ICS65.020.30

CCSB44

2201

長春市地方標準

DB2201/T20—2022

梅花鹿胚胎移植技術規(guī)范

Technicalspecificationforembryotransferofsikadeer

2022-01-14發(fā)布2022-01-30實施

長春市市場監(jiān)督管理局??發(fā)布

DB2201/T20—2022

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

本文件的某些內容可能涉及專利，本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。

本文件由長春市農業(yè)農村局提出并歸口。

本文件起草單位：長春市農業(yè)科學院、長春市乾藝生物科技研究院、長春市頌祥牧業(yè)科技有限公司。

本文件主要起草人：田來明、崔鶴馨、權心嬌、付曉霞、李男、陳琦、葉飛、呂文發(fā)、魏海軍、劉

磊、張鴻、祝春玲、張事銘、呂鐵峰、沈金龍。

I

DB2201/T20—2022

梅花鹿胚胎移植技術規(guī)范

1范圍

本文件規(guī)定了胚胎移植的基本要求、前期準備、胚胎移植、妊娠檢查和記錄的要求。

本文件適用于梅花鹿胚胎生產和移植技術操作。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

DB22/T2611-2017梅花鹿冷凍精液

3術語和定義

下列術語和定義適用于本文件。

3.1

胚胎移植embryotransfer

將良種母鹿體內早期胚胎或體外受精及其他方式獲得的早期胚胎，移植到同種生理狀態(tài)相同的受體

母鹿體內，使之繼續(xù)發(fā)育成個體的技術。

3.2

供體鹿donor

在胚胎移植過程中提供胚胎的母鹿。

3.3

受體鹿recipient

在胚胎移植過程中接受胚胎的母鹿。

3.4

同期發(fā)情synchronizationofestrus

利用某些激素制劑人為地控制并調整母鹿在預定時間內集中發(fā)情。

3.5

陰道栓vaginalsuppository

一種內含孕酮、用特制的放置器將其放入陰道穹隆的同期發(fā)情裝置。

3.6

超數(shù)排卵multipleovulation

在母鹿發(fā)情周期的適當時間，應用外源促性腺激素處理，使卵巢比自然發(fā)情時有更多的卵泡發(fā)育并

排卵，簡稱為“超排”。

3.7

人工授精artificialinsemination

2

DB2201/T20—2022

用人工方法適時將精液輸入發(fā)情母鹿宮頸內達到受孕，以代替公母鹿交配而繁衍后代的一種繁殖方

法。

3.8

冷凍精液frozensemen

鮮精液經人工處理后在液氮中（-196℃）冷凍保存的精液。

4基本要求

4.1供體和受體母鹿應為同一屬種。

4.2供體鹿和受體鹿發(fā)情時間相差不應超過24h。

4.3從供體鹿輸卵管內收集到的胚胎應移植到受體鹿的輸卵管內，從供體鹿子宮角內收集到的胚胎應

移植到受體鹿的子宮角內。

4.4胚胎發(fā)育應處于周期黃體期內。

4.5供體鹿和受體鹿的比例應為1:5～1:6。

5前期準備

5.1供體鹿和受體鹿選擇

5.1.1供體鹿選擇

5.1.1.1品種優(yōu)良，生產性能好。

5.1.1.2遺傳性能穩(wěn)定，譜系完整。

5.1.1.3體質健壯，無遺傳疾病、生殖疾病和傳染性疾病。

5.1.1.4產歷清楚，無流產史，性周期正常，繁殖機能好的適齡成年母鹿。

5.1.2受體鹿選擇

5.1.2.1健康、營養(yǎng)狀況良好，無遺傳疾病、生殖疾病和傳染性疾病。

5.1.2.2繁殖性能良好，發(fā)情周期正常，母性和哺乳能力良好，無流產史，產后60d以上的經產母

鹿。

5.2同期發(fā)情

5.2.1供體鹿

空懷母鹿在任意一天放入含有孕激素的陰道栓，12d后撤掉，同時肌肉注射孕馬血清促性腺激

素（PMSG）300IU～350IU。

5.2.2受體鹿

5.2.2.1空懷母鹿同期處理之前應進行直腸觸摸或超聲波檢查，檢查卵巢是否有周期性黃體。

5.2.2.2操作步驟同5.2.1。

5.2.2.3同期發(fā)情處理后，密切觀察，通過直腸觸摸或超聲波檢查卵泡發(fā)育狀態(tài)，觀察發(fā)情。

