晝夜節(jié)律紊亂與小鼠腸道菌群代謝的相互影響摘要：睡眠在人類及哺乳動物的生命活動中具有十分重要的意義。但由于近代以來社會節(jié)奏的不斷加快，人們的睡眠質(zhì)量受到極大影響。為了完成相應的工作，人們借助咖啡因讓自己長時間保持清醒狀態(tài)，同時這也導致一定程度的睡眠缺失，因此本實驗以小鼠為研究對象，探究在睡眠缺失和咖啡因輔助作用下，小鼠腸道菌群和代謝組發(fā)生的變化，進而研究咖啡因輔助下的睡眠剝奪對人類健康造成潛在的影響。實驗結(jié)果顯示咖啡因處理會引起小鼠腸道菌群物種多樣性的降低、菌群豐度與相應代謝的變化。關(guān)鍵字：睡眠腸道微生物微生物多樣性分析代謝組咖啡因前言1.1睡眠剝奪與腸道菌群1.1.1睡眠剝奪對小鼠腸道微生物的影響根據(jù)前人研究，小鼠短期內(nèi)的睡眠剝奪不會引起腸道微生物群組成的重大變化，但會導致特定分類群上微生物群差異豐度的細微變化。這些包括屬于旋毛蟲門的Lachnospiraceae科的成員和C梭菌科的成員。[1]另一項研究大鼠和人類的慢性睡眠限制的研究表明，微生物群組成的變化對物種間的睡眠剝奪具有明顯的抵抗力[2]。1.1.2腸道微生物功能宏基因組學與代謝組學關(guān)聯(lián)分析方法研究進展宏基因組與代謝組等多組學聯(lián)用可在一定程度上克服上述單一組學研究的局限性，在腸道微生物與健康疾病關(guān)系研究等方面取得眾多進展。為了確定結(jié)腸微生物群的空間結(jié)構(gòu)，可采用一種高空間分辨率的方法，對小鼠結(jié)腸縱向和橫向軸上的微生物群進行采樣?？梢园l(fā)現(xiàn)復雜的小鼠結(jié)腸菌群表現(xiàn)出細微的組成梯度，該梯度在很大程度上受到沿結(jié)腸長度的位置的影響，但在較小程度上也與粘膜組織的距離有關(guān)。[3]從而較好的確定其空間結(jié)構(gòu)。盡管宏基因組學與代謝組學關(guān)聯(lián)分析展現(xiàn)強大生命力，但因忽視方法應用范圍等導致的多組學關(guān)聯(lián)分析方法濫用，以及所得相關(guān)性結(jié)論與生物學知識相悖等問題不容忽視。1.1.3總結(jié)以小鼠為睡眠剝奪模型進行探究其腸道微生物的宏基因組和代謝組變化，其實驗結(jié)果更易重復，也更加容易被接受，具有普遍性。此外，根據(jù)前人研究，短時間內(nèi)的睡眠剝奪并不會對小鼠的腸道菌群產(chǎn)生影響，所以說選用合理的睡眠剝奪方法，來合理安排睡眠剝奪時間對于獲得良好的實驗結(jié)果是至關(guān)重要的?？刹捎闷脚_睡眠剝奪技術(shù)、強制運動技術(shù)、以及化學藥物技術(shù)進行睡眠剝奪。此外，由于微生物之間的相互作用關(guān)系復雜，所以選擇合適的統(tǒng)計方法十分重要，能夠整合多因素的相互作用并得到具備生物學意義的統(tǒng)計方法是基于已有知識的多組學數(shù)據(jù)整合方法：如相關(guān)網(wǎng)絡(luò)、代謝模型拓撲分析[4]。這些方法都可以有效的對微生物的腸道菌群的宏基因組和代謝組進行有效整合。但不可否認的是，直接運用基于統(tǒng)計檢驗的多組學數(shù)據(jù)整合分析結(jié)合實驗研究也可獲得研究指標間的重要相關(guān)性結(jié)果，但易掩蓋關(guān)鍵相互作用，得到以偏概全的結(jié)論，不利于對腸道微生物組的全面認識。所以要結(jié)合實驗得到綜合結(jié)果。1.2咖啡因與小鼠腸道菌群1.2.1咖啡與咖啡因咖啡是一千多種不同化學物質(zhì)的復雜混合物，其中多種具有生物活性，例如咖啡因、二萜、綠原酸和黑色素，它們可能會影響人體健康。對心血管系統(tǒng)和新陳代謝的健康益處主要來自作為抗氧化劑的化合物，主要是多酚，包括綠原酸及其降解產(chǎn)物，負責咖啡化學保護作用[5]?？