免疫學(xué)病原體檢測標(biāo)準(zhǔn)流程一、概述

免疫學(xué)病原體檢測是利用抗原抗體反應(yīng)等免疫學(xué)原理，對生物樣本中的特定病原體進(jìn)行定性或定量分析的技術(shù)。標(biāo)準(zhǔn)流程的建立旨在確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性和可重復(fù)性，適用于臨床診斷、公共衛(wèi)生監(jiān)測、科研等領(lǐng)域。本流程涵蓋樣本采集、處理、檢測、結(jié)果判讀及報(bào)告等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，需嚴(yán)格遵循操作規(guī)范。

二、標(biāo)準(zhǔn)流程

（一）樣本采集與處理

1.樣本類型選擇

(1)血清/血漿：適用于抗體檢測，如ELISA、化學(xué)發(fā)光法等。

(2)組織樣本：用于病理學(xué)檢測或原位雜交，需新鮮或固定保存。

(3)糞便/尿液：用于病原體抗原或核酸檢測，避免污染。

(4)呼吸道拭子：常用鼻咽拭子，采集時(shí)避免接觸采樣器頭端。

2.采集操作要點(diǎn)

(1)嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作，使用一次性采樣工具。

(2)按照標(biāo)準(zhǔn)劑量采集，如血清需3-5mL，拭子需旋轉(zhuǎn)擦拭至少10秒。

(3)標(biāo)記樣本管，注明采集時(shí)間、編號及患者信息（脫敏處理）。

3.樣本保存與運(yùn)輸

(1)血清樣本需室溫保存30分鐘以上，避免凍融。

(2)組織樣本立即固定于10%甲醛溶液或RNAlater溶液中。

(3)運(yùn)輸時(shí)使用冷藏箱（2-8℃），確保樣本在4小時(shí)內(nèi)到達(dá)實(shí)驗(yàn)室。

（二）檢測方法選擇與實(shí)施

1.檢測方法分類

(1)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）：用于抗體或抗原檢測，靈敏度高。

(2)化學(xué)發(fā)光免疫分析：適用于定量檢測，線性范圍寬。

(3)免疫熒光技術(shù)：通過熒光標(biāo)記抗體觀察細(xì)胞內(nèi)病原體。

2.操作步驟（以ELISA為例）

(1)試劑準(zhǔn)備：平衡酶標(biāo)板至室溫，稀釋標(biāo)準(zhǔn)品與樣本。

(2)加樣：依次加入樣本、酶標(biāo)抗體、底物溶液，每步需混勻。

(3)反應(yīng)條件：37℃孵育30分鐘，TMB顯色15-20分鐘。

(4)終止反應(yīng)：加入終止液，立即酶標(biāo)儀讀數(shù)。

3.質(zhì)量控制措施

(1)每板設(shè)置陰性對照、陽性對照及空白對照。

(2)使用已知濃度的質(zhì)控品，評估檢測線性范圍。

(3)定期校準(zhǔn)儀器，如酶標(biāo)儀的吸光度讀數(shù)誤差應(yīng)<1%。

（三）結(jié)果判讀與報(bào)告

1.定性/定量分析

(1)定性：根據(jù)cut-off值判斷結(jié)果（陽性/陰性）。

(2)定量：繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣本濃度（如抗體滴度≥1:64為陽性）。

2.異常結(jié)果處理

(1)陰性樣本需復(fù)核，如重復(fù)檢測仍陰性則排除感染。

(2)陽性樣本建議復(fù)查，結(jié)合臨床癥狀綜合判讀。

3.報(bào)告規(guī)范

(1)明確檢測項(xiàng)目、樣本編號及檢測時(shí)間。

(2)列出關(guān)鍵參數(shù)，如Ct值、S/CO比值等。

(3)附注檢測方法的局限性，如交叉反應(yīng)率<5%。

（四）流程優(yōu)化與記錄

1.優(yōu)化建議

(1)定期評估檢測靈敏度（如使用spikingsamples）。

(2)更新試劑盒批號，避免批間差異。

2.記錄要求

(1)保存原始數(shù)據(jù)，包括加樣記錄、儀器讀數(shù)等。

(2)建立電子臺賬，可追溯每樣本的檢測過程。

三、注意事項(xiàng)

1.避免樣本污染，如使用一次性吸頭和移液器。

2.操作人員需經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)，掌握SOP細(xì)節(jié)。

3.廢棄物按生物安全等級處理，如使用高壓滅菌器。

本流程為通用標(biāo)準(zhǔn)，具體實(shí)驗(yàn)可根據(jù)儀器或試劑說明書調(diào)整參數(shù)。

**（接續(xù)原文）**

**二、標(biāo)準(zhǔn)流程**

（一）樣本采集與處理**（擴(kuò)寫）**

1.**樣本類型選擇****（擴(kuò)寫）**

***血清/血漿：**這是最常用的樣本類型，尤其適用于檢測病原體誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性抗體（如IgM、IgG）或檢測血液中的病原體抗原（如HIVp24抗原、甲肝病毒抗原）。血清是通過離心得澄清的上清液，適用于大多數(shù)免疫學(xué)檢測方法；血漿則含有凝血因子，通常通過抗凝管采集后離心獲得，適用于某些需要檢測凝血相關(guān)指標(biāo)或進(jìn)行核酸檢測的場合。

**(1)適用于抗體檢測，如ELISA、化學(xué)發(fā)光法等。***（具體說明）**例如，在傳染病回顧性研究或感染后一段時(shí)間內(nèi)的血清學(xué)調(diào)查中，通過檢測IgM抗體判斷近期感染，或通過檢測IgG抗體判斷既往感染或免疫力水平。化學(xué)發(fā)光法因其高靈敏度和定量能力，常用于檢測病毒載量相關(guān)的抗體（如HIV抗體、乙肝核心抗體）。

**(2)適用于病原體抗原檢測，如快速檢測試劑盒（膠體金法）。***（具體說明）**例如，在急性感染期，檢測血清中的病原體抗原（如瘧原蟲抗原、乙型肝炎e抗原HBeAg）通常比檢測抗體更快，能更早地提示感染。

***組織樣本：**主要用于病原體的形態(tài)學(xué)觀察（如病理切片中的細(xì)菌、真菌）、病原體在組織內(nèi)的定位、或特定免疫組化/原位雜交檢測。樣本可以是活檢組織、手術(shù)切除組織或尸檢組織。

**(1)用于病理學(xué)檢測或原位雜交，需新鮮或固定保存。***（具體說明）**新鮮組織可直接用于冰凍切片，以保留細(xì)胞形態(tài)和抗原性。對于需要長期保存或轉(zhuǎn)運(yùn)的樣本，需立即放入4%多聚甲醛溶液或含RNAlater固定液的容器中，并在規(guī)定時(shí)間內(nèi)進(jìn)行固定（通常4-6小時(shí)）。固定劑的選擇和固定時(shí)間會(huì)直接影響后續(xù)染色效果。

***糞便/尿液：**糞便樣本常用于檢測腸道病原體的抗原（如輪狀病毒、腺病毒）、病原體核酸（如寄生蟲卵、細(xì)菌16SrRNA）或糞便菌群組成。尿液樣本可用于檢測泌尿道感染相關(guān)的病原體抗原（如乳膠凝集法檢測淋病奈瑟菌）或病原體核酸（如尿路病原體PCR檢測）。

**(3)用于病原體抗原或核酸檢測，避免污染。***（具體說明）**采集糞便時(shí)，應(yīng)使用干凈的無菌容器，避免糞便表面粘附的尿液或雜物污染。對于需要檢測病原體核酸的糞便樣本，需注意運(yùn)輸過程中的溫度控制，防止RNA降解。尿液樣本采集前建議清潔外陰，防止污染。

***呼吸道拭子：**特別是鼻咽拭子，是檢測呼吸道病原體（如流感病毒、冠狀病毒、腺病毒）最常用的樣本類型。其優(yōu)點(diǎn)是操作簡便、患者配合度高。

**(4)常用鼻咽拭子，采集時(shí)避免接觸采樣器頭端。***（具體說明）**采集時(shí)，采樣器頭端應(yīng)深入鼻腔后部或鼻咽部，按照說明書要求的旋轉(zhuǎn)次數(shù)和停留時(shí)間進(jìn)行充分采樣。關(guān)鍵在于采樣頭端不能接觸到拭子桿，以防止樣本被污染。采集后的拭子應(yīng)立即放入含運(yùn)輸液的采樣管中，確保病毒在運(yùn)輸過程中保持活性。

2.**采集操作要點(diǎn)****（擴(kuò)寫）**

***嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作，使用一次性采樣工具。****（具體說明）**所有采樣工具，包括拭子、注射器、采血管等，必須是無菌包裝，且為一次性使用。操作人員需洗手或使用含酒精的消毒劑進(jìn)行手部消毒，穿戴潔凈手套。采樣環(huán)境應(yīng)盡量清潔，必要時(shí)進(jìn)行空間消毒。

**(1)嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作，使用一次性采樣工具。***（補(bǔ)充細(xì)節(jié)）**例如，采集血液樣本時(shí)，應(yīng)使用經(jīng)過驗(yàn)證的采血管（如EDTA抗凝管、肝素抗凝管），確?？鼓齽舛葴?zhǔn)確，避免溶血或凝血影響檢測結(jié)果。采血部位需用75%酒精消毒，待酒精揮發(fā)后再用無菌干棉簽按壓止血。

***按照標(biāo)準(zhǔn)劑量采集，如血清需3-5mL，拭子需旋轉(zhuǎn)擦拭至少10秒。****（具體說明）**不同檢測項(xiàng)目對樣本量的要求不同。血清學(xué)檢測通常需要3-5mL血液，以保證有足夠的樣本進(jìn)行檢測和復(fù)孔。對于拭子樣本，需確保拭子在目標(biāo)部位（如鼻咽部、陰道內(nèi)）充分旋轉(zhuǎn)，以獲取足夠的病原體核酸或細(xì)胞成分。例如，鼻咽拭子采集時(shí)，應(yīng)在雙側(cè)鼻咽部各旋轉(zhuǎn)擦拭至少5-10次。

