演講人：日期:液基細(xì)胞蠟塊制作方法CATALOGUE目錄01樣本準(zhǔn)備02細(xì)胞濃縮處理03固定與包埋04切片技術(shù)05染色過程06質(zhì)量控制與存儲(chǔ)01樣本準(zhǔn)備細(xì)針穿刺抽吸法采用無菌細(xì)針穿刺目標(biāo)組織，通過負(fù)壓抽吸獲取細(xì)胞樣本，適用于淺表淋巴結(jié)、甲狀腺等部位的細(xì)胞采集，操作需注意避免血液稀釋和細(xì)胞損傷。樣本采集方法刷取或刮取法使用細(xì)胞刷或刮匙直接刷取黏膜表面（如宮頸、支氣管等）的脫落細(xì)胞，需控制力度以避免組織出血，同時(shí)確保細(xì)胞量充足。體液離心富集法針對(duì)胸腹水、腦脊液等體液樣本，需通過低速離心去除上清液，保留沉淀中的細(xì)胞成分，離心參數(shù)需根據(jù)樣本黏稠度調(diào)整。樣本運(yùn)輸與存儲(chǔ)低溫保存液運(yùn)輸采集后立即將樣本浸入專用細(xì)胞保存液（如CytoLyt或PreservCyt），保存液需含防腐劑以維持細(xì)胞形態(tài)，運(yùn)輸溫度控制在4-25℃以避免凍融損傷。短期與長期存儲(chǔ)短期存儲(chǔ)可置于4℃冰箱（不超過72小時(shí)），長期存儲(chǔ)需添加冷凍保護(hù)劑后于-80℃保存，避免反復(fù)凍融。防震防漏包裝樣本容器需密封防漏，外包裝填充緩沖材料，避免運(yùn)輸途中震蕩導(dǎo)致細(xì)胞破碎或污染，標(biāo)簽注明樣本類型和患者信息。初步處理步驟通過尼龍濾網(wǎng)或細(xì)胞篩去除黏液、血液及組織碎片，提高細(xì)胞純度，濾網(wǎng)孔徑通常選擇40-100μm以適應(yīng)不同樣本類型。樣本過濾與去雜質(zhì)使用磷酸鹽緩沖液（PBS）重復(fù)離心洗滌（1500rpm，5分鐘），去除殘留保存液及非細(xì)胞成分，保留細(xì)胞團(tuán)塊。細(xì)胞離心洗滌將洗滌后的細(xì)胞團(tuán)塊用95%乙醇或10%中性福爾馬林固定，固定時(shí)間需標(biāo)準(zhǔn)化（通常15-30分鐘）以保持細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清晰。細(xì)胞固定處理02細(xì)胞濃縮處理離心技術(shù)參數(shù)轉(zhuǎn)速與時(shí)間控制離心機(jī)轉(zhuǎn)速需根據(jù)細(xì)胞類型調(diào)整，通常設(shè)定為1500-3000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時(shí)間控制在5-10分鐘，以確保細(xì)胞有效沉淀且結(jié)構(gòu)完整。離心管選擇推薦使用錐形底離心管，其傾斜角度有助于細(xì)胞聚集，減少離心過程中細(xì)胞損傷風(fēng)險(xiǎn)。溫度與平衡離心環(huán)境需保持恒溫（20-25℃），離心前需對(duì)稱平衡配平，避免離心機(jī)震動(dòng)導(dǎo)致細(xì)胞分散或沉淀不均。細(xì)胞沉淀收集分裝與標(biāo)記若需分裝，按實(shí)驗(yàn)需求等量分配至預(yù)標(biāo)記的EP管中，注明樣本編號(hào)及處理日期，避免交叉污染。細(xì)胞重懸方法加入適量緩沖液（如PBS）輕柔吹打沉淀，避免氣泡產(chǎn)生，吹打次數(shù)不超過5次以維持細(xì)胞完整性。上清液去除技巧使用微量移液器緩慢吸除上清液，保留底部約0.5ml液體以防止細(xì)胞層擾動(dòng)，傾斜離心管可提高操作精度。雜質(zhì)去除方法梯度離心法通過密度梯度介質(zhì)（如Ficoll）分離細(xì)胞與雜質(zhì)，低速離心后雜質(zhì)集中于特定分層，可針對(duì)性去除。