大鼠實驗技術(shù)操作規(guī)定一、實驗準備階段

（一）實驗動物準備

1.來源：選擇健康、遺傳背景明確、體重在180-250g之間的大鼠，來源應(yīng)符合實驗動物福利標準。

2.飼養(yǎng)環(huán)境：實驗前需在SPF級屏障環(huán)境中飼養(yǎng)至少1周，溫度（20±2）℃，濕度（50±10）%，12小時光照/黑暗循環(huán)。

3.飼養(yǎng)條件：自由攝食飲水，使用標準化飼料（如普通飼料或高脂飼料，根據(jù)實驗需求選擇）。

（二）實驗器械與試劑準備

1.器械檢查：確保手術(shù)器械（如手術(shù)剪、縫合針）、注射器（1mL、5mL）、固定板等清潔消毒合格。

2.試劑準備：如生理鹽水、麻醉劑（如水合氯醛，劑量0.35-0.5mL/100g）、染料（如Evansblue）等需現(xiàn)配現(xiàn)用。

3.記錄工具：準備電子記錄儀、行為學(xué)評分表等。

二、實驗操作規(guī)范

（一）麻醉操作

1.麻醉給藥：腹腔注射麻醉劑，劑量需根據(jù)體重調(diào)整（如水合氯醛0.4mL/100g）。

2.麻醉監(jiān)測：注射后30秒開始觀察大鼠反應(yīng)，確保呼吸平穩(wěn)、角膜反射消失。

3.維持麻醉：術(shù)中可追加麻醉劑（如每60分鐘追加1/3初始劑量）。

（二）手術(shù)操作（以心臟灌流為例）

1.手術(shù)流程：

(1)暴露胸腔：沿肋骨剪開皮膚及脂肪，剪開肋骨2-3根。

(2)心臟暴露：用無創(chuàng)夾固定心臟，暴露主動脈及左心室。

(3)灌流準備：連接灌流泵，先灌注生理鹽水（37℃）沖洗血液，再灌注固定液（如4%多聚甲醛）。

2.注意事項：

(1)動作輕柔避免損傷心肌。

(2)灌流速度控制在10-15mL/min。

（三）行為學(xué)實驗操作（以平衡測試為例）

1.測試步驟：

(1)訓(xùn)練階段：每天重復(fù)訓(xùn)練5次，每次10分鐘，使大鼠適應(yīng)測試平臺。

(2)測試記錄：用攝像頭記錄大鼠在平臺上的站立時間（如前肢離地時間），累計分析。

2.數(shù)據(jù)處理：剔除異常數(shù)據(jù)（如站立時間＞30秒視為失?。?。

三、實驗結(jié)束與標本處理

（一）實驗終止

1.倫理審查：確保實驗符合動物福利倫理要求，必要時實施安樂死（如過量麻醉）。

2.尸體處理：實驗后尸體需進行無害化處理（如焚燒）。

（二）標本保存

1.心臟標本：固定后置于30%蔗糖溶液梯度脫水，再轉(zhuǎn)入二甲苯透明，最后石蠟包埋。

2.數(shù)據(jù)歸檔：實驗記錄需雙人核對，電子版與紙質(zhì)版存檔至少3年。

四、安全防護要點

（一）個人防護

1.必須穿戴實驗服、手套、護目鏡。

2.操作中避免皮膚接觸化學(xué)試劑，如不慎接觸需立即用大量清水沖洗。

（二）環(huán)境防護

1.實驗臺面需鋪設(shè)防滑墊，防止器械滑落。

2.術(shù)后器械需立即滅菌，避免交叉污染。

五、異常情況處理

（一）麻醉意外

1.若大鼠呼吸停止，立即進行人工呼吸，并通知獸醫(yī)。

2.調(diào)整麻醉劑量，避免下次實驗重復(fù)發(fā)生。

（二）術(shù)后感染

1.觀察傷口紅腫、分泌物等情況，必要時使用抗生素（如青霉素）。

2.記錄感染案例并分析原因，優(yōu)化手術(shù)流程。

**一、實驗準備階段**

（一）實驗動物準備

1.來源與接收：

(1)選擇具備資質(zhì)的實驗動物供應(yīng)商，確保大鼠來源符合衛(wèi)生和遺傳背景要求。

(2)接收時檢查動物健康狀況，包括活動能力、毛發(fā)光澤、無異常氣味等。

(3)記錄每只大鼠的個體信息（如編號、性別、出生日期、體重）于實驗檔案。

2.預(yù)飼與適應(yīng)：

(1)接收后進行至少7天的預(yù)飼期，使用標準顆粒飼料和自由飲水。

(2)放置在安靜、通風(fēng)的適應(yīng)飼養(yǎng)間，減少環(huán)境應(yīng)激。

(3)每日觀察動物行為、飲食飲水情況，并稱重記錄。

3.健康篩查：

(1)進行基礎(chǔ)健康檢查，包括外觀檢查（皮毛、眼睛、鼻子）、聽診（心肺）、稱重。

(2)根據(jù)實驗需求，可進行血清學(xué)或病原學(xué)檢測（如病毒、細菌篩查）。

(3)拒絕患有明顯疾?。ㄈ绺篂a、皮疹、呼吸系統(tǒng)癥狀）的動物進入實驗。

（二）實驗器械與試劑準備

1.器械清洗與消毒：

(1)手術(shù)器械：包括手術(shù)剪、手術(shù)刀、組織鑷、縫合針線等，需使用高壓蒸汽滅菌（121℃，15-20分鐘）或化學(xué)消毒劑（如75%乙醇浸泡30分鐘）消毒。

