ICS65.020.20

B22

DB4201

武漢市地方標(biāo)準(zhǔn)

DB4201/T520—2017

兩系雜交水稻品種純度SSR鑒定方法

2017-06-20發(fā)布2017-07-20實施

武漢市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布

DB4201/T520-2017

前言

本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。

本標(biāo)準(zhǔn)由武漢市農(nóng)業(yè)委員會歸口。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中墾錦繡華農(nóng)武漢科技有限公司、武漢市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：徐姮、許樹文、昌華敏、熊恒多、李晏斌、劉萬里、萬元香。

本標(biāo)準(zhǔn)首次發(fā)布。

I

DB4201/T520-2017

兩系雜交水稻品種純度SSR鑒定方法

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了用SSR分析技術(shù)進(jìn)行兩系雜交水稻品種純度鑒定的原理、儀器設(shè)備及試劑、相關(guān)試劑

及溶液配制、推薦引物、操作程序、統(tǒng)計與計算的方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于兩系雜交水稻品種純度的快速鑒定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T3543.2農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程扦樣

GB/T3543.4農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程發(fā)芽試驗

GB/T3543.5農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程真實性和品種純度鑒定

GB4404.1-2008糧食作物種子第1部分：禾谷類

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

引物

一條互補(bǔ)結(jié)合在模板DNA鏈上的短的單鏈，提供3'-OH末端作DNA合成的起點，延伸合成模版DNA的互

補(bǔ)鏈。

3.2

SSR標(biāo)記

簡單序列重復(fù)標(biāo)記

由幾個核苷酸（一般為2個～6個）為重復(fù)單元的長達(dá)幾十至幾百個核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列；由于

基本單元重復(fù)次數(shù)的不同，而形成SSR座位的多態(tài)性；根據(jù)SSR座位兩側(cè)保守的單拷貝序列設(shè)計一對特異

引物來擴(kuò)增SSR序列即可揭示其多態(tài)性。

3.3

推薦引物

品種純度鑒定中優(yōu)先選用的一套SSR引物，其檢測位點多態(tài)性高，檢測結(jié)果重復(fù)性好。

3.4

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

1

DB4201/T520-2017

一種利用酶促反應(yīng)對特定DNA片段進(jìn)行體外擴(kuò)增的技術(shù)，該技術(shù)以短核苷酸序列作為引物，并使

用一種耐高溫的DNA聚合酶，只需非常少量的DNA樣品，在短時間內(nèi)以樣品DNA為模版合成上億個拷

貝。

3.5

兩系雜交水稻

兩系雜交水稻是利用光溫敏不育系水稻為基礎(chǔ)，與恢復(fù)系雜交生產(chǎn)的雜交稻種子。

3.6

品種純度

品種在特征特性方面典型一致的程度，用本品種的種子數(shù)占供檢本作物樣品種子數(shù)的百分率表示。

4原理

品種的不同本質(zhì)上是由于其遺傳物質(zhì)DNA核苷酸序列的不同所致，利用不同品種其SSR多態(tài)性存在差

異的特點達(dá)到純度鑒定目的。簡單重復(fù)序列（SSR）分布于水稻整個基因組的不同位置上，不同品種每

個位點上重復(fù)單位的數(shù)目及序列可能不同，因而形成片段長度多態(tài)性。由于每個簡單重復(fù)序列兩端的序

列是高度保守的單拷貝序列，因而可根據(jù)其兩端的序列設(shè)計一對特異引物，利用PCR技術(shù)對重復(fù)序列進(jìn)

行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過電泳進(jìn)行分離，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察可辨別SSR電泳譜帶。通過選用親本間具

有多態(tài)性的SSR引物在雜交種中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳譜帶差異，鑒定兩系水稻品種純度。