Х纫颍?,3,7-三甲基黃嘌呤）是天然存在于咖啡豆中的白色結(jié)晶黃嘌呤生物堿，作為咖啡中的主要藥理活性化合物對多種功能有影響，包括刺激中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS），刺激心肌以及松弛平滑肌，尤其是支氣管肌肉并作用于腎臟以產(chǎn)生利尿作用。咖啡因（1,3,7-三甲基黃嘌呤）的抗氧化能力與生物抗氧化劑谷胱甘肽相似，并且顯著高于抗壞血酸[6]。Ames測試中咖啡的抗突變作用可充分反映咖啡的抗氧化和抗氧化作用?？Х纫驎淮x降解，并涉及去甲基化步驟，以產(chǎn)生可可堿，茶堿，黃嘌呤，最后生成尿素（圖1）[7]。圖1咖啡因代謝途徑[8]咖啡的抗突變作用已得到充分證明[9]。抗誘變活性隨所暴露的咖啡的強度而不是抗誘變劑的濃度而變化。在各種體內(nèi)試驗中，當咖啡因在遺傳毒性劑之前給藥時，通常具有保護作用[10]。此外，咖啡因的潛在抗氧化活性具有抗大鼠肝微粒體氧化損傷的作用。這種損傷是由三種在體內(nèi)引起膜損傷的重要活性氧引起的，分別是羥基自由基（OH°），過氧自由基（ROO°）和單線態(tài)氧（1O2）。結(jié)果表明，咖啡因是針對脂質(zhì)過氧化的有效抑制劑[11]。1.2.2咖啡因?qū)Σ溉閯游锎x的作用機理咖啡因具有與腺苷相似的結(jié)構(gòu)。在人體中，咖啡因能夠與A1/A2A受體非特異性結(jié)合，因此它是腺苷受體拮抗劑，因此對周圍和中樞神經(jīng)系統(tǒng)有影響，例如可以刺激中樞神經(jīng)系統(tǒng)乙酰膽堿受體[12]。在內(nèi)皮細胞中，咖啡因直接使細胞內(nèi)鈣增加，并通過內(nèi)皮一氧化氮合酶的表達刺激血管生成而刺激一氧化氮的產(chǎn)生[13]。此外，咖啡因可通過增加水和電解質(zhì)的排泄，誘導利尿作用而間接降低血壓[14]。相反，在血管平滑肌細胞中，其作用主要是對磷酸二酯酶的競爭性抑制，從而積累cAMP[15]并阻斷血管組織中的腺苷受體，而這兩種機制都會引起血管收縮?？傊Х纫?qū)θ说难獕寒a(chǎn)生的主要影響是急性給藥后的實質(zhì)性增加[16]。在2018年的研究中[17]發(fā)現(xiàn)，長期喝咖啡的人減少咖啡攝入量，隨后逐漸增加，血清中總膽固醇，高密度脂蛋白（HDL）膽固醇，載脂蛋白AI和脂聯(lián)素的濃度應咖啡攝入量增加而顯著增加，而白介素18、8-異前列腺素和低密度脂蛋白（LDL）與HDL膽固醇的與載脂蛋白B和載脂蛋白AI的比率顯著下降。在咖啡對代謝綜合癥的影響的闡述中，咖啡因影響人類體重可能由于咖啡因增加了脂肪分解活性，增加了細胞生熱、靜息代謝率[18]，同時增加了去甲腎上腺素釋放和促腎上腺激素的活性[19]；咖啡因影響2型糖尿病可能因為咖啡因的攝入胰腺β細胞的胰島素釋放增加[20]，改善了葡萄糖耐量、提高了胰島素敏感性[21]1.2.3咖啡因?qū)δc道菌群的影響在細菌中，咖啡因可降解為可可堿或?qū)S嘌呤。兩種二甲基黃嘌呤均被脫甲基成7-甲基黃嘌呤，其繼而被脫甲基成黃嘌呤，然后進入嘌呤的分解代謝途徑。在細菌中，可可堿，對黃嘌呤和7-甲基黃嘌呤也可被氧化成它們相應的甲基尿酸。研究[22]表明咖啡因可有效消除金黃色葡萄球菌和大腸桿菌引起的細菌感染。它們顯示出廣泛的藥理活性，例如對一些病原體[23][24]。例如，氨茶堿和咖啡因增加了羧芐青霉素，頭孢唑肟和慶大霉素對金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的抗菌活性。而且可以確認，咖啡因能降低慶大霉素的MIC值對金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌[25][26]。此外，據(jù)報道咖啡因?qū)Π咨钪榫哂锌咕饔肹27]。在哺乳動物中，咖啡因排毒是由P450酶介導的，盡管咖啡因細胞的出口沒有特定的轉(zhuǎn)運蛋白，但不能排除多藥耐藥轉(zhuǎn)運蛋白。