作飼養(yǎng)層),將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。3.4融合細胞的選擇性培養(yǎng)細胞融合操作2～3天后檢查細胞融合情況，此時未融合細胞大量死亡，唯有融合細胞才能成活。7～10天后加HT+完全培養(yǎng)基，每孔加入1mL。在8～14天間，就可以看到雜交細胞的克隆。當克隆約長到1mm直徑時，即可檢查孔中培養(yǎng)基的抗體含量。從培養(yǎng)孔取出1mL測定抗體，用甲基苯丙胺-BSA包被的酶聯(lián)板(ELISA法)來篩選出抗甲基苯丙胺的雜交瘤細胞。將選出的陽性孔中的細胞移至24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，并進行排除交叉免疫反應的檢測工作，以進一步篩選陽性克隆。3.5雜交瘤克隆化(有限稀釋法)于克隆前1天向96孔培養(yǎng)板中加入巨噬細胞飼養(yǎng)層，每孔加入0.1ml,CO?培養(yǎng)箱中溫育。從陽性培養(yǎng)孔中吸取欲克隆的細胞，計數一次克隆化約需1000個細胞。多余的細胞放回24孔板中。用完全培養(yǎng)基稀釋細胞成30個/mL,加入兩塊96孔板中，每孔加0.1mL(孔內已預加飼養(yǎng)層),將剩下的細胞再度稀釋200910135015.8說明書第16/23頁將培養(yǎng)板置37℃CO?培養(yǎng)箱中培育，2—3周可出現可見單細胞集落形成。繼續(xù)培養(yǎng)，待培養(yǎng)板孔內液體顏色變?yōu)槌壬?。檢測上清液的抗體活性，選出陽性孔，再進行擴大培養(yǎng)和再克隆。吸取孔中液體，再以甲基苯丙胺-BSA包被的ELISA法酶標板來篩選出抗甲基苯丙胺的特異性雜交瘤細胞。經五次克隆后，得到一株能分泌專一性抗體的抗甲基苯丙胺單克隆細胞，命名為MA一KLH—CH1(即CCTCCNO.C200914),用于制備膠體金標記甲基苯丙胺單抗免疫試劑盒。3.6雜交瘤擴大培養(yǎng)當需要大量抗體時，采用Balb/C小鼠腹水生產單克隆抗體蛋白。將約10?—10?個雜交瘤細胞接種到致敏的小鼠腹腔內。2-4周內可見腹部明顯脹大。抽取腹水離心，加0.02%的疊氮鈉，4℃或-20℃冰箱保存。3.7抗體的純化(Sepharose-G蛋白親和層析法)取1gCL-4BSepharose-蛋白G,懸浮于200mL的磷酸緩沖溶液(pH=8.0)中，至少吸脹30min。取約4mL裝柱，先后用pH=8.0的磷酸緩沖液100mL和pH=3的0.1M檸檬酸鈉100mL洗柱，然后用前一種緩沖液重新平衡。腹水或培養(yǎng)上清液對pH=8的磷酸緩沖液透析(先用飽和硫酸胺沉淀后，再透析效果更好)每mL膠可與20-25mg的IgG結合，控制過柱流速為0.5—1ml/min。用5mL的10mM磷酸緩沖液(pH=8)洗柱，監(jiān)測流出液的A280nm,按0.5ml級分收集流出液。開始幾管應該是沒有蛋白的，如果是強陽性，抗體就沒有與蛋白A結合；如果是弱陽性，可能是上樣過多了。再用上述緩沖液(不少于5mL)洗柱，大多數IgA、IgM、IgG3將在這一級分內流出。用5mL的0.1M檸檬酸鈉(pH=6)洗脫IgG1抗體。用5mL的0.1M檸檬酸鈉緩沖液(pH=4.5)洗脫IgG2a。用pH=3.5的同類緩沖液洗脫IgG2b。3.8抗體的測定通過CFSE綠色熒光預標記淋巴細胞和抗小鼠B220PE標記的單克隆抗體預標記SP2/0細胞后融合，并經流式細胞儀測定分析雙熒光細胞比例測定，本實驗體系中脾細胞和SP2/0的最初融合效率約為35%。