微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)公開(kāi)課1目錄微生物實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基礎(chǔ)細(xì)菌培養(yǎng)方法與技巧真菌培養(yǎng)方法與技巧病毒培養(yǎng)方法與技巧微生物實(shí)驗(yàn)室安全與管理微生物實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)應(yīng)用案例201微生物實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基礎(chǔ)Chapter3微生物是一類形體微小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、必須借助光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才能看到的微小生物的總稱。微生物定義微生物分類微生物特點(diǎn)微生物包括細(xì)菌、病毒、真菌以及一些小型的原生生物、顯微藻類等在內(nèi)的一大類生物群體。微生物具有體積小、面積大、吸收多、轉(zhuǎn)化快、生長(zhǎng)旺、繁殖快、適應(yīng)強(qiáng)、易變異等八大特點(diǎn)。030201微生物概述與分類4用于準(zhǔn)確移取液體，保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。提供適宜的溫度和濕度環(huán)境，用于培養(yǎng)微生物。用于觀察微生物的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，是微生物學(xué)研究中必不可少的工具。用于對(duì)培養(yǎng)基、玻璃器皿等進(jìn)行滅菌處理。培養(yǎng)箱顯微鏡高壓蒸汽滅菌器移液器及吸頭實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備介紹5

培養(yǎng)基類型及選擇培養(yǎng)基定義培養(yǎng)基是供微生物生長(zhǎng)、繁殖和合成各種代謝產(chǎn)物所用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的混合物。培養(yǎng)基類型根據(jù)物理性質(zhì)可分為液體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基；根據(jù)化學(xué)成分可分為天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。培養(yǎng)基選擇選擇培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)考慮微生物的營(yíng)養(yǎng)需求、生長(zhǎng)條件以及實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡纫蛩亍?無(wú)菌操作技術(shù)要點(diǎn)無(wú)菌操作是指在無(wú)菌條件下進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)操作，目的是防止微生物污染實(shí)驗(yàn)材料和結(jié)果。無(wú)菌操作定義包括無(wú)菌室的準(zhǔn)備、無(wú)菌器材的準(zhǔn)備、無(wú)菌操作的基本步驟以及注意事項(xiàng)等。例如，實(shí)驗(yàn)前需對(duì)無(wú)菌室進(jìn)行清潔和消毒，確保無(wú)菌環(huán)境；實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)范，如穿戴無(wú)菌衣帽、戴口罩和手套等；實(shí)驗(yàn)后需對(duì)實(shí)驗(yàn)器材進(jìn)行清洗和滅菌處理，防止交叉污染。無(wú)菌操作技術(shù)要點(diǎn)702細(xì)菌培養(yǎng)方法與技巧Chapter8平板劃線法通過(guò)接種環(huán)在固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基表面。穿刺接種法多用于雙糖、半固體、明膠等培養(yǎng)基的接種，方法與斜面接種類似。澆混接種法先將待接的微生物進(jìn)行液體培養(yǎng)，待培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用無(wú)菌水將該微生物進(jìn)行適當(dāng)稀釋，之后選擇澆入或倒入的方法將待接微生物倒入平板培養(yǎng)基，并充分搖勻。斜面接種法主要用于移種純菌，使其增殖后用于鑒定或保存菌種。細(xì)菌接種技術(shù)9延遲期細(xì)菌接入新的培養(yǎng)基后，對(duì)新環(huán)境有一個(gè)短暫的適應(yīng)過(guò)程。此期細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，不分裂繁殖。對(duì)數(shù)期又稱指數(shù)期，此期細(xì)菌以幾何級(jí)數(shù)增加，增長(zhǎng)極快。穩(wěn)定期由于培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗、毒性產(chǎn)物的積累、pH下降等不利因素的影響，細(xì)菌繁殖速度漸趨下降，相對(duì)細(xì)菌死亡數(shù)開(kāi)始逐漸增加，此期細(xì)菌增殖數(shù)與死亡數(shù)漸趨平衡。