(19)中華人民共和國國家知識產(chǎn)權局(10)授權公告號CN104777243B(21)申請?zhí)?01510052217.1(22)申請日2015.01.29(65)同一申請的已公布的文獻號(43)申請公布日2015.07.15(73)專利權人重慶醫(yī)科大學地址400016重慶市渝中區(qū)醫(yī)學院路1號(72)發(fā)明人趙華張嚴方張景就雷婷婷審查員潘迪(54)發(fā)明名稱一種同時測定半夏中有機酸、核苷和麻黃堿的HPLC方法(57)摘要本發(fā)明屬于中藥成分分析測定技術領域，涉及一種HPLC法同時測定半夏藥材和制劑中六種有機酸、三種核苷和麻黃堿含量的方法。本發(fā)明150mm,5μm)色譜柱，流動相為磷酸緩沖液-甲醇適用濃度范圍內(nèi)線性關系良好。該方法準確、快21.一種同時測定半夏中有機酸、核苷和麻黃堿的HPLC方法，其特征在于采用高效液相色譜法同時測定六種有機酸、三種核苷和麻黃堿的含量，六種有機酸分別是草酸，甲酸，蘋果酸，乙酸，檸檬酸和琥珀酸；三種核苷分別是尿苷，腺苷和鳥苷，該高效液相色譜法的色譜條件為：BostonGreenODS色譜柱，流動相為pH2.3的磷酸緩沖液和甲醇溶液，采用0-5min,甲醇2%;5-15min,甲醇2%→20%;15-20min,甲醇20%的方法進行梯度洗脫，流速1mL/min,進樣量20μL,柱溫30℃,檢測波長210nm。3一種同時測定半夏中有機酸、核苷和麻黃堿的HPLC方法[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥領域，涉及半夏藥材和制劑中同時測定六種有機酸、三種核苷和背景技術[0002]半夏為天南星科植物半夏Pineliatemate(thumb.)Breit.的干燥塊莖，具有燥濕[0003]半夏含有多種化學成分，主要包括有機酸類、核苷類、生物堿類等。其中總游離有機酸具有止咳、祛痰、抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡等作用，2010年版中國藥典以半夏中總游離有機酸的含量作為評價半夏質(zhì)量的指標，其中所含有機酸主要有草酸、甲酸、乙酸、蘋果酸、檸檬酸和琥珀酸等。半夏中所含的核苷類也是其中藥及制劑的重要有效成分，并把其作為復方中半夏的水溶性指標成分進行檢測，作為判別半夏藥材及制劑質(zhì)量優(yōu)劣的重要依據(jù)，含量較高的有尿苷、鳥苷和腺苷等。麻黃堿是半夏含有的總生物堿中主要成有效成分的含量測定及質(zhì)量控制等研究較少，藥典對半夏的鑒別除了顯微鑒別外，僅檢查取電位滴定法對醇提取物中有機總酸進行測定，且所含總酸僅以琥珀酸計，這對于半夏的質(zhì)量控制是遠遠不足的。由于半夏所含有效成分較多，且針對不同疾病所需要的有效成分不同，故本發(fā)明采用HPLC法同時測定半夏藥材及飲片中的六種有機酸、三種核苷和麻黃堿的含量，較電位滴定法具有更高靈敏度、高效能和高專屬性，且可為控制半夏藥材及飲片質(zhì)量提供重要的參考依據(jù)。[0005]目前將這六種有機酸，三種核苷和麻黃堿同時進行檢測定量的未見文獻報道。發(fā)明內(nèi)容[0006]本發(fā)明采用高效液相色譜法(HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC)對半夏提取物中的六種有機酸、三種核苷和麻黃堿成分同時進行測定。本發(fā)明所述的同時測定半夏提取物中六種有機酸、三種核苷和麻黃堿成分的HPLC方法高效、快速，重復性和精密度良好，且樣品前處理簡便、操作快速，可為半[0007]本發(fā)明所提供的技術方案可以是：[0008]采用高效液相色譜法進行測定，該高效液相色譜法的色譜條件如下：BostonGreenODS(4.6mm×150mm,5μm)色譜柱磷酸調(diào)pH為2.3)-甲醇溶液，梯度洗脫(0-5min,甲醇2%;5-15min,甲醇2%→20%;15-20min,甲醇20%),流速1mL/min,進樣量20μL,柱溫30℃,檢測波長210nm。所述方法包括標4μg·mL?1,178μg·mL?1,12μg·mL?1,11μg·mL?1,14μg·mL?1,3μg·mL?1。分別精密吸取0.1ml[0010]標準曲線制作：精密吸取混合標準品溶液0.1mL,0.5mL,1mL,2mL,4mL于10mL容量的回歸方程為：y=1111.3x-81.483(0.9996);乙酸的回歸方程為：y=765.01x-1663.6(r=0.9999);檸檬酸的回歸方程為：y=1143.9x+3644.4(r=0.9999);琥珀酸的回歸方程為：y=703.=0.9999);鳥苷的回歸方程為：y=43746x-7200.1(r=0.9999);麻黃堿的回歸方程為：y=69378x-4330.1(r=0.9995)。結(jié)果表明，草酸濃度在3～75μg·mL?1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系；甲酸濃度在11～181μg·mL?1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系；蘋果酸濃度在9～189μg·mL?1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系；乙酸與峰面積呈良好的線性關系；檸檬酸濃度在8～142μg·mL?1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系；琥珀酸濃度在5～71μg·mL?1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系；尿苷濃度在0.3～12μg·mL?1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系；腺苷濃度在0.5～11μg·mL?1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系；鳥苷濃度在0.7～14μg·mL?1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系；麻黃堿濃度在0.09～3μg·mL?1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系。