**(2)按照標(biāo)準(zhǔn)劑量采集，如血清需3-5mL，拭子需旋轉(zhuǎn)擦拭至少10秒。***（補(bǔ)充示例）**如果檢測病原體DNA，可能需要多個(gè)拭子或特定類型的拭子（如細(xì)胞保存拭子）來提高核酸回收率。具體要求應(yīng)參照相應(yīng)檢測方法的SOP。

***標(biāo)記樣本管，注明采集時(shí)間、編號及患者信息（脫敏處理）。****（具體說明）**每個(gè)樣本管必須清晰、唯一地標(biāo)記，包含樣本編號、采集日期和時(shí)間、患者姓名（或代號為脫敏處理后的標(biāo)識）、樣本類型等信息。標(biāo)記應(yīng)牢固、耐久，避免在運(yùn)輸或處理過程中脫落或模糊?；颊咝畔⒚撁粜璺想[私保護(hù)要求，僅保留必要的關(guān)鍵信息用于追溯，且在報(bào)告環(huán)節(jié)隱去。

**(3)標(biāo)記樣本管，注明采集時(shí)間、編號及患者信息（脫敏處理）。***（補(bǔ)充細(xì)節(jié)）**標(biāo)記順序建議為：樣本類型（如Ser）+編號（如Sample001）+采集日期（如20231027）。樣本管應(yīng)放置在合適的標(biāo)簽紙上，并確保標(biāo)簽粘貼平整。對于需要特殊處理的樣本（如低溫保存），應(yīng)在標(biāo)簽上明確注明。

3.**樣本保存與運(yùn)輸****（擴(kuò)寫）**

***血清樣本需室溫保存30分鐘以上，避免凍融。****（具體說明）**采集后的血清樣本可在室溫（15-25℃）下放置30分鐘以上，讓管內(nèi)血細(xì)胞充分沉淀，形成清晰的血清層，減少白細(xì)胞和血小板干擾。但在室溫下時(shí)間不宜過長（一般不超過2小時(shí)），且需盡快分離血清或進(jìn)行冷藏。嚴(yán)禁反復(fù)凍融，因?yàn)閮鋈谶^程會(huì)破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，影響檢測結(jié)果，特別是抗體檢測和某些抗原檢測。

**(1)血清樣本需室溫保存30分鐘以上，避免凍融。***（補(bǔ)充注意事項(xiàng)）**如果無法立即處理，應(yīng)將樣本置于2-8℃冰箱冷藏。冷凍保存時(shí)，應(yīng)使用合適的凍存管，避免反復(fù)凍融，建議分裝后凍存。

***組織樣本立即固定于10%甲醛溶液或RNAlater溶液中。****（具體說明）**新鮮組織樣本應(yīng)在采集后立即處理。對于需要進(jìn)行石蠟包埋的組織，需立即放入盛有10%中性緩沖甲醛溶液的容器中，確保組織完全浸沒。甲醛濃度和固定時(shí)間對組織學(xué)染色至關(guān)重要，通常需固定12-24小時(shí)。對于需要做RNA檢測的組織，應(yīng)使用RNAlater溶液進(jìn)行滲透固定，或立即進(jìn)行RNA提取操作，以最大限度保護(hù)RNA完整性。

**(2)組織樣本立即固定于10%甲醛溶液或RNAlater溶液中。***（補(bǔ)充細(xì)節(jié)）**固定液的體積應(yīng)足夠大，以保證所有組織塊均能被充分浸泡。容器應(yīng)標(biāo)注樣本信息、固定液種類和加入時(shí)間。對于體積較大的組織，可能需要分塊固定。

***運(yùn)輸時(shí)使用冷藏箱（2-8℃），確保樣本在4小時(shí)內(nèi)到達(dá)實(shí)驗(yàn)室。****（具體說明）**對于需要冷藏運(yùn)輸?shù)臉颖荆ㄈ缪濉⒛蛞骸⒉糠质米訕颖荆?，?yīng)使用帶冰袋或冷藏箱的保溫箱，維持運(yùn)輸過程中的溫度在2-8℃之間。記錄運(yùn)輸時(shí)間，確保樣本在規(guī)定時(shí)間內(nèi)（通常是4小時(shí)）送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，以保證檢測結(jié)果的穩(wěn)定性。對于冷凍樣本，則需使用干冰或?qū)ｉT的冷凍運(yùn)輸盒，確保全程溫度在-20℃以下。運(yùn)輸過程中應(yīng)避免劇烈震動(dòng)和傾倒。

**(3)運(yùn)輸時(shí)使用冷藏箱（2-8℃），確保樣本在4小時(shí)內(nèi)到達(dá)實(shí)驗(yàn)室。***（補(bǔ)充要求）**運(yùn)輸箱外部應(yīng)有“生物樣本，需冷藏”等警示標(biāo)識。到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后，應(yīng)立即檢查樣本狀態(tài)和溫度記錄，確認(rèn)樣本未受損害且符合要求。如果運(yùn)輸時(shí)間超過預(yù)期，可能需要重新評估樣本的有效性。

（二）檢測方法選擇與實(shí)施**（擴(kuò)寫）**

1.**檢測方法分類****（擴(kuò)寫）**

***酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）：**這是一種廣泛應(yīng)用于血清學(xué)檢測的技術(shù)，通過酶標(biāo)記的抗體或抗原與樣本中的目標(biāo)分子結(jié)合，加入酶底物后產(chǎn)生顯色反應(yīng)，通過酶標(biāo)儀測定吸光度值進(jìn)行定量或定性判斷。

**(1)用于抗體或抗原檢測，靈敏度高。***（具體說明）**ELISA可以設(shè)計(jì)成多種模式：

***間接ELISA：**檢測樣本中的抗體。先用已知抗原包被板孔，加入樣本，洗去未結(jié)合物，再加入酶標(biāo)二抗，最后加底物顯色。結(jié)果與樣本中抗體濃度成正比。

***直接ELISA：**檢測樣本中的抗原。直接用已知抗原包被板孔，加入樣本，洗去未結(jié)合物，再加入酶標(biāo)單抗，最后加底物顯色。結(jié)果與樣本中抗原濃度成正比。

***競爭ELISA：**常用于小分子抗原（如藥物、激素）或核酸檢測產(chǎn)物的檢測。樣本中的目標(biāo)物與酶標(biāo)物競爭結(jié)合有限數(shù)量的抗體，結(jié)合量與樣本濃度成反比。

***雙抗體夾心ELISA：**檢測樣品中存在的特定抗原。需同時(shí)存在針對抗原兩個(gè)不同表位的抗體（包被抗體和酶標(biāo)抗體），形成“夾心”結(jié)構(gòu)。靈敏度和特異性較高。

***化學(xué)發(fā)光免疫分析：**利用化學(xué)發(fā)光劑（如辣根過氧化物酶標(biāo)記的底物TPO-TMB）在酶催化下發(fā)光，通過時(shí)間分辨熒光或微孔板讀數(shù)儀檢測發(fā)光信號。相比傳統(tǒng)ELISA，具有更高的靈敏度、更寬的線性范圍和更快的檢測速度。

**(2)適用于定量檢測，線性范圍寬。***（具體說明）**該技術(shù)特別適用于需要精確量化指標(biāo)的場景，如檢測病毒載量（HIVRNA、HBVDNA）、激素水平（皮質(zhì)醇、睪酮）、腫瘤標(biāo)志物（AFP、CA125）等。其信號幅度高，噪音低，能夠檢測到極低濃度的目標(biāo)分子。

***免疫熒光技術(shù)：**通過熒光標(biāo)記的抗體或抗原與樣本中的目標(biāo)分子結(jié)合，在熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀下觀察熒光信號。可用于細(xì)胞內(nèi)病原體檢測、組織切片中的抗原定位等。

**(3)通過熒光標(biāo)記抗體觀察細(xì)胞內(nèi)病原體。***（具體說明）**例如，在細(xì)胞培養(yǎng)物或組織切片上，用熒光二抗（如AlexaFluor標(biāo)記）結(jié)合已用特異性一抗（如針對病毒衣殼蛋白）孵育的樣本，可以在熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞內(nèi)或組織內(nèi)的病原體分布。流式細(xì)胞術(shù)則可用于對懸浮細(xì)胞群體進(jìn)行高通量分析，檢測單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的病原體標(biāo)志物。

2.**操作步驟（以ELISA為例）****（擴(kuò)寫）**

***(1)試劑準(zhǔn)備：****（詳細(xì)步驟）**檢測前1-2小時(shí)，將所有試劑（酶標(biāo)板、標(biāo)準(zhǔn)品、樣本稀釋液、洗滌液、酶標(biāo)抗體/抗原、底物溶液、終止液等）從冰箱（通常2-8℃或-20℃）取出，置于室溫平衡至與室溫一致（約15-25℃）。平衡時(shí)間通常為30分鐘。平衡后的試劑應(yīng)檢查有無沉淀或變色，如有異常應(yīng)立即停止檢測并報(bào)告。洗滌液需使用純水或去離子水稀釋至指定濃度，并混勻。底物溶液配制需嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，通常臨用前配制，并避免光照。

**(1)試劑準(zhǔn)備：平衡酶標(biāo)板至室溫，稀釋標(biāo)準(zhǔn)品與樣本。***（補(bǔ)充細(xì)節(jié)）**酶標(biāo)板在使用前需用洗滌液潤洗3-5次，每次約3-5分鐘，以去除包裝板內(nèi)的保護(hù)液。標(biāo)準(zhǔn)品和樣本根據(jù)說明書要求用樣本稀釋液或稀釋緩沖液進(jìn)行稀釋。稀釋倍數(shù)需記錄清楚，并在計(jì)算結(jié)果時(shí)考慮。

***(2)加樣：****（詳細(xì)步驟）**按照標(biāo)準(zhǔn)品、空白對照、陰性對照、樣本的順序，將各加樣孔加入相應(yīng)液體。加樣量需精確，通常為100-200μL/孔。使用不同吸頭區(qū)分不同樣本/試劑，避免交叉污染。加樣時(shí)動(dòng)作應(yīng)輕柔，避免產(chǎn)生氣泡。加完后，可輕輕晃動(dòng)酶標(biāo)板或用吸頭在孔內(nèi)輕柔吹打，使液體充分混合。