3

DB2201/T20—2022

5.2.3發(fā)情鑒定

陰道栓取出后12h開始用試情公鹿每隔2h～4h試情一次，每次持續(xù)0.5h～1h。母鹿

穩(wěn)定接受爬跨即為發(fā)情。記錄母鹿接受爬跨的時間。

5.3供體鹿超數(shù)排卵

放置陰道栓當天記為第0d，放陰道栓第9d開始注射促卵泡素（FSH），每天注射兩次間隔12h，

早晚各1次，4天8次減量注射。到第12d～13d結束，共注射320mgFSH。第7次注射FSH

時取出陰道栓。

5.4人工授精

5.4.1冷凍精液品質

應符合DB22/T2611的規(guī)定。

5.4.2操作步驟

5.4.2.1精液準備：細管凍精空氣浴后，應用38℃±2℃溫水直接浸泡解凍，不超過10min；

5.4.2.2確認母鹿發(fā)情接受爬跨后，進行輸精；

5.4.2.3保定母鹿，外陰應清洗消毒；

5.4.2.4把精液裝入無膠塞注射器，并連接輸精管，排出空氣，凍精的劑量為2支/頭；

5.4.2.5抹無菌潤滑劑，手持輸精管緩慢插入母鹿陰道內，小心通過子宮頸插入子宮體，推入精液，

將輸精管緩慢退出，完成輸精。

6胚胎移植

6.1手術沖胚

6.1.1時間

應在供體母鹿第一次配種后6d～7d。

6.1.2器材

沖胚管及內芯、鈍性9#或12#針頭、止血鉗、注射器、培養(yǎng)皿、量筒、毛剪、鑷子、手術刀、

手術縫合針和縫合線、創(chuàng)布、止血紗布、體式顯微鏡、恒溫板等。

6.1.3藥品

新潔爾滅、0.9%生理鹽水、胚胎保存液（Holding液）、酒精、碘伏、青霉素、鏈霉素、石蠟油、

麻醉藥、解麻藥等。

6.1.4沖胚液的配置

杜氏磷酸鹽緩沖液（PBS），配方參見附錄A?；蛘呤褂蒙唐窙_胚液。

6.1.5步驟

4

DB2201/T20—2022

6.1.5.1供體母鹿應在術前24h內禁食禁水，手術在沖胚室進行。

6.1.5.2供體母鹿應進行全身麻醉，呈前低后高仰臥保定。

6.1.5.3麻醉后的母鹿應進行術部備皮，用溫水清洗，5%碘酊和75%酒精消毒。

6.1.5.4在腹部中線距乳房約4cm處做一切口，將兩側子宮角和輸卵管暴露，觀察左右卵巢上的黃

體發(fā)育情況并記錄。

6.1.5.5在子宮角大彎處鈍性穿孔約2mm，插入沖胚管，由充氣管注入5mL左右空氣，使氣囊封阻

子宮腔；輸卵管近子宮端用帶膠管的止血鉗做封閉，在子宮角和輸卵管結合部的子宮角端插入鈍性9#

或12#針頭作為接胚管，將10mL～30mL沖胚液（35℃～37℃）緩慢注入沖胚管，同時接收

胚胎，收集于培養(yǎng)皿（直徑90mm）中，放氣后取下沖胚管。

6.1.5.6將子宮角放回體內，并用0.9%的生理鹽水進行沖洗，并注入2mL石蠟油以防止生殖道連。

6.1.5.7縫合傷口，撒抗生素（青霉素和鏈霉素），并在術后的3d內每天注射2次青霉素（8000000

IU/次）。

6.2胚胎

6.2.1胚胎質量鑒定

6.2.1.1檢胚

在實驗室（檢胚室）內20℃～25℃常溫下，將沖胚后回收液平皿放在30℃的恒溫板上，置于體

式顯微鏡下，劃分區(qū)域，按從左到右、從上到下的“Z”路線進行檢查。檢出的胚胎用吸卵器及時移入PBS

中進行鑒定，確定受精與否及胚胎發(fā)育階段。

6.2.1.2分級

6.2.1.1配種后6d～7d的供體鹿，處于以下發(fā)育期：桑椹胚（M）、致密桑椹胚（CM）、早期囊胚

（EB）、囊胚（B）或擴張囊胚（EXB）。

6.2.1.2按形態(tài)學將胚胎劃分為1、2、3、4四個等級，1、2級胚胎為可用胚胎，3、4級為不可用胚

胎。

a)1級：發(fā)育正常，胚齡與發(fā)育期一致，胚胎細胞團成均勻對稱的球形，輪廓清晰，分裂球大小

均勻，結構緊湊，色調和透明度適中，無游離的細胞和液泡，或很少，變性細胞比例少于10%；

b)2級：胚齡與發(fā)育期基本一致，輪廓清晰，分裂球大小基本一致，色調和透明度及細胞密度良

好，可見到一些游離的細胞和液泡，變性細胞占10%～30%；

c)3級：胚齡與發(fā)育期不太一致，輪廓不清晰，色調過暗或過淡，細胞密度小，結構較松散，游離

的細胞或液泡較多，變性細胞達30%～50%；

d)4級：發(fā)育階段遲緩、細胞不均勻、變性細胞占胚胎大部分；未受精卵。