衰亡期穩(wěn)定期后，細(xì)菌繁殖越來(lái)越慢，死亡菌數(shù)明顯增多。細(xì)菌生長(zhǎng)曲線解讀10包括平板菌落計(jì)數(shù)法和濾膜法，常用于測(cè)定樣品中的活菌總數(shù)?？偩鷶?shù)計(jì)數(shù)法利用特定的細(xì)菌計(jì)數(shù)板或血量計(jì)在顯微鏡下計(jì)算一定容積的樣品中細(xì)菌數(shù)量。直接計(jì)數(shù)法根據(jù)菌懸液的透光量間接地測(cè)定細(xì)菌的數(shù)量。比濁法細(xì)菌計(jì)數(shù)方法11冷凍干燥保存法將菌種冷凍后通過(guò)真空干燥去除水分，然后密封保存在真空環(huán)境中。此方法結(jié)合了冷凍和干燥兩種方法的優(yōu)點(diǎn)，可長(zhǎng)期保存菌種并保持其活性。常規(guī)保存法定期移植法、液體石蠟法、砂土管法等，適用于一般細(xì)菌的保存。冷凍保存法將菌種保存在低溫條件下，使其新陳代謝活動(dòng)降低或停止，從而延長(zhǎng)菌種保藏時(shí)間。包括低溫冰箱保存法、干冰保存法和液氮超低溫保存法等。真空干燥保存法將菌種真空干燥后密封保存在真空環(huán)境中，可長(zhǎng)期保存菌種。細(xì)菌保存與復(fù)蘇策略1203真菌培養(yǎng)方法與技巧Chapter13將真菌孢子或菌絲片段直接撒在培養(yǎng)基表面，適用于觀察菌落形態(tài)和生長(zhǎng)速度。表面接種法用接種針挑取少量菌絲，穿刺培養(yǎng)基，適用于分離純化菌種和保藏菌種。穿刺接種法將待接種的液體培養(yǎng)基傾注到固體培養(yǎng)基上，形成一層菌膜，適用于大量培養(yǎng)真菌。傾注接種法真菌接種技術(shù)14真菌生長(zhǎng)條件及觀察溫度不同真菌對(duì)溫度的要求不同，一般分為低溫、中溫和高溫真菌。培養(yǎng)時(shí)需根據(jù)真菌的生長(zhǎng)溫度范圍選擇合適的培養(yǎng)溫度。濕度真菌生長(zhǎng)需要一定的濕度，過(guò)干或過(guò)濕都會(huì)影響其生長(zhǎng)。一般需保持培養(yǎng)基表面濕潤(rùn)，避免干燥。光照部分真菌生長(zhǎng)需要光照，如霉菌和一些酵母菌。在培養(yǎng)過(guò)程中需提供適當(dāng)?shù)墓庹諚l件。觀察定期觀察真菌的生長(zhǎng)情況，記錄菌落形態(tài)、顏色、生長(zhǎng)速度等特征。對(duì)于特殊形態(tài)的菌落，需進(jìn)行顯微觀察以了解其結(jié)構(gòu)特征。15生理生化鑒定利用真菌對(duì)不同碳源、氮源等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用能力進(jìn)行鑒定，如糖發(fā)酵試驗(yàn)、氮源利用試驗(yàn)等。形態(tài)學(xué)鑒定通過(guò)觀察真菌菌落和個(gè)體的形態(tài)特征進(jìn)行鑒定，包括菌落形態(tài)、菌絲結(jié)構(gòu)、孢子形態(tài)等。分子生物學(xué)鑒定通過(guò)提取真菌DNA，利用PCR擴(kuò)增、測(cè)序等技術(shù)對(duì)真菌進(jìn)行鑒定，具有準(zhǔn)確度高、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。真菌鑒定方法16斜面保存法將真菌接種在斜面培養(yǎng)基上，待其生長(zhǎng)良好后，放入4℃冰箱保存。此法簡(jiǎn)單易行，但保存時(shí)間較短。液體石蠟保存法將真菌接種在液體培養(yǎng)基中，加入無(wú)菌液體石蠟覆蓋菌液表面，隔絕空氣，防止水分蒸發(fā)和細(xì)菌污染。放入4℃冰箱可長(zhǎng)期保存。冷凍干燥保存法將真菌懸浮液冷凍后，通過(guò)真空干燥去除水分，得到干燥的菌體。此法可長(zhǎng)期保存真菌且不影響其活性，但操作較復(fù)雜。真菌保存策略1704病毒培養(yǎng)方法與技巧Chapter1803接種后觀察定期觀察細(xì)胞病變情況，記錄病毒生長(zhǎng)情況。01接種前準(zhǔn)備選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞系和培養(yǎng)基，準(zhǔn)備好無(wú)菌操作臺(tái)和實(shí)驗(yàn)器材。02接種方法將病毒液按照一定比例接種到細(xì)胞培養(yǎng)基中，輕輕混勻后靜置培養(yǎng)。病毒接種技術(shù)1901020304潛伏期病毒接種后，細(xì)胞內(nèi)病毒數(shù)量逐漸增加，但無(wú)明顯細(xì)胞病變表現(xiàn)。平穩(wěn)期病毒數(shù)量達(dá)到高峰，但由于細(xì)胞死亡和病毒自身競(jìng)爭(zhēng)，病毒滴度趨于穩(wěn)定。指數(shù)期病毒數(shù)量呈指數(shù)增長(zhǎng)，細(xì)胞病變明顯，培養(yǎng)基中病毒滴度迅速升高。衰退期細(xì)胞大量死亡，病毒失去寄生環(huán)境，病毒滴度逐漸降低。病毒生長(zhǎng)曲線解讀20TCID50法利用半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量法，通過(guò)統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)細(xì)胞病變的孔數(shù)來(lái)計(jì)算病毒滴度。