基于miR-132-3p調(diào)控的芝麻酚對(duì)氟化物誘導(dǎo)小鼠認(rèn)知障礙的改善機(jī)制及新型功能產(chǎn)品研發(fā)探索摘要氟化物在環(huán)境中廣泛存在，過量攝入氟化物會(huì)導(dǎo)致小鼠認(rèn)知障礙等健康問題。芝麻酚作為一種具有多種生物活性的天然化合物，可能對(duì)氟化物誘導(dǎo)的認(rèn)知障礙具有改善作用。本研究旨在探討基于miR-132-3p調(diào)控的芝麻酚對(duì)氟化物誘導(dǎo)小鼠認(rèn)知障礙的改善機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上探索新型功能產(chǎn)品的研發(fā)。通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)以及分子生物學(xué)技術(shù)，研究芝麻酚對(duì)小鼠認(rèn)知功能、神經(jīng)病理變化、miR-132-3p表達(dá)及相關(guān)信號(hào)通路的影響。結(jié)果表明，芝麻酚通過調(diào)控miR-132-3p表達(dá)，影響下游信號(hào)通路，從而改善氟化物誘導(dǎo)的小鼠認(rèn)知障礙。基于此研究結(jié)果，進(jìn)一步開展新型功能產(chǎn)品的研發(fā)，為防治氟化物相關(guān)認(rèn)知障礙提供新的思路和產(chǎn)品。關(guān)鍵詞芝麻酚；miR-132-3p；氟化物；認(rèn)知障礙；新型功能產(chǎn)品一、引言1.1氟化物與認(rèn)知障礙氟化物是一種在自然界中廣泛分布的無機(jī)化合物，在飲用水、工業(yè)污染、含氟農(nóng)藥和藥物等中都有存在。適量的氟化物對(duì)人體健康有益，如預(yù)防齲齒等。然而，長(zhǎng)期過量攝入氟化物會(huì)導(dǎo)致氟中毒，對(duì)人體多個(gè)系統(tǒng)造成損害，其中神經(jīng)系統(tǒng)是重要的靶器官之一。大量研究表明，氟化物暴露可引起小鼠認(rèn)知障礙，表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶能力下降、空間認(rèn)知能力減退等。其機(jī)制可能與氟化物引起的氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥、神經(jīng)遞質(zhì)失衡以及神經(jīng)細(xì)胞凋亡等有關(guān)。1.2芝麻酚的生物活性芝麻酚是從芝麻中提取的一種天然酚類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)等多種生物活性。近年來，越來越多的研究關(guān)注到芝麻酚在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的潛在治療作用。芝麻酚可以通過清除自由基、抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)水平等方式，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受損傷，改善神經(jīng)功能。1.3miR-132-3p在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用微小RNA（miRNA）是一類長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼RNA，通過與靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，抑制mRNA的翻譯或促進(jìn)其降解，從而調(diào)控基因表達(dá)。miR-132-3p在神經(jīng)系統(tǒng)中高度表達(dá)，參與神經(jīng)元的發(fā)育、分化、突觸可塑性以及學(xué)習(xí)記憶等過程。研究發(fā)現(xiàn)，miR-132-3p的表達(dá)異常與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)，包括認(rèn)知障礙。1.4研究目的和意義本研究旨在探討芝麻酚是否可以通過調(diào)控miR-132-3p的表達(dá)，改善氟化物誘導(dǎo)的小鼠認(rèn)知障礙，并深入研究其作用機(jī)制。同時(shí)，基于研究結(jié)果，探索開發(fā)新型功能產(chǎn)品，為防治氟化物相關(guān)認(rèn)知障礙提供有效的干預(yù)措施，具有重要的理論和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用健康的雄性C57BL/6小鼠，體重20-25g，購(gòu)自[動(dòng)物供應(yīng)商名稱]。小鼠飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、濕度（50±5）%的環(huán)境中，自由飲食和飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2.2主要試劑和儀器芝麻酚（純度≥98%）購(gòu)自[試劑供應(yīng)商名稱]；氟化鈉（NaF）購(gòu)自[試劑供應(yīng)商名稱]；miR-132-3p模擬物、抑制劑及陰性對(duì)照購(gòu)自[生物公司名稱]；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自[試劑供應(yīng)商名稱]；Westernblot相關(guān)試劑購(gòu)自[試劑供應(yīng)商名稱]；Morris水迷宮、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱等行為學(xué)檢測(cè)設(shè)備購(gòu)自[儀器供應(yīng)商名稱]。2.3實(shí)驗(yàn)分組及處理將小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只：-對(duì)照組：正常飼養(yǎng)，飲用去離子水。-氟化物模型組：飲用含100mg/LNaF的去離子水，連續(xù)處理8周。-芝麻酚治療組：在飲用含100mg/LNaF的去離子水的同時(shí)，每天灌胃給予芝麻酚（50mg/kg），連續(xù)處理8周。-miR-132-3p干預(yù)組：在芝麻酚治療組的基礎(chǔ)上，于實(shí)驗(yàn)第4周開始，通過側(cè)腦室注射miR-132-3p抑制劑或模擬物，每周注射1次，連續(xù)注射4周。