過濾篩網(wǎng)應(yīng)用選用40-70μm孔徑濾網(wǎng)過濾樣本，截留大顆粒雜質(zhì)，同時(shí)允許單細(xì)胞懸液通過，提高后續(xù)制片純度。紅細(xì)胞裂解技術(shù)針對(duì)血性樣本，使用氯化銨裂解液選擇性裂解紅細(xì)胞，保留目標(biāo)細(xì)胞并減少背景干擾。03固定與包埋成分穩(wěn)定性優(yōu)選滲透性強(qiáng)的固定液，確保細(xì)胞結(jié)構(gòu)快速固定，防止自溶或變形，如乙醇-福爾馬林混合液可兼顧滲透速度與形態(tài)保存。滲透性與速度兼容性固定液需與后續(xù)染色、免疫組化等檢測方法兼容，避免因固定劑殘留干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如避免含重金屬固定液影響分子病理檢測。固定液需具備穩(wěn)定的化學(xué)成分，避免因揮發(fā)或分解導(dǎo)致固定效果下降，常用中性緩沖福爾馬林（NBF）以維持pH值穩(wěn)定。固定液選擇標(biāo)準(zhǔn)包埋材料準(zhǔn)備石蠟純度要求包埋石蠟需高純度（熔點(diǎn)56-58℃），無雜質(zhì)或氣泡，以確保切片時(shí)組織完整性和連續(xù)性，推薦使用低粘度醫(yī)用級(jí)石蠟。脫水劑與透明劑金屬或塑料模具需耐高溫且表面光滑，便于脫模，模具尺寸應(yīng)與組織塊匹配，避免浪費(fèi)材料或影響包埋質(zhì)量。梯度乙醇（70%-100%）用于組織脫水，二甲苯或環(huán)保型透明劑替代品用于透明化處理，需嚴(yán)格控制時(shí)間以避免組織脆化。包埋模具選擇組織定位與方向?qū)⒐潭ê蟮慕M織塊置于模具中央，確保切面朝下，并調(diào)整至最佳切片方向（如管腔結(jié)構(gòu)縱向包埋），避免后續(xù)切片時(shí)組織斷裂。石蠟灌注技巧冷卻與修整包埋操作流程分兩次灌注熔融石蠟，首次少量覆蓋組織以排除氣泡，二次注滿模具，冷卻至半固態(tài)時(shí)標(biāo)記編號(hào)，防止混淆樣本。包埋后置于冷臺(tái)或冰板上加速凝固，脫模后修整蠟塊邊緣至平整，確保切片機(jī)夾持穩(wěn)固，減少切片厚度誤差。04切片技術(shù)切片機(jī)設(shè)置調(diào)整刀片角度校準(zhǔn)確保切片機(jī)刀片與樣本夾持臺(tái)呈精確角度，通常建議調(diào)整至5-10度范圍，以減少切片時(shí)的阻力與樣本撕裂風(fēng)險(xiǎn)。防卷板位置優(yōu)化精確控制防卷板與刀片的間隙距離（建議0.5-1mm），使切片能平展通過而不會(huì)卷曲或粘連。根據(jù)組織類型（如脂肪、肌肉或纖維組織）動(dòng)態(tài)調(diào)整夾持力度，避免因壓力不足導(dǎo)致樣本移位或壓力過大造成組織變形。樣本夾持壓力調(diào)節(jié)切片厚度控制微米級(jí)精度調(diào)節(jié)通過旋轉(zhuǎn)式厚度調(diào)節(jié)旋鈕設(shè)定切片厚度，常規(guī)病理診斷切片建議3-5μm，特殊研究需求可調(diào)整至1-2μm或更厚。溫度補(bǔ)償機(jī)制在低溫環(huán)境下運(yùn)行時(shí)需啟動(dòng)切片機(jī)恒溫系統(tǒng)，防止因熱脹冷縮導(dǎo)致厚度偏差超過±0.2μm的允許誤差范圍。組織預(yù)處理影響脫水不徹底或浸蠟不足的組織需適當(dāng)增加切片厚度至6-8μm，以補(bǔ)償處理缺陷導(dǎo)致的切片易碎問題。水浴展片參數(shù)控制保持水浴溫度在40-45℃之間，水面張力需通過添加少量酒精來調(diào)節(jié)，確保切片能充分展開而無褶皺。