ICS65.020.20

CCSB05

13

河北省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB13/T6010—2024

番茄抗病種質(zhì)資源一年多代快速培育

技術(shù)規(guī)程

2024-10-28發(fā)布2024-11-28實施

河北省市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB13/T6010—2024

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)

定起草。

本文件由河北省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出。

本文件起草單位：河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所、河北省農(nóng)業(yè)項目規(guī)劃中心。

本文件主要起草人：李亞棟、吳志明、楊靖、田哲娟、康忱、高亢、高慧敏。

I

DB13/T6010—2024

番茄抗病種質(zhì)資源一年多代快速培育技術(shù)規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了番茄抗病種質(zhì)資源一年多代快速培育的前期準(zhǔn)備、幼胚成苗、分子標(biāo)記輔助選擇、

種植期溫光調(diào)控等技術(shù)要求。

本文件適用于番茄抗病種質(zhì)資源一年多代的快速培育。

2規(guī)范性引用文件

本文件沒有規(guī)范性引用文件。

3術(shù)語和定義

本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。

4縮略語

下列縮略語適用于本文件：

KASP：競爭性等位基因特異性PCR（KompetitiveAlleleSpecificPCR）

SDS：十二烷基硫酸鈉（Sodiumdodecylsulfate）

TYLCVD：黃化曲葉病毒?。═omatoyellowleafcurlvirusdisease）

ToMVD：番茄花葉病毒?。═omatomosaicvirusdisease）

TSWVD：番茄斑萎病毒?。═omatospottedwiltvirusdisease）

FCRR：鐮刀菌頸腐根腐?。‵usariumcrownandrootrotdisease）

RKN：根結(jié)線蟲（Root-knotnematode）

5前期準(zhǔn)備

5.1儀器、藥品

超凈工作臺、熒光定量PCR儀、熒光定量PCR試劑盒等，其他常用實驗儀器、藥品見附錄Ａ。

5.2番茄種植所需設(shè)施、生產(chǎn)資料

5.2.1主要設(shè)施

光照培養(yǎng)室、人工氣候室或日光溫室。

5.2.2生產(chǎn)資料

育苗基質(zhì)、穴盤、穴盤托等，有機(jī)肥、復(fù)合肥、磷酸二氫鉀等常用肥料，百菌清、吡蟲啉、菊酯

類等常用抑菌防蟲藥物。

6幼胚成苗

6.1果實采集

從番茄植株上采集授粉后25d的果實備用。

6.2幼胚采集

6.2.1果實表面消毒

1

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在超凈工作臺內(nèi)，將采集的果實浸泡在75%的酒精中10min進(jìn)行表面消毒。

6.2.2取幼胚

用消毒后的手術(shù)刀切開果皮，從果肉中將未成熟種子自胎座上剝離。

6.2.3清洗

用滅菌的蒸餾水洗去未成熟種子表面的果肉殘渣。

6.3幼胚培養(yǎng)

將清洗過的未成熟種子平鋪在1/2MS培養(yǎng)基上，放置于溫度28℃、光照/黑暗=16h/8h的條件

下培養(yǎng)約5d。

6.4移栽煉苗

將發(fā)芽種子移栽到穴盤內(nèi)，加透明罩子保濕。7d后打開罩子煉苗，幼苗生長至三葉一心期，備

用。

7分子標(biāo)記輔助選擇

7.1DNA提取

采集番茄幼苗葉片，采用常規(guī)的SDS方法或商業(yè)試劑盒提取DNA。

7.2分子標(biāo)記檢測

7.2.1主要抗病基因的分子標(biāo)記引物

針對番茄TYLCVD、ToMVD、TSWVD、FCRR和RKN等病害，應(yīng)用表1給出的KASP引物，對番茄種質(zhì)資源

的抗病基因進(jìn)行分子標(biāo)記檢測。

表1KASP引物及基因分型判斷標(biāo)準(zhǔn)

抗病基因引物名稱引物序列（5′–3′）等位基因抗病類型

Ty-1-Allele-F1GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAATATGGTAAAGGTGCATCCAGAA:A抗病

Ty-1Ty-1-Allele-F2GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAATATGGTAAAGGTGCATCCAGTT:T感病

Ty-1-RCCGTTGATTGAAGAAATTGATG

Mi-1-Allele-R1GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGATGTTTACAAGTATTTGTGGCGG:G抗病

Mi-1Mi-1-Allele-R2GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGATGTTTACAAGTATTTGTGGCAA:A感病

Mi-1-FTTCAGACGAAGTTAGACATAAAGGA

Tm-2-Allele-F1GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAATATGCTACAAGCCAAATTACTCC:C感病

Tm-22Tm-2-Allele-F2GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAATATGCTACAAGCCAAATTACTTT:T抗病

Tm-2-RGAAACAACTCCATAATGCAAATC

Frl-Allele-F1GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTAAAGGACCATTTTTCGTAGACCATTT:T感病

FrlFrl-Allele-F2GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTAAAGGACCATTTTTCGTAGACCATAA:A抗病

Frl-RATTTCTTACCATATGTGAAGAGAA

FP1SNP724GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCATGGACACAACTGGAGTTATTAA:A感病

Sw-5FP2SNP724GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCATGGACACAACTGGAGTTATTGG:G抗病

RPSNP724CAGTCATTCTTCAAATTTTACTTGT

注：下劃線部分為FAM熒光標(biāo)簽序列；雙下劃線部分為HEX熒光標(biāo)簽序列。

7.2.2KASP檢測技術(shù)

7.2.2.1反應(yīng)體系

2

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總體積為5μL：PCRMix（2×）2.5μL，DNA溶液（40ng～50ng·μL-1）0.5μL，正向引物1（10

μmol·L-1）0.075μL，正向引物2（10μmol·L-1）0.075μL，反向引物（10μmol·L-1）0.2μL，加

ddH2O補(bǔ)至5μL。

7.2.2.2反應(yīng)程序

94℃15min；94℃20s，65℃1min（10個循環(huán)，每循環(huán)下降0.8℃）；94℃20s，57℃1min，

共24個循環(huán)；57℃1min。終點法采集熒光信號。

7.2.2.3檢測結(jié)果

依據(jù)表1的判斷標(biāo)準(zhǔn)，將基因型分為純合抗病、純合感病和雜合型，選擇符合育種目標(biāo)的番茄

幼苗。以Ty-1為例，基因分型結(jié)果見圖1。

圖1Ty-1抗病基因檢測結(jié)果分型

8種植期溫光調(diào)控

8.1定植后管理

于三葉一心期進(jìn)行幼苗移栽，白天溫度22℃～24℃，夜間14℃～16℃；光照時間為12h～14h，

配置LED植物生長燈紅藍(lán)光(1R1B)：遠(yuǎn)紅光=3：1，光通量密度100±10μmol/m2·s。保持14d～18d，

至第一穗花現(xiàn)蕾。

8.2現(xiàn)蕾后管理

白天溫度24℃～26℃，夜間18℃～20℃。光照時間為13h～15h，配置LED植物生長燈白光：遠(yuǎn)

紅光=3：1，光通量密度120±10μmol/m2·s。保持8d～10d，至第一穗花可人工授粉。

8.3開花后管理

人工授粉后，白天溫度28℃～30℃，夜間18℃～20℃。光照時間為14h～16h，配置LED植物生

長燈白光或繼續(xù)保持白光：遠(yuǎn)紅光=3：1，光通量密度100±10μmol/m2·s。25天后，取果實進(jìn)行下

一世代幼胚培養(yǎng)。

3

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A

A

附錄A

（資料性）

實驗室常用儀器、器具