(2)注射器：根據(jù)需要選擇不同規(guī)格（如1mL、3mL、5mL），確保無菌，使用前用生理鹽水沖洗。

(3)固定裝置：如手術(shù)臺固定板、鼠籠等，需清潔并用消毒劑擦拭。

2.試劑配制與檢查：

(1)麻醉劑：按說明書精確配制水合氯醛溶液（如10g/L），使用前搖勻檢查澄清度。

(2)緩沖液：配制生理鹽水（0.9%NaCl）或特定緩沖液（如磷酸鹽緩沖液PBS），使用前用濾膜（0.22μm）過濾除菌。

(3)固定液：如4%多聚甲醛溶液，需新鮮配制或使用商業(yè)預(yù)配產(chǎn)品，確保濃度準確。

3.實驗環(huán)境準備：

(1)檢查實驗操作區(qū)域的潔凈度，確保符合無菌操作要求。

(2)準備應(yīng)急物品，如急救箱（含生理鹽水、抗生素、消毒棉球等）。

(3)連接并測試所有儀器設(shè)備，如灌流泵、監(jiān)測設(shè)備等。

**二、實驗操作規(guī)范**

（一）麻醉操作

1.麻醉方式選擇：

(1)常用腹腔注射麻醉（如水合氯醛、戊巴比妥鈉）。

(2)根據(jù)實驗需求選擇合適麻醉深度（如淺麻醉用于簡單操作，深麻醉用于手術(shù)）。

2.劑量計算與給藥：

(1)劑量通常根據(jù)體重計算（如水合氯醛：0.35-0.5mL/100g體重）。

(2)使用無菌注射器進行腹腔注射，針頭角度約45度，深度約1-1.5cm。

(3)給藥后輕撫動物腹部，觀察30-60秒進入麻醉狀態(tài)（表現(xiàn)為呼吸減慢、對刺激無反應(yīng)）。

3.麻醉深度監(jiān)測：

(1)觀察呼吸頻率與深度、角膜反射、對疼痛刺激的反應(yīng)（如尾巴提起）。

(2)必要時通過追加少量麻醉劑維持麻醉深度。

4.麻醉后護理：

(1)將動物置于保定盒內(nèi)，頭部抬高防止誤吸。

(2)監(jiān)測體溫，必要時使用加溫墊維持體溫（如37±0.5℃）。

（二）手術(shù)操作（以心臟灌流固定為例）

1.手術(shù)前準備：

(1)復(fù)習(xí)手術(shù)流程，準備好所有器械和試劑。

(2)用酒精棉球消毒動物胸部毛發(fā)，范圍至少覆蓋心臟區(qū)域。

(3)鋪設(shè)無菌手術(shù)巾，建立無菌操作區(qū)域。

2.手術(shù)步驟：

(1)切開皮膚與脂肪：沿肋骨走向做2-3cm切口，用止血鉗分離皮下脂肪。

(2)暴露胸腔與心臟：剪開肋間?。ㄗ⒁獗Ｗo胸膜），用無齒鑷牽引暴露心臟。

(3)插入灌流針：在左心室部位找到合適位置，用縫合針穿過心肌，插入灌流針。

(4)連接灌流系統(tǒng)：連接灌流泵、壓力監(jiān)測裝置和灌流液袋。

(5)開始灌流：先以生理鹽水（37℃）快速沖洗血液，觀察心臟顏色變化。

(6)固定：生理鹽水灌流結(jié)束后，立即切換至固定液（如4%多聚甲醛），緩慢勻速灌流。

3.術(shù)后處理：

(1)灌流結(jié)束后，取出灌流針，用縫合線結(jié)扎左心耳。

(2)沿心臟周圍剪開右心房，繼續(xù)緩慢灌流固定液。

(3)完成灌流后，取出心臟，置于固定液中過夜（4-6小時）。

（三）行為學(xué)實驗操作（以平衡測試為例）

1.設(shè)備準備：

(1)準備平衡測試平臺（如圓形玻璃板或金屬網(wǎng)，直徑約30cm，高度30cm）。

(2)配備計時器、行為記錄本或攝像機。

(3)如需刺激物，提前準備好（如不同重量物體）。

2.動物訓(xùn)練：

(1)在正式測試前，每天訓(xùn)練動物5-10分鐘，使其熟悉平臺和環(huán)境。

(2)訓(xùn)練時給予少量獎勵（如少量食物），避免產(chǎn)生過度恐懼。

(3)記錄訓(xùn)練過程中的適應(yīng)情況，如停留時間、跌落次數(shù)。

3.測試執(zhí)行：