ELISA法測定陽性率為3.9抗甲基苯丙胺單克隆抗體MA-CH1的鑒定200910135015.8說明書第17/23頁3.9.1抗體的純化及型別測定將腹水先經飽和硫酸銨沉淀法粗提出IgG,再將粗提的抗體經親和層析柱3.9.2抗體經特異性抗體分型試劑盒實施例4甲基苯丙胺單克隆抗體MA-BSA-CH1的制備制備方法同實施例3,所不同是采用了BSA作為載體蛋白。經檢測所得MA-BSA-CH1能與甲基苯丙胺特異性結合。實施例5抗體的效價測定抗血清的滴度測定將甲基苯丙胺-BSA包被的酶聯(lián)板用于測定此抗血清的滴度，包被抗原10ug/ml稀釋于pH9.6的0.05M碳酸鹽緩沖液中，100ul/孔加入到96-孔酶標板于PBS-Tween-20洗液洗板3遍，再加入稀釋后的甲基苯丙胺抗血清或單抗辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG多抗，37℃孵育1小時后用PBS-Tween-20洗液洗板3遍，加TMB/H?O?底物進行顯色10min,并用終止液(0.1N硫酸)終止顯色。在450nm光波長下測定吸收值(OD),與空白對照孔的OD均值比較，采用計量資料的t檢驗，取P<0.05的最低稀釋度作為此抗體的效價。經比色測定，所得甲基苯丙胺抗血清的效價為1:16000(見圖4)。甲基苯丙胺單克隆抗體滴度的測定按照上述方法測定抗體的滴度，MA-CH1單抗的效價為1:8000(見圖5)。實施例6單克隆抗體特異性的測定甲基苯丙胺單克隆抗體MA-BSA-CH1與BSA交叉反應的測定由于在制備膠體金快速試劑盒的過程中，所用的完全抗原是甲基苯丙胺-BSA,因此，如果單克隆抗體與BSA有交叉反應，將會導致嚴重的假陰性結果。所以，要確定甲基苯丙胺單克隆抗體MA-CH1與BSA沒有任何的交叉反應。分別用完全抗原甲基苯丙胺-BSA和BSA包被酶標板，以1:2000稀釋的甲基苯丙胺單克隆抗體MA-CH1與之結合，進行酶聯(lián)反應檢測，結果顯示甲基苯丙胺單克隆抗體MA-CH1可以檢測到50ng的甲基苯丙胺-BSA,而且與BSA沒有任何交叉200910135015.8說明書第18/23頁單克隆抗體與選用的60種毒品和藥品的交叉反應選用了如下60種毒品或藥品與單克隆抗體MA-KLH-CH1進行反應：甲基苯丙胺，麻黃堿、偽麻黃堿、苯丙胺，MDMA,MDA,嗎啡，可待因，海洛因，福爾可定，二氫埃托菲，雷米替丁、哌替啶，芬太尼，曲馬多，右丙氧芬，納洛酮，納曲酮，烯丙嗎啡，可樂寧，洛非西丁，東莨菪堿，益安口服液，正通寧片，撲熱息痛，阿斯匹林，布洛芬，阿米替林，丙米嗪，氯丙嗪，異丙嗪，水合氯醛，安定，三唑侖，阿普唑侖，巴比妥，速可眠，異戊巴氟哌酸，先鋒IV,黃連素，乳糖，普魯卡因，康復新膠囊，水合氯醛，奧復沙利多卡因，那可丁，丁丙諾啡，苯丙醇胺和苯乙胺。用上述60種檢測物質包被的酶標板與MA-KLH-CH1抗體反應進行ELISA測定，結果確定此抗體僅與甲基苯丙胺和MDMA發(fā)生免疫結合反應，而與上述其它毒品或藥品沒有交叉反應。實施例7膠體金標記甲基苯丙胺單克隆抗體免疫試劑盒的制備7.1膠體金(GoldColloidal)標記抗甲基苯丙胺的單抗氯金酸溶液，90℃保溫2min,加入7.5mL的1%檸檬酸三鈉水溶液，繼續(xù)煮沸5min,冷卻至室溫后，采用分光光度計檢測顆粒均勻度及粒度大小，最大吸收峰在521nm,膠體金大小為30nm左右。