[28]實驗方法本實驗分為三個步驟進行，首先實驗組一共有8個平行，對照組也有8個平行，將16個樣品送到科技公司進行腸道菌群的檢驗，并進行了腸道微生物多樣性分析。隨后第二步進行代謝組分檢測進行分析，第三步將腸道微生物多樣性變化和代謝組多樣性變化進行聯(lián)合分析，得出結(jié)論。2.1腸道微生物組分析2.1.1第一個階段本實驗進行了一個實驗組（進行睡眠剝奪和咖啡因輔助處理的小鼠），實驗組一共設(shè)置了8個平行，此外對照組為健康的同一批次的小鼠，也設(shè)置了8個平行，隨后將16組實驗材料進行相應的處理和飼養(yǎng)，在飼養(yǎng)的過程中保持實驗變量之外的其他因素保持一致。經(jīng)過長時間的實驗處理，送往百邁克公司進行腸道菌群和代謝組的多樣性測定。2.1.2第二個階段拿到數(shù)據(jù)之后進行數(shù)據(jù)的分析處理，數(shù)據(jù)的分析處理一共分為三個部分。第一部分為腸道菌群的數(shù)據(jù)處理，微生物多樣性分析包括以下操作：（1）從原始數(shù)據(jù)中導出CCS序列，對CCS序列進行Barcode識別，長度過濾，去除嵌合體，得到Optimization-CCS；（2）將Optimization-CCS序列進行聚類，劃分OTU，并根據(jù)OTU的序列組成得到其物種分類；（3）基于OTU分析結(jié)果，對樣品在各個分類水平上進行分類學分析，獲得各樣品在門、綱、目、科、屬、種分類學水平上的群落結(jié)構(gòu)圖、物種聚類熱圖、屬分類學水平系統(tǒng)進化發(fā)生樹及分類學樹狀圖；（4）通過Alpha多樣性分析研究單個樣品內(nèi)部的物種多樣性，統(tǒng)計了各樣品在97%相似度水平下的Ace、Chao1、Shannon及Simpson指數(shù)，繪制了樣品稀釋曲線及等級豐度曲線；（5）通過Beta多樣性分析來比較不同樣品在物種多樣性方面（群落組成及結(jié)構(gòu)）存在的差異大小。根據(jù)距離矩陣獲得相應距離下的樣品層次聚類（UPGMA）樹、NMDS分析、樣品聚類熱圖及樣品PCA、PCoA圖（有分組信息）、基于多種距離的箱線圖等；（6）通過組間差異顯著性分析在不同組間尋找具有統(tǒng)計學差異的Biomarker；（7）通過16S功能基因預測分析，對樣品進行基因功能預測并計算功能基因豐度。2.2代謝組分的分析，進行了以下分析：2.2.1.數(shù)據(jù)評估（1）主成分分析（2）所有樣本聚類分析（3）重復相關(guān)性評估2.2.2.樣本分組數(shù)據(jù)分析（1）差異分組的主成分分析（2）差異分組的差異倍數(shù)分析（3）差異分組的正交偏最小二乘法判別分析（4）各分組的差異代謝物篩選及繪圖（5）差異代謝物KEGG通路注釋及富集分析（6）ROC分析（絕對定量且樣本較多時）最后第三部分進行腸道微生物多樣性變化和代謝組多樣性變化的聯(lián)合分析，統(tǒng)計數(shù)據(jù)最后得到實驗結(jié)果。實驗結(jié)果3.1測序結(jié)果測序后通過Barcode識別后共獲得85,878條CCS序列，每個樣品至少產(chǎn)生3,435條CCS序列，平均產(chǎn)生5,367條CCS序列。通過質(zhì)控過濾，平均每個樣本得到5234條有效數(shù)據(jù)，質(zhì)控有效率達97.49%。使用Usearch軟件對Tags在97%的相似度水平下進行聚類、獲得OTU，總共得283個OTUs?；赟ilva（細菌）和UNITE（真菌）分類學數(shù)據(jù)庫對OTU進行分類學注釋。注釋結(jié)果表明，上述OTUs共注釋到10門、42屬水平。3.2腸道菌群多樣性分析3.2.1ɑ多樣性分析對照組和處理組的香農(nóng)指數(shù)曲線均趨向平坦，說明測序數(shù)據(jù)量足以顯示樣品間的群落多樣性。