**(2)依次加入樣本、酶標(biāo)抗體、底物溶液，每步需混勻。***（補(bǔ)充細(xì)節(jié)）**加入酶標(biāo)抗體或抗原后，建議在室溫（或37℃）下孵育一定時(shí)間（如30-60分鐘），期間可輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板或放置在恒溫振蕩器上。孵育結(jié)束后，需徹底洗滌，通常洗滌3-5次，每次用洗滌液洗滌300-500μL/孔，每次洗滌后用吸水紙或吸頭輕輕拍干板底（或通過酶標(biāo)板洗板器）。洗滌是去除未結(jié)合物、降低背景的關(guān)鍵步驟。

***(3)反應(yīng)條件：****（詳細(xì)步驟）**加入底物溶液后，需在避光條件下進(jìn)行顯色反應(yīng)。避光非常重要，因?yàn)楣庹諘?huì)消耗底物，影響結(jié)果準(zhǔn)確性。顯色時(shí)間需嚴(yán)格控制在說明書推薦的范圍內(nèi)，一般為15-30分鐘。顯色時(shí)間過短可能導(dǎo)致信號不足，過長則可能線性范圍變窄。在顯色期間，酶標(biāo)板應(yīng)保持在室溫，避免震動(dòng)。

**(3)反應(yīng)條件：37℃孵育30分鐘，TMB顯色15-20分鐘。***（補(bǔ)充說明）**溫育/孵育溫度和時(shí)間是影響反應(yīng)效率的因素。ELISA通常在室溫（18-25℃）或37℃進(jìn)行。37℃可加速反應(yīng)，但需注意某些酶在高溫下活性可能下降或產(chǎn)生非特異性結(jié)合。TMB底物顯色對溫度敏感，過高溫度可能導(dǎo)致氧化加速。

***(4)終止反應(yīng)：****（詳細(xì)步驟）**顯色結(jié)束后，立即加入終止液（通常是H?SO?或HCl溶液）。終止液的作用是使酶促反應(yīng)停止，并將藍(lán)色氧化態(tài)的TMB轉(zhuǎn)化為黃色，使顏色變化完全。加入終止液后，應(yīng)立即在酶標(biāo)儀上讀取吸光度值。終止液加入后，板孔顏色會(huì)迅速變化，需盡快讀數(shù)。

**(4)立即酶標(biāo)儀讀數(shù)。***（補(bǔ)充操作）**酶標(biāo)儀應(yīng)預(yù)熱30分鐘以上。設(shè)置正確的波長（如TMB法為450nm，參考波長通常為630nm）。依次讀取各孔的吸光度值。讀數(shù)時(shí)，應(yīng)確保酶標(biāo)板放置平穩(wěn)，避免晃動(dòng)。

***(5)數(shù)據(jù)處理：****（補(bǔ)充步驟）**讀取數(shù)據(jù)后，使用配套的軟件或手動(dòng)計(jì)算結(jié)果。包括計(jì)算平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、背景吸光度校正等。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣本的吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出樣本的濃度或相對值。注意檢查標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)（R2），通常要求R2>0.99。

3.**質(zhì)量控制措施****（擴(kuò)寫）**

***(1)每板設(shè)置陰性對照、陽性對照及空白對照。****（詳細(xì)說明）**

***陰性對照（零標(biāo)準(zhǔn)）：**使用無特異性結(jié)合能力的樣本或緩沖液（如樣本稀釋液），用于檢測非特異性結(jié)合和背景信號。其吸光度值應(yīng)盡可能低，通常要求低于某個(gè)閾值（如標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)的吸光度值）。

***陽性對照：**使用已知濃度的陽性樣本或標(biāo)準(zhǔn)品，用于驗(yàn)證檢測系統(tǒng)的靈敏度、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。其吸光度值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)，且符合預(yù)期。

***空白對照（零空白）：**使用不含樣本和酶標(biāo)試劑的板孔（僅含包被液和洗滌液），用于檢測試劑、加樣過程或洗滌液中的潛在污染。其吸光度值應(yīng)非常低，接近0。

***(1)每板設(shè)置陰性對照、陽性對照及空白對照。***（補(bǔ)充目的）**通過對比陰性對照吸光度值與空白對照吸光度值，可以判斷是否存在背景污染。對比陽性對照吸光度值與預(yù)期值及標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以判斷檢測是否有效進(jìn)行。

***(2)使用已知濃度的質(zhì)控品，評估檢測線性范圍。****（詳細(xì)說明）**質(zhì)控品（Control）是已知準(zhǔn)確濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或樣本，用于監(jiān)控檢測過程的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。定期（如每天、每周）使用質(zhì)控品進(jìn)行檢測，觀察其吸光度值是否在允許的范圍內(nèi)（通常為預(yù)期值的±10%或±15%）。這有助于發(fā)現(xiàn)潛在的漂移或問題。線性范圍是指檢測方法能夠準(zhǔn)確量化的濃度區(qū)間，可通過使用一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品來確定。確保樣本濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)是獲得準(zhǔn)確結(jié)果的前提。

**(2)使用已知濃度的質(zhì)控品，評估檢測線性范圍。***（補(bǔ)充應(yīng)用）**例如，如果質(zhì)控品的預(yù)期濃度為100IU/mL，檢測后的吸光度值對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為95-105IU/mL，則認(rèn)為該點(diǎn)在允許范圍內(nèi)，檢測穩(wěn)定。如果吸光度值對應(yīng)濃度為85-115IU/mL，則提示線性范圍可能存在問題，需要檢查或重新校準(zhǔn)。

***(3)定期校準(zhǔn)儀器，如酶標(biāo)儀的吸光度讀數(shù)誤差應(yīng)<1%。****（詳細(xì)說明）**酶標(biāo)儀是關(guān)鍵檢測設(shè)備，其準(zhǔn)確性直接影響結(jié)果。應(yīng)按照制造商的說明，使用標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)液（如SRM2509，NISTtraceablestandard）定期校準(zhǔn)酶標(biāo)儀的吸光度讀數(shù)。校準(zhǔn)應(yīng)檢查在常用檢測波長（如450nm）處的零點(diǎn)（空白）和吸光度讀數(shù)精度。確保在整個(gè)檢測過程中，不同板孔間的吸光度讀數(shù)誤差小于1%，以保證結(jié)果的可比性。

**(3)定期校準(zhǔn)儀器，如酶標(biāo)儀的吸光度讀數(shù)誤差應(yīng)<1%。***（補(bǔ)充校準(zhǔn)內(nèi)容）**除了零點(diǎn)校準(zhǔn)和精度校準(zhǔn)，還應(yīng)定期檢查儀器的雜散光（straylight）水平，雜散光過高會(huì)降低檢測靈敏度。校準(zhǔn)記錄應(yīng)妥善保存，作為質(zhì)量控制的證明文件。

（三）結(jié)果判讀與報(bào)告**（擴(kuò)寫）**

1.**定性/定量分析****（擴(kuò)寫）**

***(1)定性：根據(jù)cut-off值判斷結(jié)果（陽性/陰性）。****（詳細(xì)說明）**定性分析通常是將樣本的吸光度值或相對值與一個(gè)預(yù)設(shè)的閾值（cut-off值）進(jìn)行比較。cut-off值的設(shè)定通常基于陰性對照、空白對照以及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法（如Youden指數(shù)法）計(jì)算得出，旨在最大化靈敏度和特異性的平衡。如果樣本值≥cut-off值，判讀為陽性；如果樣本值<cut-off值，判讀為陰性。cut-off值可能因試劑批號、檢測條件、實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)等因素而有所不同，需要定期復(fù)核和調(diào)整。

**(1)定性：根據(jù)cut-off值判斷結(jié)果（陽性/陰性）。***（補(bǔ)充判斷依據(jù)）**例如，對于ELISA檢測IgM抗體，cut-off值可能設(shè)定為陰性對照平均吸光度值加上2-3倍標(biāo)準(zhǔn)差。如果樣本吸光度值高于此cut-off值，則判為IgM陽性，提示近期感染。

***(2)定量：繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣本濃度（如抗體滴度≥1:64為陽性）。****（詳細(xì)說明）**定量分析是測定樣本中目標(biāo)分析物的具體濃度或相對含量。通過將一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品在相同條件下進(jìn)行檢測，獲得標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（通常為吸光度值對濃度作圖，擬合直線或非線性曲線）。樣本檢測后，將其吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出對應(yīng)的濃度。結(jié)果通常以pg/mL、IU/mL、拷貝數(shù)/mL等單位表示。有時(shí)也會(huì)用滴度表示，如血清學(xué)抗體滴度，通過倍比稀釋樣本后檢測，找到最高稀釋倍數(shù)仍能產(chǎn)生陽性結(jié)果的倍數(shù)，如抗體滴度≥1:64。

**(2)定量：繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣本濃度（如抗體滴度≥1:64為陽性）。***（補(bǔ)充計(jì)算方法）**定量結(jié)果的準(zhǔn)確性取決于標(biāo)準(zhǔn)曲線的質(zhì)量和樣本是否在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)。如果樣本濃度超出標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍，可能需要重新配制標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)颖具M(jìn)行適當(dāng)稀釋后再檢測。抗體滴度的測定通常需要制作對數(shù)稀釋系列，如1:10,1:20,1:40...，找到能通過定性判讀（如達(dá)到cut-off值）的最高稀釋倍數(shù)。

2.**異常結(jié)果處理****（擴(kuò)寫）**

***(1)陰性樣本需復(fù)核，如重復(fù)檢測仍陰性則排除感染。****（詳細(xì)說明）**對于初步判讀為陰性的樣本，尤其是臨床意義較大的樣本，建議進(jìn)行復(fù)核。復(fù)核方法可以是重復(fù)進(jìn)行一次完整的檢測（即重新加樣、孵育、洗滌、讀數(shù)），或者只重復(fù)關(guān)鍵的孵育和讀數(shù)步驟。如果復(fù)核結(jié)果仍為陰性，且樣本質(zhì)量良好（無溶血、渾濁等），則可以認(rèn)為該樣本未檢測到目標(biāo)分析物，結(jié)論為陰性。但需結(jié)合臨床情況綜合判斷。

