ICS65.020.01

CCSB25

15

內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)

DB15/T2602—2022

苜蓿中咪草煙殘留量的測(cè)定

高效液相色譜法

DeterminationofImazethapyrresidueinalfalfa-Highperformanceliquid

chromatography

2022-06-24發(fā)布2022-07-24實(shí)施

內(nèi)蒙古自治區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布

DB15/T2602—2022

目次

前言.................................................................................II

1范圍...............................................................................1

2規(guī)范性引用文件.....................................................................1

3術(shù)語(yǔ)和定義.........................................................................1

4原理...............................................................................1

5試劑和材料.........................................................................1

6儀器和設(shè)備.........................................................................2

7試樣制備...........................................................................2

8測(cè)定步驟...........................................................................2

9結(jié)果計(jì)算和表示.....................................................................3

10精密度............................................................................4

附錄A（資料性）高效液相色譜法測(cè)定咪草煙標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜法...............................5

I

DB15/T2602—2022

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（SAM/TC19）歸口。

本文件起草單位：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所、內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量安全中心、內(nèi)蒙古自治

區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院、太仆寺旗現(xiàn)代農(nóng)牧業(yè)綜合服務(wù)中心。

本文件主要起草人：吳洪新、王文曦、云穎、盈盈、付慧、黃奕穎、楊紅東、姚繼紅、王冠、云巖

春、張慧澤、劉洪林、衛(wèi)媛、李薇、李潤(rùn)航、降曉偉、李坤娜、張燕東、劉宇寧、湖日爾、劉江英、趙

志惠。

II

DB15/T2602—2022

苜蓿中咪草煙殘留量的測(cè)定

高效液相色譜法

1范圍

本文件規(guī)定了高效液相色譜法測(cè)定苜蓿中咪草煙殘留量的原理、試劑和材料、儀器和設(shè)備、試樣制

備、測(cè)定步驟、結(jié)果計(jì)算和表示、精密度。

本文件適用于苜蓿中咪草煙殘留量的測(cè)定。

本文件的檢出限為0.025mg/kg。

本文件的定量限為0.10mg/kg。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

GB/T14699.1飼料采樣

GB/T20195動(dòng)物飼料試樣的制備

3術(shù)語(yǔ)和定義

本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。

4原理

試樣中咪草煙殘留物樣品經(jīng)過(guò)甲醇和碳酸鈉提取液提取、離心、萃取、旋蒸，用離子交換型（SCX）

固相萃取小柱凈化，甲醇和氨水洗脫，用高效液相色譜儀測(cè)定，外標(biāo)法定量。

5試劑和材料

乙腈（CH3CN）：色譜純。

甲醇（CH3OH）：色譜純。

磷酸（H3PO4）：優(yōu)級(jí)純。

二氯甲烷（CH2Cl2）。

冰乙酸（CH3COOH）：優(yōu)級(jí)純。

氨水（NH4OH）。

無(wú)水硫酸鈉（Na2SO4）：優(yōu)級(jí)純。

碳酸鈉（Na2CO3）：優(yōu)級(jí)純。

碳酸鈉溶液（0.1mol/L）：稱取10.6g碳酸鈉，用水溶解，定容至1L容量瓶中。

1

DB15/T2602—2022

甲醇-碳酸鈉溶液（1+1，v/v）：量取100mL甲醇，加入100mL碳酸鈉溶液（5.9），混勻。

磷酸溶液（1+9，v/v）：量取10mL磷酸，用水稀釋定容至100mL。

氨水-甲醇（1+9，v/v）：量取10mL氨水，加入90mL甲醇，混勻。

水+甲醇（1+9，v/v）：量取10mL水，加入90mL甲醇，混勻。

乙酸溶液（5+95，v/v）：量取5mL冰乙酸，用水稀釋定容至100mL。

標(biāo)準(zhǔn)品：咪草煙（C15H19N3O3）：純度不小于95%，或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物

質(zhì)。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1.00mg/mL)：準(zhǔn)確稱取適量的咪草煙標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇溶解并配制成(1.00mg/mL)

的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，保存于-18℃冰箱內(nèi)，可使用6個(gè)月。

標(biāo)準(zhǔn)使用液：準(zhǔn)確吸取0.10mL咪草煙的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(5.16)至10mL容量瓶?jī)?nèi)，用甲醇稀釋定容

至刻度，配制成10.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，于-18℃冰箱內(nèi)避光保存，可使用1個(gè)月。

標(biāo)準(zhǔn)系列工作液：分別吸取濃度為10.0μg/mL咪草煙標(biāo)準(zhǔn)液0.25mL、0.50mL、1.00mL、

1.50mL、2.00mL于10.00mL容量瓶，用水+甲醇(5.13)定容至刻度，該標(biāo)準(zhǔn)系列咪草煙濃度分別為

0.25μg/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL、1.50μg/mL、2.00μg/mL。