結(jié)果顯示，對照組的Shannon指數(shù)高于實驗組，即對照組的物種豐富度和均勻度高于實驗組。（圖1）為了研究咖啡因處理前后腸道菌群間的差異，采用Chao1、Ace、Shannon、Simpson等多樣性指數(shù)來反映樣品間的物種多樣性。在門水平上，與對照組相比，咖啡因處理顯著降低了實驗組的Ace指數(shù)（P<0.05；圖2a）和Shannon指數(shù)（P<0.05；圖2b）。在屬水平，對照組的Shannon、Ace和Chao指數(shù)均高于處理組，而Simpson指數(shù)低于實驗組。上述結(jié)果表明，對照組的物種多樣性高于實驗組。（a）（b）圖1香農(nóng)指數(shù)曲線。當曲線趨向平坦時，說明測序數(shù)據(jù)量足夠大，OTU種類不會在隨測序量增加而增長；如果曲線沒有趨于平坦，則表明不飽和，增加數(shù)據(jù)量可以發(fā)現(xiàn)更多OTU。（a）為不同樣品的香農(nóng)指數(shù)曲線，（b）為正常組和實驗組的香農(nóng)指數(shù)曲線，其中CASD組表示實驗組，CTRL組為對照組。（a）（b）圖2門水平的Ace指數(shù)和Shannon指數(shù)比較。（a）為CASD組和CTRL組的Ace指數(shù)柱狀圖（p=0.048，Wilcoxon秩和檢驗）；（b）為CASD組和CTRL組的香農(nóng)指數(shù)柱狀圖。（p=0.043，Wilcoxon秩和檢驗）。3.2.2β多樣性分析為了比較不同樣品在物種多樣性方面存在的相似程度，使用QIIME軟件對其進行基于weightedUniFrac算法的PCoA分析和ANOSIM檢驗。結(jié)果表明：對照組和實驗組間的總體微生物組成存在差異（ANOSIM檢驗，p=0.048<0.05，R=0.184>0；圖3）。圖3基于加權(quán)的UniFrac的主坐標分析（PCoA）。圖中每個圖形各對應一個腸道菌群樣本，坐標圖上距離越近的樣品，相似性越大。2.3腸道菌群相對豐度及組間差異分析2.3.1門和屬水平腸道菌群結(jié)構(gòu)豐度熱圖顯示了樣品間物種水平的腸道菌群組成的差異（圖4c）。對照組和實驗組的優(yōu)勢菌門為Bacteroidota（類桿菌門），F(xiàn)irmicutes（厚壁菌門）和Bacteroidetes（擬桿菌門），且平均相對豐度在實驗組更高，占所有菌群的87.12%；而Proteobacteria（變形菌門）和Actinobacteriota（放線菌門）的平均相對豐度則在正常組更高，Actinobacteriota（放線菌門）更是對照組特有的菌門（圖4d）。在屬水平，其優(yōu)勢菌屬為Muribaculum，Alistipes，Lactobacillus，Prevotella，Oscillibacter，Eubacterium，Mucispirillum和Faecalibaculum。其中Prevotella和Mucispirillum在正常組的平均相對豐度更高。（圖4）（a）（b）（c）（d）圖4門和屬水平上腸道菌群結(jié)構(gòu)相對豐度的比較。（a）、（b）分別為門和屬水平的物種分布柱狀圖。一種顏色代表一個物種，色塊長度表示物種所占相對豐度比例。Others為其他菌群合并，Unknown代表未得到分類學注釋的物種。（c）為物種水平的分布熱圖，橫軸為樣品分組信息，縱向聚類為物種信息，顏色梯度由藍色到紅色表示相對豐度由低到高。（d）為門水平的venn圖。3.4.2組間差異性腸道菌群為了分析研究組間差異性腸道菌群，我們使用了LDA-LEfSe分析來確定最有可能解釋組間群落組成差異的分類群（圖5）。對比分析可得，在門水平，實驗組的Proteobacteria（變形菌門）和Actinobacteriota（放線菌門）的平均相對豐度顯著低于對照組；在屬水平，Parasutterella、Neglecta和Enterorhabdus的平均相對豐度在對照組更高,而Alistipes在實驗組中平均相對豐度更高。