**(1)陰性樣本需復(fù)核，如重復(fù)檢測仍陰性則排除感染。***（補(bǔ)充條件）**復(fù)核時(shí)要注意排除假陰性的可能原因，如樣本采集不當(dāng)、運(yùn)輸保存問題、試劑或儀器故障、操作誤差等。如果復(fù)核結(jié)果為陽性，則應(yīng)分析兩次結(jié)果差異的原因。

***(2)陽性樣本建議復(fù)查，結(jié)合臨床癥狀綜合判讀。****（詳細(xì)說明）**對于初步判讀為陽性的樣本，也建議進(jìn)行復(fù)查。復(fù)查同樣可以通過重復(fù)檢測進(jìn)行。即使復(fù)查結(jié)果為陰性，也不能簡單地否定初檢陽性結(jié)果，可能存在檢測窗口期、樣本中干擾物質(zhì)或檢測方法靈敏度不足等因素。最終結(jié)果的判讀必須結(jié)合患者的臨床癥狀、流行病學(xué)史、既往病史以及其他輔助檢查結(jié)果（如病原體培養(yǎng)、核酸檢測等）進(jìn)行綜合評估。

**(2)陽性樣本建議復(fù)查，結(jié)合臨床癥狀綜合判讀。***（補(bǔ)充注意事項(xiàng)）**特別是在出現(xiàn)假陽性結(jié)果時(shí)，分析原因至關(guān)重要?？赡艿脑虬颖疚廴荆ㄈ绮僮鏖g污染、試劑污染）、非特異性結(jié)合、操作錯(cuò)誤等。需要采取嚴(yán)格的生物安全措施和標(biāo)準(zhǔn)化操作流程來減少假陽性風(fēng)險(xiǎn)。

3.**報(bào)告規(guī)范****（擴(kuò)寫）**

***(1)明確檢測項(xiàng)目、樣本編號及檢測時(shí)間。****（詳細(xì)說明）**檢測報(bào)告必須包含清晰、準(zhǔn)確的信息。首先是檢測的項(xiàng)目名稱（如“乙型肝炎表面抗體定量檢測”）。其次是樣本標(biāo)識（樣本編號），確保與樣本采集時(shí)的編號一致，用于追溯。最后是檢測完成的時(shí)間或日期。

**(1)明確檢測項(xiàng)目、樣本編號及檢測時(shí)間。***（補(bǔ)充要求）**報(bào)告抬頭應(yīng)清晰標(biāo)明實(shí)驗(yàn)室名稱和報(bào)告日期。

***(2)列出關(guān)鍵參數(shù)，如Ct值、S/CO比值等。****（詳細(xì)說明）**報(bào)告中應(yīng)包含檢測結(jié)果本身以及用于計(jì)算結(jié)果的關(guān)鍵參數(shù)。對于定量檢測，通常是樣本濃度值及其單位。對于定性檢測，是陽性/陰性判斷。對于使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）等方法的檢測，會(huì)報(bào)告Ct（CycleThreshold）值，即熒光信號達(dá)到設(shè)定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，Ct值越小，表示樣本初始病毒載量越高。對于化學(xué)發(fā)光或ELISA檢測，常報(bào)告S/CO（Sample/Cut-off）比值，即樣本吸光度值與cut-off值的比值，比值越大，表示陽性程度越高。這些原始或中間參數(shù)有時(shí)對臨床醫(yī)生理解結(jié)果或進(jìn)行趨勢分析有幫助。

**(2)列出關(guān)鍵參數(shù)，如Ct值、S/CO比值等。***（補(bǔ)充說明）**報(bào)告還應(yīng)包含檢測限（LOD）和定量限（LOQ）信息，以及參考區(qū)間（如果適用）。參考區(qū)間是基于健康人群數(shù)據(jù)建立的，用于判斷結(jié)果是否在正常范圍內(nèi)，但需注意參考區(qū)間可能因?qū)嶒?yàn)室、檢測方法、人群差異等因素不同。

***(3)附注檢測方法的局限性，如交叉反應(yīng)率<5%。****（詳細(xì)說明）**報(bào)告中應(yīng)包含檢測方法的簡要說明，并指出其局限性。這有助于使用者正確解讀結(jié)果。例如，對于ELISA檢測，可能需要說明檢測的靶標(biāo)、已知的可能干擾物（如高濃度類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體）、以及方法的預(yù)期靈敏度（如檢測限）。對于某些方法，如免疫印跡法用于HIV抗體確證，需要說明窗口期和可能出現(xiàn)的假陽性/假陰性結(jié)果類型。如果方法學(xué)評估中有交叉反應(yīng)率數(shù)據(jù)，應(yīng)在報(bào)告中注明，以提示潛在的干擾可能。

**(3)附注檢測方法的局限性，如交叉反應(yīng)率<5%。***（補(bǔ)充目的）**提供這些信息是為了確保報(bào)告的完整性和透明度，讓臨床醫(yī)生和科研人員了解檢測結(jié)果的可靠性和可能的影響因素，避免誤判。

（四）流程優(yōu)化與記錄**（擴(kuò)寫）**

1.**優(yōu)化建議****（詳細(xì)說明）**

***(1)定期評估檢測靈敏度（如使用spikingsamples）。****（具體操作）**靈敏度是指檢測方法能夠識別出最低濃度目標(biāo)分析物的能力。定期使用spikingsamples（即已知濃度的樣本或標(biāo)準(zhǔn)品，添加到合格的陰性樣本中）進(jìn)行檢測，可以評估實(shí)際檢測的靈敏度是否達(dá)到預(yù)期要求。如果spikingsamples的檢測結(jié)果低于標(biāo)準(zhǔn)限值，則需要查找原因并進(jìn)行改進(jìn)，如優(yōu)化樣本處理步驟、提高試劑質(zhì)量、調(diào)整孵育時(shí)間等。

**(1)定期評估檢測靈敏度（如使用spikingsamples）。***（補(bǔ)充價(jià)值）**這有助于確保檢測方法能夠檢測到低水平的感染或疾病狀態(tài)，對于早期診斷和監(jiān)測具有重要意義。

***(2)更新試劑盒批號，避免批間差異。****（具體措施）**不同批次的試劑盒可能存在成分上的微小差異，導(dǎo)致檢測性能（如靈敏度、特異性、線性范圍）發(fā)生變化。建立批號比對制度，即使用同一批樣本或標(biāo)準(zhǔn)品，分別用不同批號的試劑盒進(jìn)行檢測，比較結(jié)果的一致性。如果發(fā)現(xiàn)批間差異過大，應(yīng)選擇性能更穩(wěn)定或同一廠家的不同批號進(jìn)行輪換使用，或在報(bào)告中注明所用試劑盒的批號。

**(2)更新試劑盒批號，避免批間差異。***（補(bǔ)充管理）**建立試劑盒效期管理制度，使用前檢查試劑盒包裝是否完好、有效期是否在期內(nèi)。優(yōu)先使用近期生產(chǎn)批次的試劑盒。

***(3)優(yōu)化樣本前處理流程，減少人為誤差。****（具體改進(jìn)）**樣本前處理是影響結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)?？梢酝ㄟ^引入自動(dòng)化樣本處理設(shè)備（如自動(dòng)開蓋儀、自動(dòng)移液儀、自動(dòng)洗板機(jī)）、優(yōu)化洗滌液配方、標(biāo)準(zhǔn)化操作流程等方式，減少人為操作帶來的差異和污染風(fēng)險(xiǎn)。

**(3)優(yōu)化樣本前處理流程，減少人為誤差。***（補(bǔ)充例子）**例如，在ELISA洗滌步驟中，使用洗板器可以實(shí)現(xiàn)更均勻、一致的洗滌，減少因手工洗滌不充分或過度洗滌導(dǎo)致的背景升高。

2.**記錄要求****（詳細(xì)說明）**

***(1)保存原始數(shù)據(jù)，包括加樣記錄、儀器讀數(shù)等。****（具體內(nèi)容）**所有檢測過程的關(guān)鍵數(shù)據(jù)都應(yīng)進(jìn)行記錄。包括樣本接收登記信息、試劑批號和有效期、環(huán)境條件（溫度、濕度）、儀器校準(zhǔn)記錄、每次加樣的詳細(xì)記錄（包括樣本編號、加樣體積、稀釋倍數(shù)）、每次洗滌次數(shù)和體積、酶標(biāo)儀讀數(shù)（原始吸光度值、背景校正值、最終吸光度值）、標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)、質(zhì)控品結(jié)果等。原始數(shù)據(jù)應(yīng)妥善保存，保存期限根據(jù)實(shí)驗(yàn)室規(guī)定和法規(guī)要求（如ISO15189、CLIA等）確定，通常至少保存2-5年。

**(1)保存原始數(shù)據(jù)，包括加樣記錄、儀器讀數(shù)等。***（補(bǔ)充形式）**原始數(shù)據(jù)可以紙質(zhì)版或電子版形式保存。電子版數(shù)據(jù)應(yīng)存入安全的數(shù)據(jù)庫，并有備份機(jī)制。加樣記錄可以使用實(shí)驗(yàn)室信息管理系統(tǒng)（LIMS）自動(dòng)生成，或使用標(biāo)準(zhǔn)化表格記錄。

***(2)建立電子臺賬，可追溯每樣本的檢測過程。****（具體系統(tǒng)）**利用LIMS或?qū)嶒?yàn)室自建數(shù)據(jù)庫，為每個(gè)樣本建立唯一的信息記錄。該臺賬應(yīng)包含從樣本接收、標(biāo)識、前處理、檢測、結(jié)果判讀、報(bào)告生成到發(fā)放的全過程信息。記錄應(yīng)包含操作人員、操作時(shí)間、所用儀器/試劑/方法、關(guān)鍵參數(shù)、結(jié)果及審核信息等。這不僅是質(zhì)量管理的需要，也是滿足合規(guī)性要求（如GMP、ISO15189）的關(guān)鍵。