[0011]樣品處理(以半夏藥材為例):稱取半夏藥材粉末2g,用40mL超純水超聲提取2次，每次2h,提取液用砂芯布什漏斗過濾，用超純水定容至100mL,0.22μm微孔濾膜濾過取續(xù)濾液即得供試品溶液。[0012]樣品含量測定：取供試品溶液，按上述的色譜條件測定，用外標法以峰面積計算，(mg/g)、0.55(mg/g)、0.018(mg/g)、0.007(mg/g),RSD分別為1.16%、2.73%、1.52%、2.08%、1.03%、3.11%、2.31%、1.41%、2.38%和1.08%。[0013]本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有以下優(yōu)點和效果：[0014]1、本發(fā)明首次應用高效液相色譜紫外檢測法，同時測定半夏中六種有機酸(草酸、[0015]2、本發(fā)明操作簡便，分離快速，在較大的線性范圍內(nèi)十種物質(zhì)標準曲線方程的R值均大于0.9995,表明線性關系較好。堿成分進行同時測定，為半夏藥材和制劑的質(zhì)量控制提供重要的參考依據(jù)。附圖說明5[0017]圖1為本發(fā)明實施例中六中有機酸、三種核苷和麻黃堿標準物質(zhì)的色譜圖。該色譜11麻黃堿。[0018]圖2為本發(fā)明實施例中六中有機酸、三種核苷和麻黃堿的樣品色譜圖。具體實施方式[0019]為了進一步說明本發(fā)明及其優(yōu)點，給出了下列特定的實施例，應理解這些實施例僅用于具體說明而不是作為本發(fā)明范圍的限制。μg·mL?1,178μg·mL?1,12μg·mL?1,11μg·mL?1,14μg·mL?1,3μg·mL?1。分別精密吸取0.1ml[0022]標準曲線制作：精密吸取混合標準品溶液0.1mL,0.5mL,1mL,2mL,4mL于10mL容量0.9996);乙酸的回歸方程為：y=765.01x-1663.6(r=0.9999);檸檬酸的回歸方程為：y=1143.9x+3644.4(r=0.9999);琥=0.9999);鳥苷的回歸方程為：y=43746x-7200.1(r=0.9999);麻黃堿的回歸方程為：y=69378x-4330.1(r=0.9995)。結(jié)果表明，草酸濃度在3～75μg·mL?1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系；甲酸濃度在11～181μg·mL?1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系；蘋果酸濃度在9～189μg·mL?1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系；乙酸濃度在18～373μg·mL?1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系；檸檬酸濃度在8～142μg·mL?1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系；琥珀酸濃度在5～71μg·mL?1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系；尿苷濃度在0.3～12μg·mL?1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系；腺苷濃度在0.5～11μg·mL?1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系；鳥苷濃度在0.7～14μg·mL?1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系；麻黃堿濃度在0.09～3μg·mL?1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關0.96%、2.53%、2.61%、0.88%、1.02%、1.38%、1.19%和2.49%。符合精密度實驗要求。[0024]穩(wěn)定性考察：取混合對照品溶液，室溫下放置0,2,4,8,12,24,48小時，按以上色譜珀酸、尿苷、腺苷、鳥苷和麻黃堿的RSD分別為3.49%、1.18%、1.78%、1.25%、2.29%、3.91%、0.78%、1.17%、1.98%、1.61%,表明溶液在48小時內(nèi)基本穩(wěn)定。[0025]重復性考察：按供試品配制方法平行配制6份，按以上色譜方法進樣分析，按外標6的平均含量分別為3.04(mg/g)、8.74(mg/g)、10.57(mg/g)、15.90(mg/g)、1.95(mg/g)、0.21(mg/g)、0.55(mg/g)、0.018(mg/g)、0.007(mg/g),RSD分別為1.16%、2.73%、1.52%、2.08%、1.03%、3.11%、2.31%、1.41%、2.38%和1.08%。[0026]加樣回收率考察：精密量取已測知含量的半夏提取物各5ml,共30份，置10mL量瓶黃堿含量的80%、100%和120%的對照儲備液，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，按酸、尿苷、腺苷、鳥苷和麻黃堿的平均回收率分別為94.10%、91.72%、96.93%、101.11%、93.35%、94.72%、94.17%、100.29%、96.31%和98.57%,RSD分別為2.38%、1.72%、0.72%、1.61%、0.83%、1.88%、0.84%、2.84%、1.79%和1.14%。[0027]供試品溶液的制備：稱取貴州威寧半夏藥材粉末2g,用40mL超純水超聲提取2次，每次2h,提取液用砂芯布什漏斗過濾，用超純水定容至100mL,0.22μm微孔濾膜濾過取續(xù)濾液即得供試品溶液。[0028]半夏藥材中六種有機酸、三種核苷類和麻黃堿成分的含量測定：取供試品溶液，按上述的色譜條件(BostonGreenODS(4.6mm×150mm,5μm)色譜柱，流動相為流動相為磷酸緩沖液(0.