載玻片預(yù)處理使用多聚賴氨酸或正電荷玻片增強(qiáng)吸附力，轉(zhuǎn)移時(shí)以45度角緩慢入水，使切片自然貼合玻片避免氣泡殘留。疑難組織處理方案對(duì)于易碎組織（如腦組織），可采用"二次漂浮法"——先在水面展開切片，再用備用玻片從下方托起轉(zhuǎn)移。切片轉(zhuǎn)移技巧05染色過程將蘇木素粉末溶解于乙醇中，加入氧化劑和穩(wěn)定劑，充分?jǐn)嚢韬筮^濾，確保染液無沉淀且顏色均勻，適用于細(xì)胞核染色。染色試劑配制蘇木素染液配制將伊紅溶解于蒸餾水中，加入冰醋酸調(diào)節(jié)pH值，使染液呈弱酸性，以增強(qiáng)細(xì)胞質(zhì)著色效果，需避光保存以防降解。伊紅染液配制使用鹽酸乙醇溶液作為分化液，濃度需精確控制，避免過度分化導(dǎo)致細(xì)胞核染色過淺或完全脫色。分化液配制脫蠟與復(fù)水切片浸入蘇木素染液染色后，用分化液短暫處理以去除非特異性染色，再通過返藍(lán)液恢復(fù)細(xì)胞核的清晰藍(lán)色。核染色與分化胞質(zhì)染色與脫水伊紅染液染色細(xì)胞質(zhì)后，依次通過梯度乙醇脫水，逐步提高乙醇濃度以避免組織收縮或變形。將蠟塊切片依次浸入二甲苯和梯度乙醇中，徹底去除石蠟并使組織充分復(fù)水，確保后續(xù)染色試劑能有效滲透。染色程序步驟清洗與封片方法染色后清洗使用流動(dòng)蒸餾水輕柔沖洗切片，去除殘留染液，避免交叉污染或背景著色過深，沖洗時(shí)間需嚴(yán)格控制。中性樹膠封片將透明化切片滴加中性樹膠，覆蓋蓋玻片時(shí)避免氣泡產(chǎn)生，封片后置于通風(fēng)處固化，確保長期保存不褪色。透明化處理脫水后的切片經(jīng)二甲苯透明化，使組織透光性增強(qiáng)，便于顯微鏡觀察，操作時(shí)需避免二甲苯揮發(fā)過快影響效果。06質(zhì)量控制與存儲(chǔ)質(zhì)量評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)通過顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)是否完整，是否存在細(xì)胞核固縮、胞質(zhì)溶解等異常現(xiàn)象，確保樣本質(zhì)量符合后續(xù)診斷要求。細(xì)胞完整性檢測檢查蠟塊切片中是否存在血液、黏液或其他非細(xì)胞成分干擾，背景干凈的樣本可提高病理診斷準(zhǔn)確性。采用標(biāo)準(zhǔn)染色流程（如HE染色）后，檢查細(xì)胞核與胞質(zhì)著色是否清晰分明，確保染色質(zhì)量滿足病理學(xué)分析需求。背景清潔度評(píng)估評(píng)估單位面積內(nèi)細(xì)胞數(shù)量是否達(dá)標(biāo)，并確認(rèn)細(xì)胞分布是否均勻，避免因細(xì)胞堆積或稀疏影響診斷結(jié)果。細(xì)胞數(shù)量與分布均勻性01020403染色效果驗(yàn)證蠟塊應(yīng)存放于恒溫（建議15-25℃）、濕度低于60%的環(huán)境中，避免高溫或潮濕導(dǎo)致蠟塊變形或霉變。存儲(chǔ)容器需具備避光性能，且蠟塊需用密封袋或?qū)Ｓ煤蟹庋b，防止氧化或灰塵污染。每份蠟塊需標(biāo)注唯一編號(hào)、樣本類型及制作日期，并按病種或檢測項(xiàng)目分類存放，便于快速檢索。每月抽樣檢查存儲(chǔ)蠟塊的物理狀態(tài)（如是否開裂、脫片），及時(shí)處理異常樣本以保證長期保存質(zhì)量。存儲(chǔ)條件規(guī)范溫度與濕度控制避光與密封要求分類標(biāo)簽管理定期狀態(tài)檢查文檔記錄要求保存每次質(zhì)量評(píng)估的原始記錄（如細(xì)胞計(jì)數(shù)報(bào)告、染色評(píng)分表），并附操作人員簽名及