(1)測試前將動物置于平臺邊緣，記錄其自主站立的時間（前肢完全離地）。

(2)可進行不同條件測試（如有無視覺線索、不同光照條件）。

(3)每次測試后給予安慰性互動，減少動物疲勞。

4.數(shù)據(jù)記錄與分析：

(1)詳細記錄每次測試的站立時間、跌落方向、持續(xù)時間等。

(2)使用統(tǒng)一評分標準（如根據(jù)站立穩(wěn)定性評分）。

(3)數(shù)據(jù)用統(tǒng)計學(xué)軟件（如SPSS）進行整理分析。

**三、實驗結(jié)束與標本處理**

（一）實驗終止

1.安樂死操作：

(1)如需終止實驗，使用humaneendpoints規(guī)定的安樂死方法（如過量麻醉）。

(2)操作需由經(jīng)驗豐富的實驗人員執(zhí)行，確保動物快速無痛死亡。

(3)記錄安樂死時間及執(zhí)行人員。

2.尸體處置：

(1)安樂死后的動物尸體需統(tǒng)一收集，進行無害化處理（如焚燒）。

(2)處置過程需符合實驗室規(guī)定，避免環(huán)境污染。

(3)做好處置記錄。

（二）標本保存與處理

1.心臟標本：

(1)灌流固定的心臟取出后，置于不同濃度梯度（如30%、50%、70%、80%、95%）的蔗糖溶液中脫水（每日更換溶液）。

(2)脫水后轉(zhuǎn)入純二甲苯透明（至少24小時更換一次）。

(3)最后注入石蠟，包埋制備石蠟切片。

2.組織切片：

(1)石蠟包埋后，使用切片機（切片厚5-10μm）制備連續(xù)切片。

(2)切片需編號，按順序排列于載玻片上，標記清晰。

(3)可進行HE染色或其他特殊染色（如免疫組化），用于顯微鏡觀察。

3.數(shù)據(jù)歸檔：

(1)實驗原始記錄（包括手術(shù)記錄、行為學(xué)評分、圖片等）需雙人核對。

(2)電子數(shù)據(jù)與紙質(zhì)記錄共同存檔，保存期限不少于3年。

**四、安全防護要點**

（一）個人防護

1.服裝與手套：

(1)必須穿戴實驗服、長褲、鞋套。

(2)操作化學(xué)試劑時佩戴丁腈手套，接觸動物時佩戴乳膠手套。

(3)必要時佩戴護目鏡或面罩。

2.化學(xué)品防護：

(1)了解所用試劑的MSDS（材料安全數(shù)據(jù)表），注意其危害性。

(2)使用移液管器時避免皮膚接觸腐蝕性試劑（如固定液）。

(3)洗手液需專用，實驗結(jié)束后必須徹底清洗雙手。

（二）環(huán)境防護

1.操作區(qū)域：

(1)實驗臺面鋪設(shè)防滑、易清潔的墊子。

(2)保持操作臺整潔，器械分類放置，避免混淆。

(3)禁止在實驗區(qū)域內(nèi)飲食、吸煙。

2.器械管理：

(1)滅菌器械需檢查滅菌效果（如使用生物指示劑）。

(2)注射器等接觸動物體內(nèi)的器械必須無菌，嚴禁復(fù)用。

(3)術(shù)后器械立即分類處理（可重復(fù)使用器械需徹底清洗消毒）。

**五、異常情況處理**

（一）麻醉意外

1.呼吸停止：

(1)立即停止給藥，松開動物固定，清除口腔分泌物。

(2)嘗試人工呼吸（如捏住鼻子，口對口吹氣），并通知獸醫(yī)。

(3)檢查麻醉劑是否過量，下次實驗謹慎調(diào)整劑量。

2.心率/呼吸驟停：

(1)立即進行心肺復(fù)蘇（如胸外按壓），同時聯(lián)系獸醫(yī)支援。

(2)保持呼吸道通暢，必要時使用輔助通氣設(shè)備。

（二）手術(shù)并發(fā)癥

1.大出血：

(1)立即壓迫出血點，查找并結(jié)扎出血血管。

(2)如出血嚴重，需調(diào)整手術(shù)方案或終止手術(shù)。

(3)術(shù)后加強觀察，必要時使用止血藥物。

2.術(shù)后感染：

(1)觀察傷口有無紅腫、膿性分泌物、周圍溫度升高。

(2)如懷疑感染，采集