**(2)建立電子臺賬，可追溯每樣本的檢測過程。***（補(bǔ)充功能）**電子臺賬應(yīng)具備查詢、統(tǒng)計(jì)、報(bào)告生成等功能，方便管理人員監(jiān)控檢測流程、分析質(zhì)量趨勢、響應(yīng)客戶查詢和監(jiān)管機(jī)構(gòu)檢查。

**三、注意事項(xiàng)****（擴(kuò)寫）**

1.**避免樣本污染，如使用一次性吸頭和移液器。****（詳細(xì)措施）**樣本污染會(huì)導(dǎo)致假陽性結(jié)果，是免疫學(xué)檢測中需要重點(diǎn)防范的問題。為減少污染，應(yīng)做到：

***(1)使用一次性吸頭和移液器：****（具體說明）**嚴(yán)禁在同一個(gè)樣本和試劑之間重復(fù)使用吸頭或移液器，即使是同一孔內(nèi)的加樣也應(yīng)使用新的吸頭。移液器頭應(yīng)設(shè)計(jì)成可拋棄式。

***(2)操作間清潔與消毒：****（具體操作）**檢測前對操作臺面、設(shè)備表面進(jìn)行清潔和消毒（如使用75%酒精擦拭）。保持操作間通風(fēng)良好，限制人員流動(dòng)。

***(3)分區(qū)操作：****（具體安排）**將樣本準(zhǔn)備區(qū)、試劑配制區(qū)、加樣區(qū)、洗滌區(qū)、讀數(shù)區(qū)等功能區(qū)域分開設(shè)置，避免交叉污染。

***(4)標(biāo)識清晰：****（具體要求）**所有容器、試劑、樣本均應(yīng)有清晰、唯一的標(biāo)識，防止混淆。

2.**操作人員需經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)，掌握SOP細(xì)節(jié)。****（詳細(xì)要求）**免疫學(xué)檢測涉及多個(gè)復(fù)雜步驟，操作人員的專業(yè)技能和嚴(yán)謹(jǐn)性直接影響結(jié)果質(zhì)量。要求：

***(1)基礎(chǔ)培訓(xùn)：****（具體內(nèi)容）**所有操作人員必須接受免疫學(xué)原理、檢測方法原理、樣本處理、試劑使用、儀器操作、質(zhì)量控制、生物安全等方面的系統(tǒng)培訓(xùn)。

***(2)SOP培訓(xùn)：****（具體內(nèi)容）**必須熟練掌握所負(fù)責(zé)檢測項(xiàng)目的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP），理解每一步操作的目的和關(guān)鍵控制點(diǎn)。

***(3)定期考核：****（具體安排）**定期進(jìn)行理論考核和實(shí)際操作考核，確保持證上崗，并持續(xù)更新知識。

***(4)職責(zé)明確：****（具體規(guī)定）**明確各崗位職責(zé)，確保操作規(guī)范得到執(zhí)行。

3.**廢棄物按生物安全等級處理，如使用高壓滅菌器。****（詳細(xì)流程）**免疫學(xué)檢測過程中會(huì)產(chǎn)生含有潛在病原體的廢棄物，必須按照生物安全等級進(jìn)行分類和處理，防止環(huán)境污染和職業(yè)暴露。要求：

***(1)廢棄物分類：****（具體分類）**將廢棄物分為一般垃圾（如廢棄紙巾）、感染性廢物（如沾染樣本的拭子、吸頭、離心管）、化學(xué)廢物（如廢棄試劑、洗滌液）等。分類標(biāo)簽應(yīng)清晰明確。

***(2)感染性廢物處理：****（具體方法）**感染性廢物應(yīng)首先進(jìn)行高壓蒸汽滅菌（autoclave），條件通常為121℃、15psi（約103kPa）、15-20分鐘，確保所有微生物被滅活?；瘜W(xué)廢液需根據(jù)成分進(jìn)行中和或特殊處理。

***(3)運(yùn)輸與處置：****（具體要求）**滅菌后的廢棄物按醫(yī)療廢物或一般工業(yè)垃圾規(guī)定進(jìn)行包裝和運(yùn)輸，交由有資質(zhì)的機(jī)構(gòu)處理。未滅菌的感染性廢物必須裝入防滲漏的專用包裝袋，并貼上警示標(biāo)識。

***(4)個(gè)人防護(hù)：****（具體措施）**處理廢棄物時(shí)，操作人員必須穿戴適當(dāng)?shù)膫€(gè)人防護(hù)裝備（PPE），如手套、防護(hù)服、護(hù)目鏡或面屏。

本流程為免疫學(xué)病原體檢測的通用標(biāo)準(zhǔn)，具體實(shí)施時(shí)需結(jié)合實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際情況、所使用的儀器試劑特性以及相關(guān)行業(yè)規(guī)范進(jìn)行調(diào)整和完善。

一、概述

免疫學(xué)病原體檢測是利用抗原抗體反應(yīng)等免疫學(xué)原理，對生物樣本中的特定病原體進(jìn)行定性或定量分析的技術(shù)。標(biāo)準(zhǔn)流程的建立旨在確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性和可重復(fù)性，適用于臨床診斷、公共衛(wèi)生監(jiān)測、科研等領(lǐng)域。本流程涵蓋樣本采集、處理、檢測、結(jié)果判讀及報(bào)告等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，需嚴(yán)格遵循操作規(guī)范。

二、標(biāo)準(zhǔn)流程

（一）樣本采集與處理

1.樣本類型選擇

(1)血清/血漿：適用于抗體檢測，如ELISA、化學(xué)發(fā)光法等。

(2)組織樣本：用于病理學(xué)檢測或原位雜交，需新鮮或固定保存。

(3)糞便/尿液：用于病原體抗原或核酸檢測，避免污染。

(4)呼吸道拭子：常用鼻咽拭子，采集時(shí)避免接觸采樣器頭端。

2.采集操作要點(diǎn)

(1)嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作，使用一次性采樣工具。

(2)按照標(biāo)準(zhǔn)劑量采集，如血清需3-5mL，拭子需旋轉(zhuǎn)擦拭至少10秒。

(3)標(biāo)記樣本管，注明采集時(shí)間、編號及患者信息（脫敏處理）。

3.樣本保存與運(yùn)輸

(1)血清樣本需室溫保存30分鐘以上，避免凍融。

(2)組織樣本立即固定于10%甲醛溶液或RNAlater溶液中。

(3)運(yùn)輸時(shí)使用冷藏箱（2-8℃），確保樣本在4小時(shí)內(nèi)到達(dá)實(shí)驗(yàn)室。

（二）檢測方法選擇與實(shí)施

1.檢測方法分類

(1)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）：用于抗體或抗原檢測，靈敏度高。

(2)化學(xué)發(fā)光免疫分析：適用于定量檢測，線性范圍寬。

(3)免疫熒光技術(shù)：通過熒光標(biāo)記抗體觀察細(xì)胞內(nèi)病原體。

2.操作步驟（以ELISA為例）

(1)試劑準(zhǔn)備：平衡酶標(biāo)板至室溫，稀釋標(biāo)準(zhǔn)品與樣本。

(2)加樣：依次加入樣本、酶標(biāo)抗體、底物溶液，每步需混勻。

(3)反應(yīng)條件：37℃孵育30分鐘，TMB顯色15-20分鐘。

(4)終止反應(yīng)：加入終止液，立即酶標(biāo)儀讀數(shù)。

3.質(zhì)量控制措施

(1)每板設(shè)置陰性對照、陽性對照及空白對照。

(2)使用已知濃度的質(zhì)控品，評估檢測線性范圍。

(3)定期校準(zhǔn)儀器，如酶標(biāo)儀的吸光度讀數(shù)誤差應(yīng)<1%。

（三）結(jié)果判讀與報(bào)告

1.定性/定量分析

(1)定性：根據(jù)cut-off值判斷結(jié)果（陽性/陰性）。

(2)定量：繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣本濃度（如抗體滴度≥1:64為陽性）。

2.異常結(jié)果處理

(1)陰性樣本需復(fù)核，如重復(fù)檢測仍陰性則排除感染。

(2)陽性樣本建議復(fù)查，結(jié)合臨床癥狀綜合判讀。

3.報(bào)告規(guī)范

(1)明確檢測項(xiàng)目、樣本編號及檢測時(shí)間。

(2)列出關(guān)鍵參數(shù)，如Ct值、S/CO比值等。

(3)附注檢測方法的局限性，如交叉反應(yīng)率<5%。

（四）流程優(yōu)化與記錄

1.優(yōu)化建議

(1)定期評估檢測靈敏度（如使用spikingsamples）。

(2)更新試劑盒批號，避免批間差異。

2.記錄要求

(1)保存原始數(shù)據(jù)，包括加樣記錄、儀器讀數(shù)等。

(2)建立電子臺賬，可追溯每樣本的檢測過程。

三、注意事項(xiàng)

1.避免樣本污染，如使用一次性吸頭和移液器。

2.操作人員需經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)，掌握SOP細(xì)節(jié)。

3.廢棄物按生物安全等級處理，如使用高壓滅菌器。

本流程為通用標(biāo)準(zhǔn)，具體實(shí)驗(yàn)可根據(jù)儀器或試劑說明書調(diào)整參數(shù)。

**（接續(xù)原文）**

**二、標(biāo)準(zhǔn)流程**

（一）樣本采集與處理**（擴(kuò)寫）**

1.**樣本類型選擇****（擴(kuò)寫）**

***血清/血漿：**這是最常用的樣本類型，尤其適用于檢測病原體誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性抗體（如IgM、IgG）或檢測血液中的病原體抗原（如HIVp24抗原、甲肝病毒抗原）。血清是通過離心得澄清的上清液，適用于大多數(shù)免疫學(xué)檢測方法；血漿則含有凝血因子，通常通過抗凝管采集后離心獲得，適用于某些需要檢測凝血相關(guān)指標(biāo)或進(jìn)行核酸檢測的場合。