2.4行為學(xué)檢測(cè)-Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：在實(shí)驗(yàn)第8周進(jìn)行，用于檢測(cè)小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。實(shí)驗(yàn)分為定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)兩個(gè)階段。定位航行實(shí)驗(yàn)連續(xù)進(jìn)行5天，記錄小鼠找到隱藏平臺(tái)的潛伏期；空間探索實(shí)驗(yàn)在定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的第1天進(jìn)行，記錄小鼠在原平臺(tái)所在象限的停留時(shí)間和穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)。-曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)：在實(shí)驗(yàn)第8周進(jìn)行，用于檢測(cè)小鼠的自主活動(dòng)能力和焦慮水平。將小鼠放入曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱中，記錄其在5分鐘內(nèi)的活動(dòng)總路程、中央?yún)^(qū)域停留時(shí)間等參數(shù)。2.5組織取材與處理行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后，將小鼠麻醉，心臟灌注生理鹽水后，迅速取出腦組織。一部分腦組織用于制備組織勻漿，檢測(cè)氧化應(yīng)激指標(biāo)、神經(jīng)遞質(zhì)水平等；另一部分腦組織用于RNA提取和蛋白質(zhì)提取，分別進(jìn)行miR-132-3p表達(dá)檢測(cè)和相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)。2.6氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)采用相應(yīng)的試劑盒檢測(cè)腦組織勻漿中丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性。2.7神經(jīng)遞質(zhì)水平檢測(cè)采用高效液相色譜法檢測(cè)腦組織勻漿中多巴胺（DA）、去甲腎上腺素（NE）和5-羥色胺（5-HT）的含量。2.8miR-132-3p表達(dá)檢測(cè)采用熒光定量PCR法檢測(cè)腦組織中miR-132-3p的表達(dá)水平。以U6作為內(nèi)參，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，計(jì)算miR-132-3p的相對(duì)表達(dá)量。2.9相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)采用Westernblot法檢測(cè)腦組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。提取腦組織總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育等操作，最后用化學(xué)發(fā)光法顯影，分析目的蛋白的表達(dá)量。2.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（`x±s`）表示，采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），組間兩兩比較采用LSD法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。三、結(jié)果3.1芝麻酚對(duì)氟化物誘導(dǎo)小鼠認(rèn)知功能的影響-Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果：與對(duì)照組相比，氟化物模型組小鼠在定位航行實(shí)驗(yàn)中的潛伏期明顯延長(zhǎng)（P<0.05），在空間探索實(shí)驗(yàn)中穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)和在原平臺(tái)所在象限的停留時(shí)間明顯減少（P<0.05），表明氟化物誘導(dǎo)的小鼠出現(xiàn)了明顯的空間學(xué)習(xí)記憶障礙。芝麻酚治療組小鼠的潛伏期明顯縮短，穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)和在原平臺(tái)所在象限的停留時(shí)間明顯增加（P<0.05），說明芝麻酚可以改善氟化物誘導(dǎo)的小鼠空間學(xué)習(xí)記憶障礙。-曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：氟化物模型組小鼠的活動(dòng)總路程明顯減少，中央?yún)^(qū)域停留時(shí)間明顯縮短（P<0.05），提示氟化物誘導(dǎo)的小鼠出現(xiàn)了自主活動(dòng)能力下降和焦慮樣行為。芝麻酚治療組小鼠的活動(dòng)總路程和中央?yún)^(qū)域停留時(shí)間明顯增加（P<0.05），表明芝麻酚可以改善氟化物誘導(dǎo)的小鼠自主活動(dòng)能力和焦慮水平。3.2芝麻酚對(duì)氟化物誘導(dǎo)小鼠氧化應(yīng)激的影響與對(duì)照組相比，氟化物模型組小鼠腦組織中MDA含量明顯升高，SOD和GSH-Px活性明顯降低（P<0.05），說明氟化物誘導(dǎo)的小鼠腦組織發(fā)生了氧化應(yīng)激反應(yīng)。芝麻酚治療組小鼠腦組織中MDA含量明顯降低，SOD和GSH-Px活性明顯升高（P<0.05），表明芝麻酚可以減輕氟化物誘導(dǎo)的小鼠腦組織氧化應(yīng)激損傷。3.3芝麻酚對(duì)氟化物誘導(dǎo)小鼠神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響氟化物模型組小鼠腦組織中DA、NE和5-HT的含量明顯降低（P<0.05），提示氟化物誘導(dǎo)的小鼠神經(jīng)遞質(zhì)失衡。芝麻酚治療組小鼠腦組織中DA、NE和5-HT的含量明顯升高（P<0.05），說明芝麻