取上述膠體金100mL,緩慢滴加10mL的BB(硼酸緩沖液),滴加完畢后在加入2mL的10%的牛血清蛋白，再攪拌15min后，用高速離心機分別將其在12000rpm/min,4℃下離心30min,吸去上清液，用含少量穩(wěn)定劑的BB緩沖液懸浮沉淀汲取保存。也可用蛋白濃縮儀洗去多余抗體并將其體積濃縮。7.2膠體金一單抗結合物玻璃纖維條制備用含有表面活性劑和穩(wěn)定劑的緩沖液將膠體金-單抗結合物稀釋至一定濃度后，均勻地涂在玻璃纖維素紙上，真空干燥。7.3檢測線和質控線配制0.5～1mg/mL濃度的甲基苯丙胺-BSA完全抗原和0.8～1.2mg/mL濃度的羊抗鼠IgG多抗，同時噴上在硝酸纖維膜上分別為檢測線和質控線，并至室 溫干燥。7.4測試條組裝將吸水紙放在貼板的下方凹槽中，然后將一段膜放在其上方。將膠板另一側的紙片撕開，依著貼板尺的邊緣將膠體金紙條貼在膜的上面，再將濾樣紙覆蓋在膠體金紙條上。將“MAX”箭頭膠帶貼在膠體金紙條與膜的結合部位，將膠體金紙條完全蓋住、壓緊，再將覆蓋膠帶貼在吸水紙一側，將吸水紙與膜的結合部完全蓋住、壓緊，將多余的覆蓋膠帶用刀劃去。用切刀切裁相應規(guī)格的試紙條，將試紙條裝入塑料卡中并用鋁箔袋封裝。試劑盒中試條組成示意圖(見圖7)。7.5試劑盒的組成本品系由完全抗原和SPA或羊抗鼠IgG分別固化在硝酸纖維素膜上，層析材料(載體)預包被膠體金標記抗甲基苯丙胺單抗，分別與濾樣紙、吸水紙、膠帶等材料貼在PVC聚脂膠板上，共同組裝成甲基苯丙胺免疫試劑盒，(見圖8)。7.6檢測原理與過程本試劑盒應用免疫競爭法原理，即尿液中的甲基苯丙胺與固相于硝酸纖維膜上的甲基苯丙胺競爭結合膠體金標記的抗甲基苯丙胺單抗，通過觀察窗檢測區(qū)有無色帶來判別測定結果。7.6.2.1在硝酸纖維膜的檢測區(qū)和質控區(qū)分別包被完全抗原和羊抗鼠IgG多抗，在層析載體玻璃纖維上包被膠體金標記的抗甲基苯丙胺單抗。當尿液中的甲基苯丙胺濃度<1000ng/mL,膠體金標記抗甲基苯丙胺單抗通過層析作用，向上移動，與固相于硝酸纖維素膜上的完全抗原相結合，形成兩條色帶，此時檢測結果為陰性。當尿液中的甲基苯丙胺濃度>1000ng/mL,膠體金標記的抗甲基苯丙胺單抗完全與尿液中的甲基苯丙胺相結合，不能與固相于硝酸纖維素膜上檢測區(qū)的完全抗原相結合，檢測區(qū)不能形成色帶，此時檢測結果為陽性。7.6.2.2無論尿液中是否含有甲基苯丙胺，膠體金標記的甲基苯丙胺單抗總能與固相于硝酸纖維素膜上的羊抗鼠IgG多抗結合形成一條有色質控帶，該條色帶是判定尿樣是否陽性和陰性、層析過程是否正常和試劑盒是否變質的標準。7.6.2.3如果檢測線較淺于質控線說明被測者吸食過此毒品但已代謝到末尾或用量較小，所以檢測線也是試劑盒判別吸毒狀況的標準。實施例8膠體金標記甲基苯丙胺單抗免疫試劑盒的靈敏度測試試劑配制根據測試要求，在空白尿樣中添加甲基苯丙胺，分別配制成含甲基苯丙胺系列試樣。檢測與結果將上述系列濃度作定量梯度點樣，實施例7試劑盒的靈敏度試驗結果(見表表1靈敏度試驗結果點樣量ng/mL12345一一一一一一一一點樣量ng/mL一一一十十十十十注：“+”表示陽性；“-”表示陰性。試驗結果表明，進行膠體金標記后的甲基苯丙胺單克隆抗體最低檢測量為300.00ng/mL,考慮到某些正常使用的藥物中也含有甲基苯丙胺成分，實際工作中為避免假陽性的出現，參照國際通行的濃度值將甲基苯丙胺的最低檢測量確定為1000.00ng/mL。實施例9膠體金標記甲基苯丙胺單抗免疫試劑盒的穩(wěn)定性實驗將實施例7的膠體金標記的甲基苯丙