TheHerosofCRISPR匯報(bào)人：周文慧組員：莊學(xué)梅，李海霞，周文慧，張姝，代澤寶，楊少娟指導(dǎo)教師：牛雪梅研究員CONTENTS目錄CRISPR/Cas9技術(shù)發(fā)展史及啟發(fā)CRISPR/Cas9技術(shù)20世紀(jì)50年代微生物遺傳學(xué)、生物化學(xué)和基因組學(xué)，三位大師級(jí)科學(xué)家萊德伯格(JoshuaLederberg)、科恩伯格(ArthurKornberg)和桑格(FrederickSanger)為CRISPR的發(fā)現(xiàn)做出了奠基性貢獻(xiàn)，使基因測(cè)序成為常規(guī)研究?jī)?nèi)容。技術(shù)發(fā)展史---CRISPR的發(fā)現(xiàn)萊德伯格奠定細(xì)菌遺傳學(xué)基礎(chǔ)，從而使簡(jiǎn)單的細(xì)菌成為分子生物學(xué)模式生物；科恩伯格奠定細(xì)菌分子生物學(xué)酶學(xué)基礎(chǔ)，開創(chuàng)酶學(xué)研究科學(xué)范式；桑格于1977年發(fā)明基因測(cè)序方法；技術(shù)發(fā)展史---CRISPR的發(fā)現(xiàn)FranciscoMojicaGilesVergnaudPhilippeHorvath發(fā)現(xiàn)聚集的規(guī)律插入間隔回文重復(fù)序列，并其命名為CRISPR，在20種微生物上發(fā)現(xiàn)了CRISPR基因位點(diǎn)，意識(shí)到CRISPR是一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)純粹好奇心無假設(shè)驅(qū)動(dòng)個(gè)人興趣在鼠疫桿菌樣本中發(fā)現(xiàn)CRISPR基因位點(diǎn)，推測(cè)CRISPR基因位點(diǎn)是在執(zhí)行防御機(jī)制檢驗(yàn)CRISPR是一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)這一假設(shè)，發(fā)現(xiàn)免疫功能就是依賴間隔與目標(biāo)物之間的精準(zhǔn)DNA序列匹配來實(shí)現(xiàn)的，研究了的兩個(gè)cas基因的作用：cas7和cas9。軍事上的特殊需要（防范生物戰(zhàn)爭(zhēng)）無假設(shè)驅(qū)動(dòng)工業(yè)應(yīng)用（提高酸奶產(chǎn)量）假設(shè)驅(qū)動(dòng)技術(shù)發(fā)展史---設(shè)計(jì)CRISPRJohnvanderOostLucianoMarraffiniSylvainMoineau鑒定擁有5個(gè)cas蛋白的復(fù)合體;Cascade，驗(yàn)證重復(fù)序列的回文結(jié)構(gòu)特性導(dǎo)致crRNA中次級(jí)結(jié)構(gòu)的形成，驗(yàn)證CRISPR的靶標(biāo)不是RNA，是DNA驗(yàn)證CRISPR的目標(biāo)是DNA,預(yù)測(cè)CRISPR可以被轉(zhuǎn)而用于在異源性系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行基因組編輯。證明CRISPR的目標(biāo)是DNA，發(fā)現(xiàn)Cas9的核酸酶活性是在精準(zhǔn)的點(diǎn)位上對(duì)DNA進(jìn)行切割的，而這些點(diǎn)位則由crRNA的特定序列編碼假設(shè)驅(qū)動(dòng)深厚的專業(yè)知識(shí)假設(shè)驅(qū)動(dòng)深厚的專業(yè)知識(shí)實(shí)踐運(yùn)用技術(shù)發(fā)展史---設(shè)計(jì)CRISPREmmanuelleCharpentier發(fā)現(xiàn)作反式作CRISPRRNA(tracrRNA)不僅僅涉及處理crRNA，它還對(duì)Cas9核酸酶復(fù)合體剪切DNA是必需的純粹好奇心無假設(shè)驅(qū)動(dòng)個(gè)人興趣VirginijusSiksnys發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入整個(gè)CRISPR基因位點(diǎn)就足以實(shí)現(xiàn)對(duì)質(zhì)粒和噬菌體DNA的靶向干擾。用異源系統(tǒng)證明了Cas9是干擾活動(dòng)唯一必需的蛋白，在試管里研究CRISPR與Charpentier合作證明兩種RNA在被融合為單一的導(dǎo)向RNA（sgRNA）時(shí)也可以在體外發(fā)揮作用假設(shè)驅(qū)動(dòng)個(gè)人興趣JenniferDoudna純粹好奇心無假設(shè)驅(qū)動(dòng)個(gè)人興趣技術(shù)發(fā)展史---CRISPR-Cas9技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用張峰人工核酸酶（TALEs）被解碼之后，張峰成功地將TALEs改造用于哺乳動(dòng)物，使得精準(zhǔn)激活、抑制和編輯基因成為可能通過表達(dá)Cas9基因和一個(gè)設(shè)計(jì)過的靶向攜帶熒光素酶的質(zhì)粒的CRISPRRNA，他可以在人胚胎腎細(xì)胞（HEK）內(nèi)降低熒光度可利用多個(gè)sgRNA而實(shí)現(xiàn)多基因同時(shí)敲除，從而極大提升編輯效率和適用范圍。