**(1)適用于抗體檢測，如ELISA、化學(xué)發(fā)光法等。***（具體說明）**例如，在傳染病回顧性研究或感染后一段時(shí)間內(nèi)的血清學(xué)調(diào)查中，通過檢測IgM抗體判斷近期感染，或通過檢測IgG抗體判斷既往感染或免疫力水平。化學(xué)發(fā)光法因其高靈敏度和定量能力，常用于檢測病毒載量相關(guān)的抗體（如HIV抗體、乙肝核心抗體）。

**(2)適用于病原體抗原檢測，如快速檢測試劑盒（膠體金法）。***（具體說明）**例如，在急性感染期，檢測血清中的病原體抗原（如瘧原蟲抗原、乙型肝炎e抗原HBeAg）通常比檢測抗體更快，能更早地提示感染。

***組織樣本：**主要用于病原體的形態(tài)學(xué)觀察（如病理切片中的細(xì)菌、真菌）、病原體在組織內(nèi)的定位、或特定免疫組化/原位雜交檢測。樣本可以是活檢組織、手術(shù)切除組織或尸檢組織。

**(1)用于病理學(xué)檢測或原位雜交，需新鮮或固定保存。***（具體說明）**新鮮組織可直接用于冰凍切片，以保留細(xì)胞形態(tài)和抗原性。對于需要長期保存或轉(zhuǎn)運(yùn)的樣本，需立即放入4%多聚甲醛溶液或含RNAlater固定液的容器中，并在規(guī)定時(shí)間內(nèi)進(jìn)行固定（通常4-6小時(shí)）。固定劑的選擇和固定時(shí)間會(huì)直接影響后續(xù)染色效果。

***糞便/尿液：**糞便樣本常用于檢測腸道病原體的抗原（如輪狀病毒、腺病毒）、病原體核酸（如寄生蟲卵、細(xì)菌16SrRNA）或糞便菌群組成。尿液樣本可用于檢測泌尿道感染相關(guān)的病原體抗原（如乳膠凝集法檢測淋病奈瑟菌）或病原體核酸（如尿路病原體PCR檢測）。

**(3)用于病原體抗原或核酸檢測，避免污染。***（具體說明）**采集糞便時(shí)，應(yīng)使用干凈的無菌容器，避免糞便表面粘附的尿液或雜物污染。對于需要檢測病原體核酸的糞便樣本，需注意運(yùn)輸過程中的溫度控制，防止RNA降解。尿液樣本采集前建議清潔外陰，防止污染。

***呼吸道拭子：**特別是鼻咽拭子，是檢測呼吸道病原體（如流感病毒、冠狀病毒、腺病毒）最常用的樣本類型。其優(yōu)點(diǎn)是操作簡便、患者配合度高。

**(4)常用鼻咽拭子，采集時(shí)避免接觸采樣器頭端。***（具體說明）**采集時(shí)，采樣器頭端應(yīng)深入鼻腔后部或鼻咽部，按照說明書要求的旋轉(zhuǎn)次數(shù)和停留時(shí)間進(jìn)行充分采樣。關(guān)鍵在于采樣頭端不能接觸到拭子桿，以防止樣本被污染。采集后的拭子應(yīng)立即放入含運(yùn)輸液的采樣管中，確保病毒在運(yùn)輸過程中保持活性。

2.**采集操作要點(diǎn)****（擴(kuò)寫）**

***嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作，使用一次性采樣工具。****（具體說明）**所有采樣工具，包括拭子、注射器、采血管等，必須是無菌包裝，且為一次性使用。操作人員需洗手或使用含酒精的消毒劑進(jìn)行手部消毒，穿戴潔凈手套。采樣環(huán)境應(yīng)盡量清潔，必要時(shí)進(jìn)行空間消毒。

**(1)嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作，使用一次性采樣工具。***（補(bǔ)充細(xì)節(jié)）**例如，采集血液樣本時(shí)，應(yīng)使用經(jīng)過驗(yàn)證的采血管（如EDTA抗凝管、肝素抗凝管），確?？鼓齽舛葴?zhǔn)確，避免溶血或凝血影響檢測結(jié)果。采血部位需用75%酒精消毒，待酒精揮發(fā)后再用無菌干棉簽按壓止血。

***按照標(biāo)準(zhǔn)劑量采集，如血清需3-5mL，拭子需旋轉(zhuǎn)擦拭至少10秒。****（具體說明）**不同檢測項(xiàng)目對樣本量的要求不同。血清學(xué)檢測通常需要3-5mL血液，以保證有足夠的樣本進(jìn)行檢測和復(fù)孔。對于拭子樣本，需確保拭子在目標(biāo)部位（如鼻咽部、陰道內(nèi)）充分旋轉(zhuǎn)，以獲取足夠的病原體核酸或細(xì)胞成分。例如，鼻咽拭子采集時(shí)，應(yīng)在雙側(cè)鼻咽部各旋轉(zhuǎn)擦拭至少5-10次。

**(2)按照標(biāo)準(zhǔn)劑量采集，如血清需3-5mL，拭子需旋轉(zhuǎn)擦拭至少10秒。***（補(bǔ)充示例）**如果檢測病原體DNA，可能需要多個(gè)拭子或特定類型的拭子（如細(xì)胞保存拭子）來提高核酸回收率。具體要求應(yīng)參照相應(yīng)檢測方法的SOP。

***標(biāo)記樣本管，注明采集時(shí)間、編號及患者信息（脫敏處理）。****（具體說明）**每個(gè)樣本管必須清晰、唯一地標(biāo)記，包含樣本編號、采集日期和時(shí)間、患者姓名（或代號為脫敏處理后的標(biāo)識）、樣本類型等信息。標(biāo)記應(yīng)牢固、耐久，避免在運(yùn)輸或處理過程中脫落或模糊?；颊咝畔⒚撁粜璺想[私保護(hù)要求，僅保留必要的關(guān)鍵信息用于追溯，且在報(bào)告環(huán)節(jié)隱去。

**(3)標(biāo)記樣本管，注明采集時(shí)間、編號及患者信息（脫敏處理）。***（補(bǔ)充細(xì)節(jié)）**標(biāo)記順序建議為：樣本類型（如Ser）+編號（如Sample001）+采集日期（如20231027）。樣本管應(yīng)放置在合適的標(biāo)簽紙上，并確保標(biāo)簽粘貼平整。對于需要特殊處理的樣本（如低溫保存），應(yīng)在標(biāo)簽上明確注明。

3.**樣本保存與運(yùn)輸****（擴(kuò)寫）**

***血清樣本需室溫保存30分鐘以上，避免凍融。****（具體說明）**采集后的血清樣本可在室溫（15-25℃）下放置30分鐘以上，讓管內(nèi)血細(xì)胞充分沉淀，形成清晰的血清層，減少白細(xì)胞和血小板干擾。但在室溫下時(shí)間不宜過長（一般不超過2小時(shí)），且需盡快分離血清或進(jìn)行冷藏。嚴(yán)禁反復(fù)凍融，因?yàn)閮鋈谶^程會(huì)破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，影響檢測結(jié)果，特別是抗體檢測和某些抗原檢測。

**(1)血清樣本需室溫保存30分鐘以上，避免凍融。***（補(bǔ)充注意事項(xiàng)）**如果無法立即處理，應(yīng)將樣本置于2-8℃冰箱冷藏。冷凍保存時(shí)，應(yīng)使用合適的凍存管，避免反復(fù)凍融，建議分裝后凍存。

***組織樣本立即固定于10%甲醛溶液或RNAlater溶液中。****（具體說明）**新鮮組織樣本應(yīng)在采集后立即處理。對于需要進(jìn)行石蠟包埋的組織，需立即放入盛有10%中性緩沖甲醛溶液的容器中，確保組織完全浸沒。甲醛濃度和固定時(shí)間對組織學(xué)染色至關(guān)重要，通常需固定12-24小時(shí)。對于需要做RNA檢測的組織，應(yīng)使用RNAlater溶液進(jìn)行滲透固定，或立即進(jìn)行RNA提取操作，以最大限度保護(hù)RNA完整性。

**(2)組織樣本立即固定于10%甲醛溶液或RNAlater溶液中。***（補(bǔ)充細(xì)節(jié)）**固定液的體積應(yīng)足夠大，以保證所有組織塊均能被充分浸泡。容器應(yīng)標(biāo)注樣本信息、固定液種類和加入時(shí)間。對于體積較大的組織，可能需要分塊固定。

***運(yùn)輸時(shí)使用冷藏箱（2-8℃），確保樣本在4小時(shí)內(nèi)到達(dá)實(shí)驗(yàn)室。****（具體說明）**對于需要冷藏運(yùn)輸?shù)臉颖荆ㄈ缪?、尿液、部分拭子樣本），?yīng)使用帶冰袋或冷藏箱的保溫箱，維持運(yùn)輸過程中的溫度在2-8℃之間。記錄運(yùn)輸時(shí)間，確保樣本在規(guī)定時(shí)間內(nèi)（通常是4小時(shí)）送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，以保證檢測結(jié)果的穩(wěn)定性。對于冷凍樣本，則需使用干冰或?qū)ｉT的冷凍運(yùn)輸盒，確保全程溫度在-20℃以下。運(yùn)輸過程中應(yīng)避免劇烈震動(dòng)和傾倒。

**(3)運(yùn)輸時(shí)使用冷藏箱（2-8℃），確保樣本在4小時(shí)內(nèi)到達(dá)實(shí)驗(yàn)室。***（補(bǔ)充要求）**運(yùn)輸箱外部應(yīng)有“生物樣本，需冷藏”等警示標(biāo)識。到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后，應(yīng)立即檢查樣本狀態(tài)和溫度記錄，確認(rèn)樣本未受損害且符合要求。如果運(yùn)輸時(shí)間超過預(yù)期，可能需要重新評估樣本的有效性。

（二）檢測方法選擇與實(shí)施**（擴(kuò)寫）**

1.**檢測方法分類****（擴(kuò)寫）**

***酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）：**這是一種廣泛應(yīng)用于血清學(xué)檢測的技術(shù)，通過酶標(biāo)記的抗體或抗原與樣本中的目標(biāo)分子結(jié)合，加入酶底物后產(chǎn)生顯色反應(yīng)，通過酶標(biāo)儀測定吸光度值進(jìn)行定量或定性判斷。