（圖5）這些結(jié)果表明，咖啡因處理的實驗組與對照組在腸道菌群組成上存在差異，這些差異主要表現(xiàn)在一些腸道菌群的豐度的細微差別上。（a）（b）圖5LDAscore大于2的LEfSe分析。（a）為LDA值分布柱狀圖，它顯示了樣本中豐度差異顯著的菌群，長度代表差異菌群的影響大小。（b）為LEfSe分析進化分枝圖。由內(nèi)至外輻射的圓圈代表了由門至種的分類級別；在不同分類級別上的每一個小圓圈代表該水平下的一個分類，小圓圈直徑大小與相對豐度大小呈正比；著色原則為將無顯著差異的物種統(tǒng)一著色為黃色，其他差異物種按該物種所在豐度最高的分組進行著色。討論與結(jié)論綜上所述，實驗組與對照組的腸道菌群組成存在差異?？Х纫蛱幚頃鹦∈竽c道菌群物種多樣性的降低，菌群豐度的變化。這種變化導致小鼠對脂肪酸代謝能力的改變、對炎癥反應的響應和體質(zhì)的變化等。經(jīng)過后續(xù)對代謝組的分析，我們可能會得到更多信息來揭示菌群變化與小鼠代謝間的關(guān)系。綜合這些分析，我們可以得出在熬夜情況下飲用咖啡是否會對我們的健康造成影響，并有可能通過對變形菌門和放線菌門的減少，Alistipes的增加等這些重要差異變化來反映我們的健康程度。致謝時間如白馬過隙，我們在歷時8個月的時間，終于項目有了些許進展。在這里我感到很榮幸能遇到自己的隊友，很感激能遇到很好的師兄師姐幫助我們完善實驗，最重要的是感謝我們的指導老師趙海諭老師，從實驗方案的思考設(shè)計，到后期實驗的開展都盡心盡力，最后我們才能得到老師很多努力之后得到的測試數(shù)據(jù)。感謝徐嫣藝師姐、王左師兄的幫助。最初進入實驗室時，師兄師姐帶著我們熟悉實驗室的環(huán)境，同時教會了我們很多分析軟件的使用，也不辭辛苦的為實驗做了很多的工作和準備。最后還是要感謝各位評委老師能夠看到我們的成長，能夠給與我們批評指正。參考文獻ElAidy,Sahar；Bolsius,YouriG.；Raven,Frank；Havekes,Robbert.AbriefperiodofsleepdeprivationleadstosubtlechangesinmousegutmicrobiotaJOURNALOFSLEEPRESEARCH,2019Zhang,ShirleyL.;Bai,Lei;Goel,Namni;Bailey,Aubrey;Jang,ChristopherJ.;Bushman,FredericD.;Meerlo,Peter;Dinges,DavidF.;Sehgal,Amita.HumanandratgutmicrobiomecompositionismaintainedfollowingsleeprestrictionPROCEEDINGSOFTHENATIONALACADEMYOFSCIENCESOFTHEUNITEDSTATESOFAMERICA2017.Riva,Alessandra;Kuzyk,Orest;Forsberg,Erica;Siuzdak,Gary;Pfann,Carina;Herbold,Craig;Daims,Holger;Loy,Alexander;Warth,Benedikt;Berry,David.Afiber-depriveddietdisturbsthefine-scalespatialarchitectureofthemurinecolonmicrobiome[J]NATURECOMMUNICATIONS，2019侯璐文,吳長新,秦雪梅,李建國.腸道微生物功能宏基因組學與代謝組學關(guān)聯(lián)分析方法研究進展[J].微生物學報,59(09):1813-1822，2019.Gulcin

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