免疫抗體檢測(cè)操作規(guī)程一、概述

免疫抗體檢測(cè)是通過體外實(shí)驗(yàn)手段，定量或定性分析生物樣本中特定抗體的存在與水平，廣泛應(yīng)用于臨床診斷、疾病監(jiān)測(cè)、疫苗研發(fā)等領(lǐng)域。本規(guī)程旨在規(guī)范免疫抗體檢測(cè)的操作流程，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

（一）試劑與耗材

1.樣本采集管：無菌采血管（如EDTA管、肝素管等）。

2.抗體檢測(cè)試劑盒：根據(jù)檢測(cè)目標(biāo)選擇相應(yīng)的試劑盒（如ELISA、化學(xué)發(fā)光法等）。

3.試劑配制：按照試劑盒說明書配制底物、洗滌液、標(biāo)準(zhǔn)品等。

4.其他耗材：移液器吸頭、微量離心管、酶標(biāo)板等。

（二）儀器設(shè)備

1.移液器：精確量取微量液體（范圍0.1-1000μL）。

2.離心機(jī)：樣本處理（轉(zhuǎn)速1000-12000r/min，時(shí)間5-10分鐘）。

3.酶標(biāo)儀/化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀：讀取檢測(cè)結(jié)果（檢測(cè)范圍0.01-5.0OD值）。

4.冰箱：樣本及試劑保存（溫度2-8℃）。

（三）實(shí)驗(yàn)環(huán)境

1.保持實(shí)驗(yàn)室清潔，避免污染。

2.操作臺(tái)面需用70%酒精擦拭消毒。

3.空氣凈化系統(tǒng)運(yùn)行正常，防止交叉污染。

三、操作步驟

（一）樣本采集與處理

1.采集靜脈血5-10mL，置于無菌采血管中。

2.室溫靜置30分鐘，避免劇烈振蕩。

3.3000r/min離心10分鐘，分離血清或血漿。

4.將樣本轉(zhuǎn)移至干凈離心管，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（二）試劑準(zhǔn)備

1.檢測(cè)前30分鐘，將試劑盒及樣本恢復(fù)至室溫（20-25℃）。

2.按說明書比例稀釋樣本，避免氣泡混入。

3.配制標(biāo)準(zhǔn)品曲線，設(shè)0、1、2、4、8、16μg/mL濃度梯度。

（三）檢測(cè)操作（以ELISA為例）

1.加樣：

(1)96孔板加入標(biāo)準(zhǔn)品及樣本（每孔100μL）。

(2)加入酶標(biāo)抗體（100μL/孔），覆膜37℃孵育60分鐘。

2.洗滌：

(1)棄去孔內(nèi)液體，甩干。

(2)每孔加入洗滌液250μL，靜置5秒后棄液。

(3)重復(fù)洗滌3次。

3.顯色：

(1)加入底物液100μL/孔，避光孵育30分鐘。

(2)加入終止液50μL/孔，混勻后酶標(biāo)儀檢測(cè)。

4.計(jì)算：

(1)用標(biāo)準(zhǔn)品濃度對(duì)數(shù)作橫坐標(biāo)，OD值作縱坐標(biāo)繪制曲線。

(2)樣本OD值代入曲線方程，計(jì)算抗體濃度。

（四）質(zhì)量控制

1.每批實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性對(duì)照、陽性對(duì)照及空白對(duì)照。

2.陰性對(duì)照無OD值，陽性對(duì)照在預(yù)期范圍內(nèi)。

3.空白對(duì)照OD值≤0.1，否則實(shí)驗(yàn)無效。

四、結(jié)果分析與保存

（一）結(jié)果判讀

1.抗體濃度高于閾值，判定為陽性。

2.低于閾值，判定為陰性。

3.臨界值附近需重復(fù)檢測(cè)確認(rèn)。

（二）數(shù)據(jù)記錄

1.記錄樣本編號(hào)、檢測(cè)日期、操作人。

2.保存原始數(shù)據(jù)及計(jì)算結(jié)果（電子版或紙質(zhì)版）。

（三）樣本保存

1.未檢測(cè)樣本需-20℃保存，有效期6個(gè)月。

2.廢棄樣本按生物危害物處理，避免泄漏。

五、注意事項(xiàng)