qPCR法利用熒光定量PCR技術(shù)，通過(guò)檢測(cè)病毒基因組的拷貝數(shù)來(lái)測(cè)定病毒滴度?？瞻咝纬蓡挝环ǎ≒FU）通過(guò)計(jì)算病毒在細(xì)胞單層上形成的空斑數(shù)量來(lái)測(cè)定病毒滴度。病毒滴度測(cè)定方法21病毒保存策略將病毒液保存在-80℃或液氮中，可長(zhǎng)期保持病毒的感染性。將病毒液凍干后保存在4℃或-20℃，方便運(yùn)輸和保存。將病毒液與保護(hù)劑混合后保存在4℃或-20℃，適用于短期保存。將病毒基因組克隆到細(xì)菌或真核細(xì)胞中，長(zhǎng)期傳代保存。低溫保存凍干保存懸浮液保存感染性克隆保存2205微生物實(shí)驗(yàn)室安全與管理Chapter23實(shí)驗(yàn)室生物安全級(jí)別劃分一級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室適用于對(duì)健康成年人已知無(wú)致病作用的微生物。三級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室適用于主要通過(guò)呼吸途徑使人傳染上嚴(yán)重的甚至是致死疾病的致病微生物或其毒素。二級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室適用于對(duì)人或環(huán)境具有中等潛在危害的微生物。四級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室適用于對(duì)人體具有高度的危險(xiǎn)性，通過(guò)氣溶膠途徑傳播或傳播途徑不明，尚無(wú)有效的疫苗或治療方法的致病微生物或其毒素。24進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室前需更換專用工作服、工作鞋，戴好工作帽和口罩，必要時(shí)使用護(hù)目鏡或面罩等個(gè)人防護(hù)用品。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中產(chǎn)生的廢棄物需分類收集，銳器物品需放入專用銳器盒中，感染性廢棄物需經(jīng)高壓蒸汽滅菌處理后再進(jìn)行后續(xù)處理。個(gè)人防護(hù)措施廢棄物處理個(gè)人防護(hù)措施及廢棄物處理25常用的消毒方法包括紫外線消毒、化學(xué)消毒劑擦拭或浸泡等，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求和物品特性選擇合適的消毒方法。消毒方法常用的滅菌方法包括高壓蒸汽滅菌、干熱滅菌、化學(xué)熏蒸等，需根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求和物品特性選擇合適的滅菌方法。滅菌方法實(shí)驗(yàn)室消毒和滅菌方法26針對(duì)可能發(fā)生的實(shí)驗(yàn)室安全事故，制定相應(yīng)的應(yīng)急預(yù)案，明確應(yīng)急組織、通訊聯(lián)絡(luò)、現(xiàn)場(chǎng)處置、醫(yī)療救護(hù)、安全防護(hù)等方面的措施。定期組織實(shí)驗(yàn)室人員進(jìn)行應(yīng)急演練，提高應(yīng)對(duì)突發(fā)事件的處置能力和自我保護(hù)意識(shí)。應(yīng)急預(yù)案制定和演練應(yīng)急演練應(yīng)急預(yù)案制定2706微生物實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)應(yīng)用案例Chapter28采集水樣富集培養(yǎng)分離純化鑒定分析環(huán)境微生物監(jiān)測(cè)案例分析從河流、湖泊等水域采集水樣，通過(guò)過(guò)濾、濃縮等方法收集微生物。通過(guò)平板劃線、稀釋涂布等方法將目標(biāo)微生物分離純化。將收集到的微生物進(jìn)行富集培養(yǎng)，提高目標(biāo)微生物的濃度。對(duì)分離純化的微生物進(jìn)行形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)和分子生物學(xué)鑒定，確定其種類和數(shù)量。29樣品處理微生物提取選擇性培養(yǎng)計(jì)數(shù)與鑒定食品微生物檢測(cè)案例分析01020304將食品樣品進(jìn)行粉碎、均質(zhì)等處理，以便于微生物的提取。通過(guò)浸泡、振蕩等方法將食品中的微生物提取出來(lái)。根據(jù)目標(biāo)微生物的特性，選擇合適的培養(yǎng)基進(jìn)行選擇性培養(yǎng)。對(duì)培養(yǎng)后的微生物進(jìn)行計(jì)數(shù)，并通過(guò)形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)等方法進(jìn)行鑒定。30根據(jù)感染部位選擇合適的標(biāo)本采集方法，如咽拭子、血液、尿液等。標(biāo)本采集將標(biāo)本直接涂片，通過(guò)革蘭染色等方法進(jìn)行初步觀察。直接涂片檢查將標(biāo)本接種于合適的培養(yǎng)基上，進(jìn)行分離培養(yǎng)。分離培養(yǎng)對(duì)分離出的微生物進(jìn)行鑒定，并進(jìn)行藥敏試驗(yàn)以指導(dǎo)臨床治療。鑒定與