5儀器設(shè)備及試劑

見附錄A。

6相關(guān)試劑及溶液配制

見附錄B。所用試劑均為分析純。試劑配制用水均應(yīng)符合GB/T6682的一級水的要求。

7推薦引物

見附錄C，其它在本文件中未推薦的親本間多態(tài)性引物也可以使用。

8操作程序

8.1樣品制備

8.1.1受檢樣品的扦樣、分樣和保存，應(yīng)符合GB/T3543.2的要求。

8.1.2試樣的數(shù)量及淘汰值可參考GB/T3543.5要求。檢測時將其雙親的標(biāo)準(zhǔn)種子設(shè)為對照。

8.2樣品DNA提取

8.2.1材料準(zhǔn)備

8.2.1.1親本

2

DB4201/T520-2017

每個親本取20個單株葉片取等量組織混合制取樣品，提供的親本種子應(yīng)符合GB4404.1的原種純度

要求。

8.2.1.2雜交種

每個樣品取200粒以上的種子，培養(yǎng)幼苗單株制樣應(yīng)符合GB/T3543.4要求。

8.2.2DNA提取

8.2.2.1親本DNA的提取

按GB/T3543.4要求的方法培養(yǎng)幼苗取水稻葉片2cm放入研缽中，加液氮充分研磨至粉末狀，然后

移入2ml離心管中，加入500ul預(yù)熱（60℃）的DNA提取液，65℃水浴30min，間隔15分鐘顛倒混勻

一次，再加入500ul氯仿-異戊醇（24：1），輕輕混勻。10000rpm離心5min。將上清液400ul轉(zhuǎn)入

另一支含有800ul-20℃預(yù)冷乙醇的離心管沉淀DNA，10000rpm離心10min，棄上清液，再用70％乙

醇溶液洗滌2遍，自然條件下干燥后，加入200ul超純水溶解DNA，檢測濃度，將DNA稀釋至20ng/ul，

-20℃保存留用。

8.2.2.2雜交種DNA的提取

按GB/T3543.4要求的方法培養(yǎng)幼苗取水稻葉片2cm剪碎移入PCR板單孔內(nèi)，每個單孔加入BufferA

50ul，然后將加有樣品和BufferA的PCR板放入95℃水浴15min，然后每個單孔加入50ulBufferB，

混勻離心，取2ul上清作為樣品DNA。

注：以上為推薦用于水稻純度鑒定的DNA快速提取方法，樣品DNA即取即用，不宜留存；其他能夠達(dá)到PCR擴(kuò)增質(zhì)量

要求的DNA提取方法都適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

8.3PCR擴(kuò)增

8.3.1引物選擇

首先選擇附錄C中的引物在親本中進(jìn)行擴(kuò)增，挑選出親本間檢測出差異的引物用于雜交種純度檢測，

雜交種純度檢測時加入2個親本作為對照。

8.3.2反應(yīng)體系

20ul的反應(yīng)體系，2ul樣品DNA，1ul正向引物（10umol/L），1ul反向引物（10umol/L），

0.2ulTaqDNA聚合酶(5U/ul)，0.2uldNTP（10mM/L），2ulPCR緩沖液(10×，pH8.3)，13.6ul

超純水。

8.3.3反應(yīng)程序

94℃預(yù)變性5min，一次循環(huán)：94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；運行35個循環(huán)，