**(1)用于抗體或抗原檢測，靈敏度高。***（具體說明）**ELISA可以設(shè)計(jì)成多種模式：

***間接ELISA：**檢測樣本中的抗體。先用已知抗原包被板孔，加入樣本，洗去未結(jié)合物，再加入酶標(biāo)二抗，最后加底物顯色。結(jié)果與樣本中抗體濃度成正比。

***直接ELISA：**檢測樣本中的抗原。直接用已知抗原包被板孔，加入樣本，洗去未結(jié)合物，再加入酶標(biāo)單抗，最后加底物顯色。結(jié)果與樣本中抗原濃度成正比。

***競爭ELISA：**常用于小分子抗原（如藥物、激素）或核酸檢測產(chǎn)物的檢測。樣本中的目標(biāo)物與酶標(biāo)物競爭結(jié)合有限數(shù)量的抗體，結(jié)合量與樣本濃度成反比。

***雙抗體夾心ELISA：**檢測樣品中存在的特定抗原。需同時(shí)存在針對抗原兩個(gè)不同表位的抗體（包被抗體和酶標(biāo)抗體），形成“夾心”結(jié)構(gòu)。靈敏度和特異性較高。

***化學(xué)發(fā)光免疫分析：**利用化學(xué)發(fā)光劑（如辣根過氧化物酶標(biāo)記的底物TPO-TMB）在酶催化下發(fā)光，通過時(shí)間分辨熒光或微孔板讀數(shù)儀檢測發(fā)光信號。相比傳統(tǒng)ELISA，具有更高的靈敏度、更寬的線性范圍和更快的檢測速度。

**(2)適用于定量檢測，線性范圍寬。***（具體說明）**該技術(shù)特別適用于需要精確量化指標(biāo)的場景，如檢測病毒載量（HIVRNA、HBVDNA）、激素水平（皮質(zhì)醇、睪酮）、腫瘤標(biāo)志物（AFP、CA125）等。其信號幅度高，噪音低，能夠檢測到極低濃度的目標(biāo)分子。

***免疫熒光技術(shù)：**通過熒光標(biāo)記的抗體或抗原與樣本中的目標(biāo)分子結(jié)合，在熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀下觀察熒光信號?？捎糜诩?xì)胞內(nèi)病原體檢測、組織切片中的抗原定位等。

**(3)通過熒光標(biāo)記抗體觀察細(xì)胞內(nèi)病原體。***（具體說明）**例如，在細(xì)胞培養(yǎng)物或組織切片上，用熒光二抗（如AlexaFluor標(biāo)記）結(jié)合已用特異性一抗（如針對病毒衣殼蛋白）孵育的樣本，可以在熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞內(nèi)或組織內(nèi)的病原體分布。流式細(xì)胞術(shù)則可用于對懸浮細(xì)胞群體進(jìn)行高通量分析，檢測單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的病原體標(biāo)志物。

2.**操作步驟（以ELISA為例）****（擴(kuò)寫）**

***(1)試劑準(zhǔn)備：****（詳細(xì)步驟）**檢測前1-2小時(shí)，將所有試劑（酶標(biāo)板、標(biāo)準(zhǔn)品、樣本稀釋液、洗滌液、酶標(biāo)抗體/抗原、底物溶液、終止液等）從冰箱（通常2-8℃或-20℃）取出，置于室溫平衡至與室溫一致（約15-25℃）。平衡時(shí)間通常為30分鐘。平衡后的試劑應(yīng)檢查有無沉淀或變色，如有異常應(yīng)立即停止檢測并報(bào)告。洗滌液需使用純水或去離子水稀釋至指定濃度，并混勻。底物溶液配制需嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，通常臨用前配制，并避免光照。

**(1)試劑準(zhǔn)備：平衡酶標(biāo)板至室溫，稀釋標(biāo)準(zhǔn)品與樣本。***（補(bǔ)充細(xì)節(jié)）**酶標(biāo)板在使用前需用洗滌液潤洗3-5次，每次約3-5分鐘，以去除包裝板內(nèi)的保護(hù)液。標(biāo)準(zhǔn)品和樣本根據(jù)說明書要求用樣本稀釋液或稀釋緩沖液進(jìn)行稀釋。稀釋倍數(shù)需記錄清楚，并在計(jì)算結(jié)果時(shí)考慮。

***(2)加樣：****（詳細(xì)步驟）**按照標(biāo)準(zhǔn)品、空白對照、陰性對照、樣本的順序，將各加樣孔加入相應(yīng)液體。加樣量需精確，通常為100-200μL/孔。使用不同吸頭區(qū)分不同樣本/試劑，避免交叉污染。加樣時(shí)動(dòng)作應(yīng)輕柔，避免產(chǎn)生氣泡。加完后，可輕輕晃動(dòng)酶標(biāo)板或用吸頭在孔內(nèi)輕柔吹打，使液體充分混合。

**(2)依次加入樣本、酶標(biāo)抗體、底物溶液，每步需混勻。***（補(bǔ)充細(xì)節(jié)）**加入酶標(biāo)抗體或抗原后，建議在室溫（或37℃）下孵育一定時(shí)間（如30-60分鐘），期間可輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板或放置在恒溫振蕩器上。孵育結(jié)束后，需徹底洗滌，通常洗滌3-5次，每次用洗滌液洗滌300-500μL/孔，每次洗滌后用吸水紙或吸頭輕輕拍干板底（或通過酶標(biāo)板洗板器）。洗滌是去除未結(jié)合物、降低背景的關(guān)鍵步驟。

***(3)反應(yīng)條件：****（詳細(xì)步驟）**加入底物溶液后，需在避光條件下進(jìn)行顯色反應(yīng)。避光非常重要，因?yàn)楣庹諘?huì)消耗底物，影響結(jié)果準(zhǔn)確性。顯色時(shí)間需嚴(yán)格控制在說明書推薦的范圍內(nèi)，一般為15-30分鐘。顯色時(shí)間過短可能導(dǎo)致信號不足，過長則可能線性范圍變窄。在顯色期間，酶標(biāo)板應(yīng)保持在室溫，避免震動(dòng)。

**(3)反應(yīng)條件：37℃孵育30分鐘，TMB顯色15-20分鐘。***（補(bǔ)充說明）**溫育/孵育溫度和時(shí)間是影響反應(yīng)效率的因素。ELISA通常在室溫（18-25℃）或37℃進(jìn)行。37℃可加速反應(yīng)，但需注意某些酶在高溫下活性可能下降或產(chǎn)生非特異性結(jié)合。TMB底物顯色對溫度敏感，過高溫度可能導(dǎo)致氧化加速。

***(4)終止反應(yīng)：****（詳細(xì)步驟）**顯色結(jié)束后，立即加入終止液（通常是H?SO?或HCl溶液）。終止液的作用是使酶促反應(yīng)停止，并將藍(lán)色氧化態(tài)的TMB轉(zhuǎn)化為黃色，使顏色變化完全。加入終止液后，應(yīng)立即在酶標(biāo)儀上讀取吸光度值。終止液加入后，板孔顏色會(huì)迅速變化，需盡快讀數(shù)。

**(4)立即酶標(biāo)儀讀數(shù)。***（補(bǔ)充操作）**酶標(biāo)儀應(yīng)預(yù)熱30分鐘以上。設(shè)置正確的波長（如TMB法為450nm，參考波長通常為630nm）。依次讀取各孔的吸光度值。讀數(shù)時(shí)，應(yīng)確保酶標(biāo)板放置平穩(wěn)，避免晃動(dòng)。

***(5)數(shù)據(jù)處理：****（補(bǔ)充步驟）**讀取數(shù)據(jù)后，使用配套的軟件或手動(dòng)計(jì)算結(jié)果。包括計(jì)算平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、背景吸光度校正等。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣本的吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出樣本的濃度或相對值。注意檢查標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)（R2），通常要求R2>0.99。

3.**質(zhì)量控制措施****（擴(kuò)寫）**

***(1)每板設(shè)置陰性對照、陽性對照及空白對照。****（詳細(xì)說明）**

***陰性對照（零標(biāo)準(zhǔn)）：**使用無特異性結(jié)合能力的樣本或緩沖液（如樣本稀釋液），用于檢測非特異性結(jié)合和背景信號。其吸光度值應(yīng)盡可能低，通常要求低于某個(gè)閾值（如標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)的吸光度值）。

***陽性對照：**使用已知濃度的陽性樣本或標(biāo)準(zhǔn)品，用于驗(yàn)證檢測系統(tǒng)的靈敏度、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。其吸光度值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)，且符合預(yù)期。

***空白對照（零空白）：**使用不含樣本和酶標(biāo)試劑的板孔（僅含包被液和洗滌液），用于檢測試劑、加樣過程或洗滌液中的潛在污染。其吸光度值應(yīng)非常低，接近0。

***(1)每板設(shè)置陰性對照、陽性對照及空白對照。***（補(bǔ)充目的）**通過對比陰性對照吸光度值與空白對照吸光度值，可以判斷是否存在背景污染。對比陽性對照吸光度值與預(yù)期值及標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以判斷檢測是否有效進(jìn)行。

***(2)使用已知濃度的質(zhì)控品，評估檢測線性范圍。****（詳細(xì)說明）**質(zhì)控品（Control）是已知準(zhǔn)確濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或樣本，用于監(jiān)控檢測過程的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。定期（如每天、每周）使用質(zhì)控品進(jìn)行檢測，觀察其吸光度值是否在允許的范圍內(nèi)（通常為預(yù)期值的±10%或±15%）。這有助于發(fā)現(xiàn)潛在的漂移或問題。線性范圍是指檢測方法能夠準(zhǔn)確量化的濃度區(qū)間，可通過使用一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品來確定。確保樣本濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)是獲得準(zhǔn)確結(jié)果的前提。

**(2)使用已知濃度的質(zhì)控品，評估檢測線性范圍。***（補(bǔ)充應(yīng)用）**例如，如果質(zhì)控品的預(yù)期濃度為100IU/mL，檢測后的吸光度值對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為95-105IU/mL，則認(rèn)為該點(diǎn)在允許范圍內(nèi)，檢測穩(wěn)定。如果吸光度值對應(yīng)濃度為85-115IU/mL，則提示線性范圍可能存在問題，需要檢查或重新校準(zhǔn)。