（一）避免污染

1.操作時(shí)佩戴手套，更換吸頭。

2.使用無菌移液器吸頭，避免交叉污染。

（二）試劑使用

1.試劑開封后需4小時(shí)內(nèi)使用完畢。

2.底物液避免光照，變色后立即終止實(shí)驗(yàn)。

（三）儀器校準(zhǔn)

1.酶標(biāo)儀每日校準(zhǔn)，確保讀數(shù)準(zhǔn)確。

2.離心機(jī)轉(zhuǎn)速定期檢測(cè)，避免誤差。

六、廢棄物處理

（一）樣本處理

1.使用后的采血管高溫高壓滅菌（15分鐘）。

2.血清樣本混入消毒劑后統(tǒng)一處理。

（二）試劑處理

1.底物液、洗滌液倒入指定廢液桶。

2.廢棄酶標(biāo)板用70%酒精浸泡后丟棄。

（三）環(huán)境消毒

1.實(shí)驗(yàn)臺(tái)面用消毒液擦拭，30分鐘后通風(fēng)。

2.手部接觸區(qū)域重點(diǎn)消毒，防止外泄。

**一、概述**

免疫抗體檢測(cè)是通過體外實(shí)驗(yàn)手段，定量或定性分析生物樣本中特定抗體的存在與水平，廣泛應(yīng)用于臨床診斷、疾病監(jiān)測(cè)、疫苗研發(fā)等領(lǐng)域。本規(guī)程旨在規(guī)范免疫抗體檢測(cè)的操作流程，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。主要涵蓋樣本采集、試劑準(zhǔn)備、檢測(cè)操作、質(zhì)量控制、結(jié)果判讀及廢棄物處理等環(huán)節(jié)。熟悉并嚴(yán)格執(zhí)行本規(guī)程，有助于減少操作誤差，提高檢測(cè)效率。

**二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備**

（一）試劑與耗材

1.**樣本采集管**：

(1)選擇合適的采血管，如含有EDTA抗凝劑的管用于全血樣本，或含有肝素抗凝劑的管用于血漿樣本，根據(jù)檢測(cè)目的和后續(xù)步驟選擇。

(2)確保采血管無破損、無污染，批號(hào)一致。

(3)配備采血針、止血帶、消毒棉簽（如70%酒精棉片）。

2.**抗體檢測(cè)試劑盒**：

(1)根據(jù)檢測(cè)目標(biāo)抗體（如IgG、IgM、IgA等）選擇對(duì)應(yīng)的試劑盒，常見類型包括：

(a)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒。

(b)化學(xué)發(fā)光免疫分析法試劑盒。

(c)時(shí)間分辨熒光免疫分析法（TRFIA）試劑盒。

(2)檢查試劑盒在有效期內(nèi)，包裝完好，無破損或泄漏。

(3)仔細(xì)閱讀并保存試劑盒說明書，理解原理、操作步驟及注意事項(xiàng)。

3.**試劑配制**：

(1)**底物溶液**：根據(jù)試劑盒要求，用無菌水或緩沖液配制成適當(dāng)濃度，如TMB（3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine）底物液。注意避光保存。

(2)**洗滌液**：使用預(yù)混好的洗滌液（通常是含Tween-20的PBS緩沖液），避免使用自來水或非無菌水。

(3)**標(biāo)準(zhǔn)品/校準(zhǔn)品**：使用試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品，或經(jīng)過驗(yàn)證的、定量的標(biāo)準(zhǔn)品原液，用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。確保標(biāo)準(zhǔn)品在有效期內(nèi)。

(4)**終止液**：對(duì)于ELISA等需要終止反應(yīng)的檢測(cè)，使用硫酸或氫氧化鈉溶液，配制時(shí)需精確控制pH值。

4.**其他耗材**：

(1)**移液器及吸頭**：配置不同量程的移液器（如10-100μL,100-1000μL），并準(zhǔn)備與實(shí)驗(yàn)需求匹配的無菌吸頭。定期檢查移液器準(zhǔn)確性。

