乙型肝炎病毒(HBVDNAPCRABI7300)檢側(cè)原則操作程序

一、INFORMATIONFORTEST檢測(cè)信息

項(xiàng)目名稱乙型肝炎病毒核酸

措施聚合酶鏈反應(yīng)

措施根據(jù)衛(wèi)生部《全國(guó)臨床檢查操作規(guī)程》第三版(2023)

弟七扁弟八早弟一*"P

二、ANALYTICALPRINCTPLE檢測(cè)原理

聚臺(tái)酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)可對(duì)特定核甘酸片段進(jìn)行指數(shù)級(jí)出J擴(kuò)增,

而實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，運(yùn)

用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最終通過(guò)原則曲線對(duì)未知模

板進(jìn)行定量分析日勺措施。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)中，引入了一種熒

光化學(xué)物質(zhì)，熒光物質(zhì)有兩種：熒光探針和熒光染料。我們目前是使

用TaqMan熒光探針的檢測(cè)原理：PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同步

加入一種特異性日勺熒光探針，該探針為一寡核甘酸，兩端分別標(biāo)識(shí)一

種匯報(bào)熒光基團(tuán)和一種淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí):匯報(bào)基團(tuán)發(fā)射H勺

熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸?。籔CR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶口勺5，-3,外切酶活

三、操作環(huán)節(jié)

（-）試劑配制

1、進(jìn)入試劑準(zhǔn)備區(qū)，啟動(dòng)冰箱冷凍層取出HBV-DNA檢測(cè)試劑盒。查

看外包裝盒（包括生產(chǎn)批號(hào)、有效期），無(wú)誤后拆開試劑盒，取出核酸

提取液、反應(yīng)液及Taq酶（查對(duì)核酸提取液、HBVPCR反應(yīng)液及Taq酶

管上批號(hào)與試劑外包裝盒批號(hào)與否一致）（圖1）,不一致則不可使用，

需更換新備用。

核

對(duì)

批

號(hào)

及

有

效

圖1期

2、核酸提取液的分裝

（1）取0.5ml離心管架置于超凈工作臺(tái)內(nèi)（開機(jī)前用紫外線消毒30

分鐘），用右手拿起鑲子逐一將離心管放入離心管架（注意應(yīng)夾住離

心管外壁，不能碰到管內(nèi)壁），擺放次序?yàn)闄M列從左往右擺，豎列為

從上往下隔行排，離心管個(gè)數(shù)為n（n=樣本數(shù)+對(duì)照品+質(zhì)控品）。完畢

后將鑲子放回原位（圖2）。

管需朝前

（2）用移液器精確吸取核酸提取液50ul分裝至0.5ml離心管中（左

上角第一排開始，從左住右依次加入）。因核酸提取液內(nèi)含固體沉淀

顆粒物，為使顆粒均勻分布，故每次取樣時(shí)都要用移液器反復(fù)吸打

3-4次（圖3）。分裝完畢后將移液器量程歸位。

每批需設(shè)置空白對(duì)照、陰性對(duì)照、臨界陽(yáng)性對(duì)照（同步檢測(cè)低值

陽(yáng)性質(zhì)控品，則無(wú)需再檢測(cè)臨界陽(yáng)性對(duì)照）、陽(yáng)性質(zhì)控品、陽(yáng)性原則

品。所需每批需配制數(shù)n二樣本數(shù)+對(duì)照品邛日性原則品+質(zhì)控品，每個(gè)

測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：

試劑HBVPCR反應(yīng)液Taq酶

用量（ul）35.70.3

（1）每盒HBV-DNA試劑可檢測(cè)32人份，根據(jù)每日需檢測(cè)標(biāo)本份數(shù)計(jì)

算出每批所需HBVPCR反應(yīng)液和Taq酶用量（例有111人份需要進(jìn)行

檢測(cè)，則有3盒試劑可直接使用10ul移液器將Taq酶加入HBVPCR

反應(yīng)液中，另有111-3*32=15人份試劑需將HBVPCR反應(yīng)液和Taq酶

使用移液器按反應(yīng)體系比例吸取至1.5nli離心管中配制（圖5）。

（2）取出離心后備用日勺HBVPCR反應(yīng)液和Taq酶，按上述規(guī)定配制

后用旋渦振蕩器振蕩混勻5-10sec,然后再用離心機(jī)2023rpm離心

lOsec備用（圖6）。

（3）從操作臺(tái)面上拿取HBV-DHA試劑配制盒（可選用空余的200ul槍

頭盒）至超凈工作臺(tái)內(nèi)，打開配制盒并用記號(hào)筆在對(duì)應(yīng)的孔位右旁按

次序編號(hào)（圖7）o編號(hào)規(guī)則為：樣本擴(kuò)增反應(yīng)管對(duì)應(yīng)口勺孔位按對(duì)應(yīng)

的樣本流水號(hào)編寫、陽(yáng)性質(zhì)控品反應(yīng)管對(duì)應(yīng)的孔位編“Q”（如有高值

則標(biāo)為H,低值為L(zhǎng)）,陰性對(duì)照品孔位編臨界陽(yáng)性對(duì)照對(duì)應(yīng)時(shí)

孔位編"土"，空白對(duì)照對(duì)應(yīng)口勺孔位編“B”，1號(hào)原則品對(duì)應(yīng)K、J孔位

編“S1”，2號(hào)原則品對(duì)應(yīng)的孔位編“S2”，依此類推。

（4）編號(hào)完畢后，用右手拿起鎰子夾起反應(yīng)管（ABI7300使用口勺是八

聯(lián)一薄壁反應(yīng)管，鐐子應(yīng)夾住反應(yīng)管外壁，不可接觸到內(nèi)壁。按（圖

（5）從離心機(jī)中取出已混好Taq酶的PCR反應(yīng)液，用移液器（量程調(diào)