6.2.2冷凍保存和解凍

6.2.2.1冷凍保存

6.2.2.1.1器具

實體顯微鏡、胚胎冷凍儀、液氮罐、細管、胚胎吸管、0.22μm過濾器、培養(yǎng)皿、記號筆等。

6.2.2.1.2保存液與冷凍液

5

DB2201/T20—2022

保存液：含有20%犢牛血清(CS)的PBS液。

冷凍液：8%乙二醇（EG）＋0.1mol/L海藻糖（Tre.）＋m-PBS＋20%CS，用0.22μm濾器過濾滅

菌分裝。

6.2.2.1.3胚胎裝管

胚胎應在保存液微滴中清洗4次，后在冷凍液微滴中清洗4次。將胚胎吸入0.25mL細管內，

用封口機封口、分類、標記，在4℃的冰箱內放置平衡10min～15min后放入冷凍儀。

6.2.2.1.4胚胎冷凍保存

胚胎冷凍儀溫度調至-6℃～-7℃，保持2min后進行人工植冰，繼續(xù)保持至10min，以

0.3℃/min的速率降溫至-35℃～-38℃，保持10min后，直接放入液氮罐中保存，并定期檢查

和加液氮。

6.2.2.2解凍

從液氮中取出裝有胚胎的細管，空氣浴10s后32℃～35℃水浴10s，用消毒紙擦干細管，

再用半干的酒精棉球擦拭細管表面，晾干，剪開細管封口端(如用細管塞封口的則拔出即可)，細管棉塞

端朝里裝入移植槍供移植。應在解凍后10min內完成移植。

6.3移植

6.3.1器具

手術刀、手術縫合針和縫合線、腹腔內窺鏡、宮頸鉗、鈍性9#針頭、移胚針等。

6.3.2藥品

胚胎保存液（Holding液）、5%碘酊、黃體酮、青霉素和鏈霉素等。

6.3.3步驟

6.3.3.1受體鹿術前準備同6.1.5.1、6.1.5.2和6.1.5.3的處理方法。

6.3.3.2在乳房前方腹中線兩側各切開一個0.5cm～1cm長的小口，一側插入打孔器和腹腔鏡，另

一側插入宮頸鉗。通過腹腔鏡和宮頸鉗相互配合觀察受體鹿的卵巢狀態(tài)，記錄黃體數(shù)目。

6.3.3.3將卵巢上有1～3個黃體側的子宮角取出，在子宮角的上1/3部位用鈍性9#針頭穿刺，用

移胚針在穿孔處移胚。

6.3.3.4受體鹿創(chuàng)口各縫1針，外涂5%碘酊。

7妊娠檢查

應在移植結束后90d采用超聲波法檢查，確認母鹿是否懷孕以及胎兒發(fā)育情況。

8記錄

胚胎移植過程中應記錄供體鹿超數(shù)排卵、輸精、沖胚、受體鹿移植情況,記錄內容可參考附錄B。

6

DB2201/T20—2022

AA

附錄A

（資料性）

杜氏磷酸鹽緩沖液（PBS）配方

杜氏磷酸鹽緩沖液（PBS）配方見表A.1。

表A.1杜氏磷酸鹽緩沖液（PBS）配方表

成分劑量（g/L）

NaCl8.00

KCl0.20

Na2HPO4（Na2HPO4·12H2）1.5（2.916）

CaCl2（CaCl2·2H2O）0.10（0.132）

KH2PO40.20

MgCl2（MgCl2·6H2O）0.10（0.2133）

丙酮酸鈉0.36g

葡萄糖（葡萄糖·H2O）1.00(1.10）g

青霉素0.075g

鏈霉素0.05g

注1：配制PBS的所用藥品必須是分析純以上的化學試劑。也可使用進口成品PBS粉劑，詳見產品使用說明書。

注2：配用PBS所用水是阻值超過18MΩ的超純水。

注3：配好的沖卵液需滅菌，pH為7.2～7.6，滲透壓為270mOs～290mOs,4℃低溫保存。

7

DB2201/T20—2022

BB

附錄B

（資料性）

梅花鹿胚胎移植記錄

B.1梅花鹿胚胎移植前期記錄

梅花鹿胚胎移植前期記錄見表B.1。

表B.1梅花鹿胚胎移植前期記錄

養(yǎng)殖場：供體號：品種：

出生時間（年齡）：斷奶時間：胎次：

發(fā)情狀況：

同期發(fā)情

陰道栓：批號：總劑量：

放栓時間：撤栓時間：

促排藥：注射時間：劑量：

發(fā)情時間：發(fā)情表現(xiàn)：

超排處理

激素：批號：總劑量：

早:早：

第一天第二天

晚：晚：

早:早：

第三天第四天

晚：晚：

早：早：

第五天第六天

晚：晚：

人工授精

第1次：

耳號精液品質授精時間第2次：

第3次：

8

DB2201/T20—2022

B.2供體鹿沖胚記錄

供體鹿沖胚記錄見表B.2。

表B.2供體鹿沖胚記錄

供體號胎次沖胚時間

胚胎總數(shù)