72℃延伸5min，4℃保存。

8.4PCR產(chǎn)物檢測

8.4.1瓊脂糖凝膠制備

將1×TAE電泳緩沖液和瓊脂糖（2.5％濃度）混合煮沸融化，冷卻至50℃～55℃，加入EB（或EB

替代物），使其最終濃度約為0.5μg/ml，適時倒入制膠平臺上，待膠凝固后拔出梳子。

8.4.2電泳

3

DB4201/T520-2017

將制好的凝膠放入加入TAE緩沖液的電泳槽中（緩沖液應(yīng)高于凝膠表面），清除加樣孔氣泡和雜質(zhì)，

向加樣孔中加入8ul混有溴酚藍(lán)的PCR產(chǎn)物，接通電源在5V/CM凝膠的電壓下進(jìn)行電泳，至指示劑（溴

酚藍(lán)）接近膠板底部時，結(jié)束電泳。

8.4.3拍照記錄

將膠板放入凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照，記錄結(jié)果并保存。

9統(tǒng)計與計算

如果SSR位點表現(xiàn)雙親帶型，則說明品種為真雜種；如果出現(xiàn)單個親本帶型或其他帶型，則該種子

（幼苗、株）為假雜種。品種純度（P）的數(shù)值以百分?jǐn)?shù)表示，按公式（1）計算：

N1?N2……（1）

P=×100%

N1

式中：

P——品種純度；

N1——檢測種子數(shù)；

N2——非雙親帶型的種子數(shù)。

4

DB4201/T520-2017

AA

附錄A

（資料性附錄）

儀器設(shè)備及試劑

A.1儀器設(shè)備包括但不限于：

——PCR擴(kuò)增儀；

——電泳儀；

——水平電泳槽及配套的制膠附件；

——凝膠成像系統(tǒng)；

——高速冷凍離心機(jī)；

——水平搖床；

——磁力攪拌計；

——微波爐；

——高壓滅菌鍋；

——紫外分光光度計；

——移液器：規(guī)格分別為10ul、20ul、100ul、200ul、1000ul連續(xù)可調(diào)；

——酸度計；

——恒溫水浴鍋；

——電子天平；

——檢驗礱谷機(jī)。

A.2試劑包括但不限于：

——吐溫20（W/V）；

——氫氧化鈉；

——三羥甲基氨基甲烷；

——氯仿；

——異戊醇；

——濃鹽酸；

——冰醋酸；

——蔗糖；

——溴酚藍(lán)粉末；

——乙二胺四乙酸二鈉；

——乙二胺四乙酸；

——10×PCR反應(yīng)緩沖液；

——TaqDNA聚合酶；

——瓊脂糖；

——無水乙醇；

——氯化鈉；

——4種脫氧核苷酸；

——石蠟油

——A.2.19甲醛；

——A.2.20溴化乙錠（EB）。

5

DB4201/T520-2017

BB

附錄B

（資料性附錄）

相關(guān)試劑及溶液配制

B.1DNA提取溶液的配制

B.1.10.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉鹽（EDTA）（pH8.0）溶液

稱取186.1g乙二胺四乙酸二鈉鹽（Na2EDTA?2H2O），加入800ml水，再加入20g固體氫氧化鈉(NaOH)，

攪拌，待完全溶解后，冷卻至室溫，再用NaOH準(zhǔn)確調(diào)pH至8.0，定容至1000ml。在103.4kPa（121℃）

條件下滅菌20min。

B.1.20.5mol/L鹽酸（HCl）溶液

量取25ml濃鹽酸（36％～38％），加水定容至500ml。

B.1.31mol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸（Tris-HCl）（pH8.0）溶液

稱取60.55g三羥甲基氨基甲烷（Tris），溶于400ml水中，用0.5mol/L鹽酸溶液（B.1.2）調(diào)pH

至8.0，定容至500ml，在103.4kPa（121℃）條件下滅菌20min。

B.1.45mol/L氯化鈉溶液

稱取146g氯化鈉（NaCl）溶于水中，定容至500ml，在103.4kPa（121℃）條件下滅菌20min。

B.1.5DNA提取液

分別稱取15g十二烷基苯磺酸鈉（SDS），放入燒杯中，分別加入40ml乙二胺四乙酸二鈉鹽溶

(pH8.0)(B.1.1)、100ml三羥甲基氨基甲烷鹽酸（Tris-HCl）（pH8.0）溶液（B.1.3）和100ml氯化鈉

溶液（B.1.4），加水?dāng)嚢瓒ㄈ葜?000ml。在103.4kPa（121℃）條件下滅菌20min。于-20℃保存。

B.1.6氯仿-異戊醇（24：1）

將氯仿和異戊醇按24：1的體積比例配制混合液。

B.1.770％乙醇溶液

取700ml無水乙醇，用去離子水定容至1000ml。

B.1.810MNaOH溶液

取40g氫氧化鈉，加入去離子水定容至100ml。

B.1.920％吐溫20溶液

取100ml吐溫20，加入去離子水定容至500ml。

B.1.10BufferA

6

DB4201/T520-2017

分別量取5ml10MNaOH溶液（B.1.8）和50ml20％吐溫20溶液（B.1.9），加入去離子水?dāng)嚢瓒?/p>

容至500ml。臨用臨配。

B.1.11BufferB

稱取12.114g三羥甲基氨基甲烷鹽酸（Tris-HCl），0.744g乙二胺四乙酸（EDTA），加入去離子

水定容至1L。

B.1.1250倍TAE緩沖液

稱取242g三羥甲基氨基甲烷鹽酸（Tris-HCl），37.2g乙二胺四乙酸二鈉鹽（Na2EDTA?2H2O），加

入57.1ml冰醋酸，加去離子水定容至1L。

B.1.13溴酚藍(lán)