至36ul）,精確吸取反應(yīng)液并按從上到下、從左至右的次序依次加至

反應(yīng)管中，注意：吸頭應(yīng)深入到反應(yīng)管底部，放液時(shí)應(yīng)緩慢，切勿形

成氣泡（圖9）o所有加樣完畢后將配制盒通過(guò)傳遞窗轉(zhuǎn)移至樣本處

理區(qū)。

（-）標(biāo)本處理

1、標(biāo)本、質(zhì)控品及對(duì)照品的處理

（1）從冰箱冷凍室取出HBVDNA陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性對(duì)照品，室溫平

衡20min待其完全融化。

（2）查對(duì)標(biāo)本和原始申請(qǐng)單日勺條形碼和檢查項(xiàng)目，無(wú)誤后依次粘貼

上對(duì)應(yīng)時(shí)流水號(hào)，如

ADICON

P0001

2、從傳遞窗中取出試劑準(zhǔn)備辨別裝好核酸提取液的離心管架，移至

生物安全柜內(nèi)在管蓋上用記號(hào)筆寫上阿拉伯?dāng)?shù)字1、2、3........

陽(yáng)性質(zhì)控管標(biāo)上“Q”（如有高值則標(biāo)為H,低值為L(zhǎng)）,陰性對(duì)照管標(biāo)

上“-"，臨界陽(yáng)性對(duì)照管標(biāo)上“土'，。離心管蓋上標(biāo)識(shí)的是1,就表

達(dá)該管要加入流水號(hào)為P0001日勺標(biāo)本（圖10）。

注意：每個(gè)離心管的編號(hào)方向都應(yīng)朝向管口啟動(dòng)日勺方向。（圖11）

3、清除標(biāo)本管蓋：將標(biāo)本從前處理取至標(biāo)本準(zhǔn)備區(qū)，按排列次序依

次清除樣本管上口勺橡膠塞。詳細(xì)操作為：在生物安全柜中，左手拿起

血清管并固定，右手拇指和中指涅緊橡膠塞，右手食指輕輕頂住橡膠

塞頂部凹面，逆時(shí)針?lè)较蜉p輕旋下橡膠塞后廢棄于裝有消毒液的垃極

桶（圖12）o（注意：手指切勿接觸到血清管口或碰觸到血清，如手

4、樣本及對(duì)照品的處理：

a、左手拿起樣本，用量程為200ul調(diào)至50ul日勺移液器精確吸取樣本

（注：為保證樣本的均一性和吸樣精確，每次取樣時(shí)需用移液器將樣

本吸打3-5次；吸樣時(shí)移液器套筒不可接觸到樣本管內(nèi)壁）（圖13）

b.吸樣完畢后，將樣本管放至另一試管架中（切勿不可將樣本放回原

c.再用左手按前面所述樣本流水號(hào)和離心管編號(hào)時(shí)對(duì)應(yīng)關(guān)系拿起對(duì)

應(yīng)出J離心管，打開離心管蓋（注：?jiǎn)问植僮?，食指和中指固定離心管，

拇指稍向后上方發(fā)力打開管蓋，手指切勿碰到離心管口和管蓋內(nèi)側(cè)）

（圖⑸。

d,管蓋完全打開后，用左手食指、拇指和中指固定離心管，將吸頭中

的樣本所有打入離心管底部，輕輕吸打混勻3-5次。（圖16）

e.加樣完畢后棄槍頭干盛有消毒液的垃極桶中（注：一種吸頭只能用

于一種樣本日勺吸樣，嚴(yán)禁使用一種吸頭反復(fù)吸取不一樣樣本）。同步

蓋上離心管蓋并放回離心管架（放回的位置需另起一行，切不可放回

f.待一架離心管所有加樣完畢后用振蕩混勻器充足振蕩混勻10T5

秒。

g.左手將混勻后日勺離心管轉(zhuǎn)移至恒溫金屬浴上（注：離心管需對(duì)稱時(shí)

放置在恒溫金屬浴相匹配日勺孔槽內(nèi)），用計(jì)時(shí)器計(jì)時(shí)，100℃誤差不超

過(guò)±1℃）干浴lOmin（誤差不超過(guò)±30sec）。（圖18）

干浴時(shí)用離心管架置于加熱日勺離心管上，防止離心管蓋因加熱爆開導(dǎo)

致標(biāo)本間的污染,Ms、

h.十分鐘后（前后不超過(guò)半分鐘），右手用攝子夾起橡皮墊從恒溫金

屬浴中拿出離心管（圖20）o

I.將上述離心管按次序?qū)ΨQ放入低溫高速離心機(jī)轉(zhuǎn)子孔內(nèi)，擺放離心

管時(shí)要將離心管開口朝內(nèi)，蓋上轉(zhuǎn)子蓋及離心機(jī)蓋后，12,000rpni離

21)o對(duì)稱擺放

開口朝內(nèi)

j.待離心結(jié)束后，取出離心管并按編號(hào)次序依次擺放在離心管架上

（參照（圖10）的排列方式）并4'C冰箱保留備用；若當(dāng)天不使用，

則應(yīng)保留在一20,C條件下，使用前置室溫平衡20min,再以12,OOOrpm

離心lOmin。

5、待所有樣本加樣完畢更換手套，左手用鐐子夾起反應(yīng)管蓋的一側(cè)

的延伸段（不要碰到管蓋）,然后用右手大拇指從左住右依次蓋緊管蓋

（不要碰到其他未蓋的反應(yīng)管口）（如圖