發(fā)現(xiàn)一個(gè)由三部分組成的強(qiáng)有效的系統(tǒng)，包含來自化膿性鏈球菌和嗜熱鏈球菌兩者之一的Cas9、tracerRNA和CRISPR陣列純粹好奇心無假設(shè)驅(qū)動(dòng)深厚的專業(yè)知識(shí)1987CRISPR的發(fā)現(xiàn)CRISPR廣泛存在與原核生物中200020022005CRISPR的命名Cas基因的定義間隔序列適應(yīng)性免疫系統(tǒng)確定PAM第一次證實(shí)CRISPR的作用：獲得性免疫20072009201120082010201220132014Spacers轉(zhuǎn)錄形成crRNA指導(dǎo)Cas靶向性CRISPR靶點(diǎn)是DNATypeIII-BCRISPR能夠?qū)NA切割Cas9蛋白由spacersequencos和cleaves引導(dǎo)識(shí)別靶序列進(jìn)行切割造成DSBtracrRNA與crRNA形成二聚體并與Cas9組成復(fù)合體體外證實(shí)Cas能夠?qū)NA切割第一次證實(shí)CRISPR可以用于哺乳動(dòng)物的編輯證實(shí)編程CRISPR/Cas9蛋白復(fù)合物在序列特異性的靶位點(diǎn)識(shí)別并切割RNAtracrRNA(反式作用CRISPRRNA)

crRNA(CRISPRRNA)PAM（ProtospacerAdjacentMotif）IshinoMojicaJansenPourcelMojicaBarrangouMarraffiniHaleBolotinJarneauCharpentierDoudnaZhangFengCRISPR專利之爭(zhēng)VSZhangFeng麻省理工學(xué)院Broad研究所JenniferDoudna加州大學(xué)伯克利分校2012年，JennifeCharpentier領(lǐng)導(dǎo)的研究小組發(fā)表的一篇關(guān)鍵文章中揭示了這一天然免疫系統(tǒng)是如何變成編輯工具的。2013年1月，張鋒發(fā)表文章證實(shí)了這種充滿魔法的編輯工具能運(yùn)用到人類細(xì)胞的基因組上。JenniferDoudna在幾周后，也發(fā)表了她自己的結(jié)果。2014年4月，張鋒和Broad研究所獲得了CRISPR相關(guān)的首個(gè)專利。專利權(quán)限包括在真核細(xì)胞或者任何有細(xì)胞核的細(xì)胞物種中使用CRISPR。2014年5月JenniferDoudna啟動(dòng)專利抵觸程序。2017年2月美國(guó)專利局裁決MIT獲得專利。CRISPR發(fā)展背后的啟發(fā)科研環(huán)境靈感與規(guī)劃好奇心與實(shí)踐運(yùn)用無假設(shè)驅(qū)動(dòng)與假設(shè)驅(qū)動(dòng)個(gè)人與團(tuán)隊(duì)新穎的視角和深厚的專業(yè)知識(shí)CRISPR發(fā)展背后的思考首先，重視微生物研究其次，重視基礎(chǔ)科學(xué)研究最后，重視科學(xué)發(fā)展規(guī)律CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)CRISPR技術(shù)最新應(yīng)用《利用CRISPR基因編輯的成體造血干細(xì)胞在患有艾滋病合并急性淋巴細(xì)胞白血病患者中的長(zhǎng)期重建》研究結(jié)果顯示：利用CRISPR/Cas9技術(shù)，科學(xué)家對(duì)人造血干細(xì)胞進(jìn)行基因編輯，基因編輯后的干細(xì)胞在動(dòng)物模型中可長(zhǎng)期穩(wěn)定重建造血系統(tǒng)，并且其產(chǎn)生的外周血細(xì)胞具有抵御艾滋和白血病的能力。2017至2019年9月，研究組展開臨床實(shí)驗(yàn)，基因編輯后的干細(xì)胞移植后4周，患者白血病處于完全緩解狀態(tài)。研究人員又進(jìn)行了19個(gè)月的后續(xù)觀察，發(fā)現(xiàn)在此期間，患者的白血病一直處于持續(xù)完全緩解狀態(tài)，供者型細(xì)胞完全嵌合。CRISPR發(fā)展背后的思考優(yōu)點(diǎn)靶向精準(zhǔn)、易于操作、效率高、更易得到純合子突變體，可在不同位點(diǎn)同時(shí)引入多個(gè)突變、細(xì)胞毒性低、廉價(jià)便宜。缺點(diǎn)靶區(qū)前無PAM序列則不能切割特異性不高隨時(shí)面臨脫靶效應(yīng)（CRISPR-CAS不是哺乳動(dòng)物酶系，跟人類DNA修復(fù)系統(tǒng)缺乏配合，所以操作以后留下的序列是非常隨機(jī)的，無法預(yù)測(cè)切割位點(diǎn)）CRISPR基因編輯技術(shù)應(yīng)用的倫理學(xué)問題世界首例免疫艾滋病的基因編輯嬰兒在中國(guó)誕生CRISPR技術(shù)有一定的脫靶概率，可能看似健康的兩個(gè)寶寶——露露和娜娜，基因中存在我們目前未知的缺陷。這些缺陷基因是可以穩(wěn)定遺傳的。因?yàn)槲覀儾豢赡軇儕Z兩個(gè)孩子的生存權(quán)、隱私權(quán)和生育權(quán)，所以這種我們?nèi)祟惛就耆粗娜毕莼蚝苡?/p>