取1g溴酚蘭溶于30ml純凈水中，于攪拌臺上電攪3h～4h；取120ml去離子水于干凈旋蓋玻璃瓶

中，加入240g蔗糖充分溶解；攪好的溴酚蘭溶液倒入蔗糖溶液中混合，定容至400ml。倒入時，棄沉

淀。

B.2PCR產(chǎn)物檢測

B.2.1瓊脂糖凝膠制備

將1×TAE電泳緩沖液和瓊脂糖（2.5％濃度）混合煮沸融化，冷卻至50℃～55℃，加入EB（或EB

替代物），使其最終濃度約為0.5μg/ml，適時倒入制膠平臺上，待膠凝固后拔出梳子。

B.2.2電泳

將制好的凝膠放入加入TAE緩沖液的電泳槽中（緩沖液應(yīng)高于凝膠表面），清除加樣孔氣泡和雜質(zhì)，

向加樣孔中加入8ul混有溴酚藍(lán)的PCR產(chǎn)物，接通電源在5V/CM凝膠的電壓下進(jìn)行電泳，至指示劑（溴

酚藍(lán)）接近膠板底部時，結(jié)束電泳。

B.2.3拍照記錄

將膠板放入凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照，記錄結(jié)果并保存。

7

DB4201/T520-2017

CC

附錄C

（資料性附錄）

推薦引物

表C.1給出了推薦引物。

表C.1推薦引物

標(biāo)記染色體臂正向引物序列（5-3）反向引物序列（5-3）近似片段長度

MarkerChrArmForwardprimer（5-3）Reverseprimer（5-3）Appoxlength

RM11951SATGGACCACAAACGACCTTCCGACTCCCTTGTTCTTCTGG150-160

RM2971LTCTTTGGAGGCGAGCTGAGCGAAGGGTACATCTGCTTAG160-190+

RM712SCTAGAGGCGAAAACGAGATGGGGTGGGCGAGGTAATAATG140--210

RM202LTCTGCAAGCCTTGTCTGATGTAAGTCGATCATTGTGTGGACC170--180+

RM2323LCCGGTATCCTTCGATATTGCCCGACTTTTCCTCCTGACG150-170

RM853LCCAAAGATGAAACCTGGATTGGCACAAGGTGAGCAGTCC90+-110

RM54144LACCATGGTTCAAGAGTGAAAACAGCTCAACCTGTTGAGTG100+-120

RM2734LGAAGCCGTCGTGAAGTTACCGTTTCCTACCTGATCGCGAC190+-210-

RM2675STGCAGACATAGAGAAGGAAGTGAGCAACAGCACAACTTGATG150--170

RM2745LCCTCGCTTATGAGAGCTTCGCTTCTCCATCACTCCCATGG160-170+

RM1906SCTTTGTCTATCTCAAGACACTTGCAGATGTTCTTCCTGATG110-130-

RM2536STCCTTCAAGAGTGCAAAACCGCATTGTCATGTCGAAGCC140+-160

RM3367LCTTACAGAGAAACGGCATCGGCTGGTTTGTTTCAGGTTCG170--200

RM187LTTCCCTCTCATGAGCTCCATGAGTGCCTGGCGCTGTAC160+-170+

RM3378SGTAGGAAAGGAAGGGCAGAGCGATAGATAGCTAGATGTGGCC170-440

RM728LCCGGCGATAAAACAATGAGGCATCGGTCCTAACTAAGGG170-200+

RM2199SCGTCGGATGATGTAAAGCCTCATATCGGCATTCGCCTG190+-220

RM2789LGTAGTGAGCCTAACAATAATCTCAACTCAGCATCTCTGTCC150--160

RM31110LTGGTAGTATAGGTACTAAACATTCCTATACACATACAAACATAC170+-190-

RM258