***(3)定期校準(zhǔn)儀器，如酶標(biāo)儀的吸光度讀數(shù)誤差應(yīng)<1%。****（詳細(xì)說明）**酶標(biāo)儀是關(guān)鍵檢測設(shè)備，其準(zhǔn)確性直接影響結(jié)果。應(yīng)按照制造商的說明，使用標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)液（如SRM2509，NISTtraceablestandard）定期校準(zhǔn)酶標(biāo)儀的吸光度讀數(shù)。校準(zhǔn)應(yīng)檢查在常用檢測波長（如450nm）處的零點(diǎn)（空白）和吸光度讀數(shù)精度。確保在整個(gè)檢測過程中，不同板孔間的吸光度讀數(shù)誤差小于1%，以保證結(jié)果的可比性。

**(3)定期校準(zhǔn)儀器，如酶標(biāo)儀的吸光度讀數(shù)誤差應(yīng)<1%。***（補(bǔ)充校準(zhǔn)內(nèi)容）**除了零點(diǎn)校準(zhǔn)和精度校準(zhǔn)，還應(yīng)定期檢查儀器的雜散光（straylight）水平，雜散光過高會(huì)降低檢測靈敏度。校準(zhǔn)記錄應(yīng)妥善保存，作為質(zhì)量控制的證明文件。

（三）結(jié)果判讀與報(bào)告**（擴(kuò)寫）**

1.**定性/定量分析****（擴(kuò)寫）**

***(1)定性：根據(jù)cut-off值判斷結(jié)果（陽性/陰性）。****（詳細(xì)說明）**定性分析通常是將樣本的吸光度值或相對值與一個(gè)預(yù)設(shè)的閾值（cut-off值）進(jìn)行比較。cut-off值的設(shè)定通?；陉幮詫φ?、空白對照以及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法（如Youden指數(shù)法）計(jì)算得出，旨在最大化靈敏度和特異性的平衡。如果樣本值≥cut-off值，判讀為陽性；如果樣本值<cut-off值，判讀為陰性。cut-off值可能因試劑批號、檢測條件、實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)等因素而有所不同，需要定期復(fù)核和調(diào)整。

**(1)定性：根據(jù)cut-off值判斷結(jié)果（陽性/陰性）。***（補(bǔ)充判斷依據(jù)）**例如，對于ELISA檢測IgM抗體，cut-off值可能設(shè)定為陰性對照平均吸光度值加上2-3倍標(biāo)準(zhǔn)差。如果樣本吸光度值高于此cut-off值，則判為IgM陽性，提示近期感染。

***(2)定量：繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣本濃度（如抗體滴度≥1:64為陽性）。****（詳細(xì)說明）**定量分析是測定樣本中目標(biāo)分析物的具體濃度或相對含量。通過將一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品在相同條件下進(jìn)行檢測，獲得標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（通常為吸光度值對濃度作圖，擬合直線或非線性曲線）。樣本檢測后，將其吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出對應(yīng)的濃度。結(jié)果通常以pg/mL、IU/mL、拷貝數(shù)/mL等單位表示。有時(shí)也會(huì)用滴度表示，如血清學(xué)抗體滴度，通過倍比稀釋樣本后檢測，找到最高稀釋倍數(shù)仍能產(chǎn)生陽性結(jié)果的倍數(shù)，如抗體滴度≥1:64。

**(2)定量：繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣本濃度（如抗體滴度≥1:64為陽性）。***（補(bǔ)充計(jì)算方法）**定量結(jié)果的準(zhǔn)確性取決于標(biāo)準(zhǔn)曲線的質(zhì)量和樣本是否在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)。如果樣本濃度超出標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍，可能需要重新配制標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)颖具M(jìn)行適當(dāng)稀釋后再檢測。抗體滴度的測定通常需要制作對數(shù)稀釋系列，如1:10,1:20,1:40...，找到能通過定性判讀（如達(dá)到cut-off值）的最高稀釋倍數(shù)。

2.**異常結(jié)果處理****（擴(kuò)寫）**

***(1)陰性樣本需復(fù)核，如重復(fù)檢測仍陰性則排除感染。****（詳細(xì)說明）**對于初步判讀為陰性的樣本，尤其是臨床意義較大的樣本，建議進(jìn)行復(fù)核。復(fù)核方法可以是重復(fù)進(jìn)行一次完整的檢測（即重新加樣、孵育、洗滌、讀數(shù)），或者只重復(fù)關(guān)鍵的孵育和讀數(shù)步驟。如果復(fù)核結(jié)果仍為陰性，且樣本質(zhì)量良好（無溶血、渾濁等），則可以認(rèn)為該樣本未檢測到目標(biāo)分析物，結(jié)論為陰性。但需結(jié)合臨床情況綜合判斷。

**(1)陰性樣本需復(fù)核，如重復(fù)檢測仍陰性則排除感染。***（補(bǔ)充條件）**復(fù)核時(shí)要注意排除假陰性的可能原因，如樣本采集不當(dāng)、運(yùn)輸保存問題、試劑或儀器故障、操作誤差等。如果復(fù)核結(jié)果為陽性，則應(yīng)分析兩次結(jié)果差異的原因。

***(2)陽性樣本建議復(fù)查，結(jié)合臨床癥狀綜合判讀。****（詳細(xì)說明）**對于初步判讀為陽性的樣本，也建議進(jìn)行復(fù)查。復(fù)查同樣可以通過重復(fù)檢測進(jìn)行。即使復(fù)查結(jié)果為陰性，也不能簡單地否定初檢陽性結(jié)果，可能存在檢測窗口期、樣本中干擾物質(zhì)或檢測方法靈敏度不足等因素。最終結(jié)果的判讀必須結(jié)合患者的臨床癥狀、流行病學(xué)史、既往病史以及其他輔助檢查結(jié)果（如病原體培養(yǎng)、核酸檢測等）進(jìn)行綜合評估。

**(2)陽性樣本建議復(fù)查，結(jié)合臨床癥狀綜合判讀。***（補(bǔ)充注意事項(xiàng)）**特別是在出現(xiàn)假陽性結(jié)果時(shí)，分析原因至關(guān)重要?？赡艿脑虬颖疚廴荆ㄈ绮僮鏖g污染、試劑污染）、非特異性結(jié)合、操作錯(cuò)誤等。需要采取嚴(yán)格的生物安全措施和標(biāo)準(zhǔn)化操作流程來減少假陽性風(fēng)險(xiǎn)。

3.**報(bào)告規(guī)范****（擴(kuò)寫）**

***(1)明確檢測項(xiàng)目、樣本編號及檢測時(shí)間。****（詳細(xì)說明）**檢測報(bào)告必須包含清晰、準(zhǔn)確的信息。首先是檢測的項(xiàng)目名稱（如“乙型肝炎表面抗體定量檢測”）。其次是樣本標(biāo)識（樣本編號），確保與樣本采集時(shí)的編號一致，用于追溯。最后是檢測完成的時(shí)間或日期。

**(1)明確檢測項(xiàng)目、樣本編號及檢測時(shí)間。***（補(bǔ)充要求）**報(bào)告抬頭應(yīng)清晰標(biāo)明實(shí)驗(yàn)室名稱和報(bào)告日期。

***(2)列出關(guān)鍵參數(shù)，如Ct值、S/CO比值等。****（詳細(xì)說明）**報(bào)告中應(yīng)包含檢測結(jié)果本身以及用于計(jì)算結(jié)果的關(guān)鍵參數(shù)。對于定量檢測，通常是樣本濃度值及其單位。對于定性檢測，是陽性/陰性判斷。對于使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）等方法的檢測，會(huì)報(bào)告Ct（CycleThreshold）值，即熒光信號達(dá)到設(shè)定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，Ct值越小，表示樣本初始病毒載量越高。對于化學(xué)發(fā)光或ELISA檢測，常報(bào)告S/CO（Sample/Cut-off）比值，即樣本吸光度值與cut-off值的比值，比值越大，表示陽性程度越高。這些原始或中間參數(shù)有時(shí)對臨床醫(yī)生理解結(jié)果或進(jìn)行趨勢分析有幫助。

**(2)列出關(guān)鍵參數(shù)，如Ct值、S/CO比值等。***（補(bǔ)充說明）**報(bào)告還應(yīng)包含檢測限（LOD）和定量限（LOQ）信息，以及參考區(qū)間（如果適用）。參考區(qū)間是基于健康人群數(shù)據(jù)建立的，用于判斷結(jié)果是否在正常范圍內(nèi)，但需注意參考區(qū)間可能因?qū)嶒?yàn)室、檢測方法、人群差異等因素不同。

***(3)附注檢測方法的局限性，如交叉反應(yīng)率<5%。****（詳細(xì)說明）**報(bào)告中應(yīng)包含檢測方法的簡要說明，并指出其局限性。這有助于使用者正確解讀結(jié)果。例如，對于ELISA檢測，可能需要說明檢測的靶標(biāo)、已知的可能干擾物（如高濃度類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體）、以及方法的預(yù)期靈敏度（如檢測限）。對于某些方法，如免疫印跡法用于HIV抗體確證，需要說明窗口期和可能出現(xiàn)的假陽性/假陰性結(jié)果類型。如果方法學(xué)評估中有交叉反應(yīng)率數(shù)據(jù)，應(yīng)在報(bào)告中注明，以提示潛在的干擾可能。

**(3)附注檢測方法的局限性，如交叉反應(yīng)率<5%。***（補(bǔ)充目的）**提供這些信息是為了確保報(bào)告的完整性和透明度，讓臨床醫(yī)生和科研人員了解檢測結(jié)果的可靠性和可能的影響因素，避免誤判。

（四）流程優(yōu)化與記錄**（擴(kuò)寫）**

1.**優(yōu)化建議****（詳細(xì)說明）**

***(1)定期評估檢測靈敏度（如使用spikingsamples）。****（具體操作）**靈敏度是指檢測方法能夠識別出最低濃度目標(biāo)分析物的能力。定期使用spikingsamples（即已知