(2)**微量離心管**：選擇合適規(guī)格（如1.5mL,2mL）的一次性離心管，確保管蓋密封良好。

(3)**酶標(biāo)板/微孔板**：使用無菌、透明、表面光潔的96孔或384孔酶標(biāo)板。配備酶標(biāo)板架、吸水紙。

(4)**微量加樣器（移液器）**：用于精確移取少量試劑（如標(biāo)準(zhǔn)品稀釋、樣本稀釋）。

(5)**槍頭架/移液器架**：方便放置和整理吸頭。

（二）儀器設(shè)備

1.**移液器**：

(1)檢查移液器功能是否正常，包括啟動(dòng)、停止、重復(fù)性等。必要時(shí)進(jìn)行校準(zhǔn)。

(2)根據(jù)不同量程選擇合適的移液器類型（如單道、八道）。

2.**離心機(jī)**：

(1)確保離心機(jī)轉(zhuǎn)子平衡，關(guān)好門后才能啟動(dòng)。

(2)根據(jù)樣本類型和實(shí)驗(yàn)要求設(shè)置合適的轉(zhuǎn)速（如全血樣本常需3000-5000r/min，血漿樣本1000-3000r/min）和時(shí)間（如10-15分鐘）。

(3)離心后確保樣本完全分離，小心開蓋取管。

3.**酶標(biāo)儀/化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀**：

(1)開機(jī)預(yù)熱至少30分鐘。

(2)使用標(biāo)準(zhǔn)白板或校準(zhǔn)品進(jìn)行每日校準(zhǔn)，確保波長(zhǎng)準(zhǔn)確性（如450nm,520nm,630nm等）。

(3)清潔檢測(cè)窗口，確保無指紋或污漬。

(4)對(duì)于化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀，檢查閃爍計(jì)數(shù)器是否正常工作。