固相萃取柱：SCX，60mg/3mL。

微孔過(guò)濾膜（尼龍）：13mm×0.22μm。

注：除非另有規(guī)定，在分析中僅使用確認(rèn)為分析純的試劑和GB/T6682所規(guī)定的一級(jí)水。

6儀器和設(shè)備

高效液相色譜儀：配有紫外檢測(cè)器（或二極管陣列檢測(cè)器）。

電子天平：感量0.01mg和0.01g。

離心機(jī)：轉(zhuǎn)速大于等于4000r/min。

超聲波水浴。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

渦旋混合器。

氮吹儀。

組織粉碎機(jī)。

樣品篩：篩孔尺寸1.0mm。

7試樣制備

按照GB/T14699.1中有關(guān)規(guī)定采集樣品，去雜質(zhì)后充分混勻，按照GB/T20195制備試樣，利用四分

法取樣后，充分研磨，過(guò)1.0mm篩，新鮮樣品利用四分法取樣后，充分破碎作為分析樣品備用，將處理

好的試樣放置-18℃冰箱保存。

8測(cè)定步驟

提取

準(zhǔn)確稱取苜蓿新鮮樣品5g（精確至0.01g）或草粉2g（精確至0.01g）于50mL的塑料離心管中，

加入30mL的甲醇-碳酸鈉溶液（5.10），混勻，超聲提取30min，用磷酸溶液（5.11）調(diào)至pH=2.5，于

4000r/min離心10min，收集上清液于分液漏斗中，用50mL二氯甲烷（5.4）萃取兩次（25mL+25mL），

2

DB15/T2602—2022

有機(jī)相加適量無(wú)水硫酸鈉（5.7）除水后收集于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，于45℃減壓蒸至近干，加適量甲醇（5.2）

溶解。

凈化

強(qiáng)陽(yáng)離子交換固相萃取柱SCX（5.19）凈化，用1mL水、1mL甲醇（5.2）活化固相萃取柱，試樣全

部過(guò)柱，用1mL水、1mL甲醇（5.2）淋洗固相萃取柱，再用6mL氨水-甲醇（5.12）洗脫，收集流出液

于10mL比色管中，整個(gè)固相萃取過(guò)程流速不超過(guò)1mL/min。洗脫液于50℃條件下氮吹至近干，用2.00

mL水-甲醇（5.13）溶解、渦旋混勻，過(guò)0.22μm微孔過(guò)濾膜（5.20），待測(cè)。

測(cè)定

8.3.1相液色譜測(cè)定參考條件

液相色譜法測(cè)定參考條件如下：

a)色譜柱：C18型柱，長(zhǎng)150mm，內(nèi)徑3.9mm，粒徑5μm，或等效的色譜柱；

b)流動(dòng)相：A:乙酸（5.14）+B:乙腈（5.1）=60+40（v/v）；

c)流速：1.0mL/min；

d)進(jìn)樣量：10.00μL；

e)柱溫：40℃；

f)檢測(cè)波長(zhǎng)：258nm。

8.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

按照8.3.1測(cè)定條件，將標(biāo)準(zhǔn)工作液（5.18）注入高效液相色譜儀中進(jìn)行測(cè)試。測(cè)定相應(yīng)的峰面積，

以標(biāo)準(zhǔn)工作液（5.18）的濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

8.3.3試樣溶液的測(cè)定

按照8.3.1測(cè)定條件，將待測(cè)樣品溶液注入高效液相色譜儀中進(jìn)行測(cè)試。待測(cè)樣品溶液中目標(biāo)物質(zhì)

的響應(yīng)值應(yīng)在儀器線性范圍內(nèi)，否則應(yīng)適當(dāng)稀釋。標(biāo)準(zhǔn)工作液與待測(cè)樣品溶液等體積進(jìn)樣。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶

液色譜峰的保留時(shí)間和峰面積，對(duì)試樣溶液的色譜峰根據(jù)保留時(shí)間進(jìn)行定性，外標(biāo)法定量。咪草煙標(biāo)準(zhǔn)

溶液色譜圖見(jiàn)附錄A中圖A.1。

平行實(shí)驗(yàn)

按上述步驟，對(duì)同一試樣進(jìn)行平行試驗(yàn)測(cè)定。

空白實(shí)驗(yàn)

除不稱取試樣外，均按上述分析步驟進(jìn)行。

9結(jié)果計(jì)算和表示

試樣中咪草煙含量X按式（1）計(jì)算：

（C-C0）×V

X=······································································(1)

m

式中：

X——試樣中咪草煙的含量，mg/kg；

3

DB15/T2602—2022

C——待測(cè)液中咪草煙的濃度，μg/mL；

C0——試劑空白；

V——試樣溶液定容體積，mL；

m——試樣的稱樣量，g。

注：測(cè)定結(jié)果用算術(shù)平均值表示，保留兩位有效數(shù)字。

10精密度

在