4.**冰箱**：

(1)用于樣本和試劑的低溫保存。確保溫度穩(wěn)定在2-8℃。定期檢查溫度記錄。

(2)分區(qū)存放：樣本區(qū)、試劑區(qū)（按需冷藏或冷凍）。

5.**水浴鍋/恒溫振蕩器**：

(1)用于樣本或試劑的孵育，需設(shè)置并驗(yàn)證溫度（如37℃±0.5℃）。

(2)恒溫振蕩器可提高孵育效率，確保混勻。

（三）實(shí)驗(yàn)環(huán)境

1.**實(shí)驗(yàn)室布局**：

(1)檢測(cè)區(qū)域應(yīng)與樣本準(zhǔn)備、試劑配制、廢棄物處理區(qū)域分開，減少交叉污染風(fēng)險(xiǎn)。

(2)配備生物安全柜或超凈工作臺(tái)，用于開蓋、加樣等高風(fēng)險(xiǎn)操作。

2.**清潔與消毒**：

(1)每日實(shí)驗(yàn)前使用70%酒精擦拭操作臺(tái)面、設(shè)備表面。

(2)實(shí)驗(yàn)后徹底清潔，去除殘留物。

(3)定期（如每周）使用消毒劑對(duì)地面、墻面進(jìn)行消毒。

3.**個(gè)人防護(hù)**：

(1)操作時(shí)必須佩戴一次性手套。

(2)根據(jù)需要佩戴護(hù)目鏡或面屏，防止試劑濺射。

(3)穿戴實(shí)驗(yàn)服或隔離衣。

**三、操作步驟**

（一）樣本采集與處理

1.**樣本采集**：

(1)向受試者解釋采集目的和流程，獲取知情同意。

(2)根據(jù)需要使用止血帶，按要求部位（通常為肘正中靜脈）進(jìn)行穿刺。

(3)避免止血帶過緊或壓迫時(shí)間過長(zhǎng)，以免影響樣本結(jié)果。

(4)使用無菌采血管，緩慢注入血液，避免產(chǎn)生氣泡。

(5)采集完成后，松開止血帶，按壓穿刺點(diǎn)止血，整理好針頭和采血管。

2.**樣本運(yùn)輸**：

(1)立即蓋緊采血管蓋，避免樣本溢出。

(2)根據(jù)要求將樣本送至實(shí)驗(yàn)室，如需冷藏，應(yīng)在1小時(shí)內(nèi)送達(dá)。

3.**樣本處理**：

(1)檢查采血管是否有破損、凝血或溶血。溶血樣本可能影響某些檢測(cè)。

(2)將采血管置于渦旋振蕩器上，充分混勻（如10-15秒）。

(3)3000-5000r/min離心10-15分鐘，分離血清或血漿。

(4)小心吸取上層血清/血漿至干凈、無菌的1.5mL或2mL離心管中，避免吸到管底的紅細(xì)胞。

(5)如需檢測(cè)IgM等不耐熱抗體，需立即分離并凍存血漿。

(6)若樣本量不足或無法立即處理，可加入防腐劑（如甲苯）或立即凍存（-20℃或-80℃）。

（二）試劑準(zhǔn)備與校準(zhǔn)

1.**試劑平衡**：

(1)所有試劑（樣本、標(biāo)準(zhǔn)品、試劑）在使用前應(yīng)恢復(fù)至室溫（通常為20-25℃），避免低溫導(dǎo)致結(jié)晶或反應(yīng)不完全。

(2)檢查試劑有無沉淀、變色或渾濁，如有異常，不得使用。

2.**標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)備**：

(1)按照說明書要求，用稀釋液（通常是試劑盒配套的稀釋液或生理鹽水）將高濃度標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行系列稀釋，配制出一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品工作液。

(2)確保稀釋過程準(zhǔn)確無誤，建議使用微量移液器。

(3)記錄各標(biāo)準(zhǔn)品孔的濃度。

3.**儀器校準(zhǔn)**：

(1)檢查酶標(biāo)儀的波長(zhǎng)設(shè)置是否與試劑盒要求一致。

(2)使用配套校準(zhǔn)品或標(biāo)準(zhǔn)白板，在設(shè)定波長(zhǎng)下進(jìn)行校準(zhǔn)，確保讀數(shù)準(zhǔn)確。

（三）檢測(cè)操作（以ELISA為例）

1.**加樣**：

(1)在潔凈的酶標(biāo)板上，用記號(hào)筆標(biāo)明樣本孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔、對(duì)照孔的位置。

(2)使用不同吸頭分別吸取樣本、標(biāo)準(zhǔn)品、試劑，避免交叉污染。

(3)按順序加入樣本/標(biāo)準(zhǔn)品，每孔100μL，加樣均勻，避免氣泡。

(4)蓋上封板膜或板蓋，防止蒸發(fā)和污染。

2.**孵育**：

(1)將酶標(biāo)板置于37℃水浴鍋中，或使用恒溫振蕩器在37℃孵育60分鐘。

(2)如使用化學(xué)發(fā)光法，孵育時(shí)間可能不同，請(qǐng)嚴(yán)格按說明書操作。

3.**洗滌**：

(1)小心取出酶標(biāo)板，棄去孔內(nèi)液體。

(2)在酶標(biāo)板架上，每孔加入洗滌液250-300μL，輕輕晃動(dòng)或用洗板機(jī)洗滌1-2次。

(3)棄去洗滌液，甩干或用吸水紙吸干邊緣殘留液體，注意不要吸干孔內(nèi)液體。

(4)重復(fù)洗滌3-4次，以充分去除未結(jié)合物。

4.**加酶標(biāo)抗體/底物**：

(1)加入酶標(biāo)抗體（或酶標(biāo)記物，如辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗）100μL/孔。

(2)如為TMB底物，則直接加入TMB底物液100μL/孔。

(3)蓋上封板膜或板蓋，室溫避光孵育30-60分鐘。

5.**終止反應(yīng)**：

(1)小心取出酶標(biāo)板，棄去孔內(nèi)液體。

(2)加入終止液50-100μL/孔，混勻（可輕輕拍打或用移液器混勻）。

(3)終止液會(huì)改變酶促反應(yīng)的顏色，如TMB由藍(lán)變黃。

（四）結(jié)果讀取與計(jì)算

1.**酶標(biāo)儀檢測(cè)**：

(1)立即將終止后的酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀中。

(2)設(shè)置讀數(shù)波長(zhǎng)（如TMB法為450nm，設(shè)參考波長(zhǎng)為630nm或?yàn)V光片空白調(diào)零）。

(3)讀取各孔的OD值（吸光度值）。

2.**數(shù)據(jù)記錄**：

(1)記錄所有孔的原始OD值，包括空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣本孔、對(duì)照孔。

(2)計(jì)算空白孔校正值（各孔OD值-空白孔OD值）。

3.**標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制與樣本濃度計(jì)算**：

(1)以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)（log）為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的校正OD值為縱坐標(biāo)，在Excel等軟件中繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(2)選擇合適的曲線回歸方程（如線性回歸，R2值應(yīng)大于0.99）。

(3)將樣本的校正OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出樣本中抗體的濃度（或相對(duì)含量）。

（五）質(zhì)量控制（QC）

1.**空白對(duì)照**：

(1)空白孔應(yīng)加稀釋液或樣本稀釋液，用于校正背景吸收。

(2)空白孔校正OD值應(yīng)小于0.1（或根據(jù)試劑盒說明書要求），否則實(shí)驗(yàn)無效。

2.**陰性對(duì)照**：

(1)陰性對(duì)照應(yīng)使用已知不含目標(biāo)抗體的樣本或稀釋液。

(2)陰性對(duì)照結(jié)果應(yīng)為陰性，OD值在閾值以下。

3.**陽性對(duì)照**：

(1)陽性對(duì)照應(yīng)使用已知含目標(biāo)抗體的樣本或標(biāo)準(zhǔn)品。

(2)陽性對(duì)照結(jié)果應(yīng)為陽性，OD值在閾值以上，且在預(yù)期范圍內(nèi)。

4.**重復(fù)性檢測(cè)**：

(1)對(duì)于臨界值或結(jié)果可疑的樣本，建議進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)。

5.**室內(nèi)質(zhì)控（IQC）**：

(1)每日或按頻率使用質(zhì)控品進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)估實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性。

(2)質(zhì)控品結(jié)果應(yīng)在允許范圍內(nèi)，否則需查找原因并重做實(shí)驗(yàn)。

**四、結(jié)果分析與保存**

（一）結(jié)果判讀

1.**閾值設(shè)定**：

(1)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和陰性對(duì)照結(jié)果，確定檢測(cè)的陽性/陰性閾值。通常以陰性對(duì)照OD值的2-3倍或根據(jù)廠家建議設(shè)定。

2.**結(jié)果判定**：

(1)樣本校正OD值≥閾值，判讀為陽性。

(2)樣本校正OD值<閾值，判讀為陰性。

3.**結(jié)果報(bào)告**：

(1)以具體數(shù)值（如ng/mL、IU/mL）和陽性/陰性狀態(tài)報(bào)告結(jié)果。

(2)如結(jié)果處于臨界范圍，需注明并建議復(fù)查。

（二）數(shù)據(jù)記錄與保存

1.**原始數(shù)據(jù)**：

(1)實(shí)驗(yàn)記錄本或電子記錄系統(tǒng)應(yīng)記錄：樣本編號(hào)、日期、操作員、試劑批號(hào)、儀器型號(hào)、所有原始OD值、計(jì)算過程、質(zhì)控結(jié)果等。

(2)保留原始酶標(biāo)板掃描圖像或電子版數(shù)據(jù)。

2.**結(jié)果報(bào)告**：

(1)按規(guī)定格式生成檢測(cè)報(bào)告，包含樣本信息、檢測(cè)結(jié)果、參考區(qū)間（如有）、檢測(cè)方法、操作人員等。

3.**文檔保存**：

(1)原始數(shù)據(jù)和報(bào)告按檔案管理規(guī)定保存，紙質(zhì)版和電子版均需備份。保存期限根據(jù)相關(guān)要求（如臨床樣本通常保存3-7年）。

（三）樣本保存（未檢測(cè)部分）

1.**短期保存**：

(1)未檢測(cè)的樣本可在2-8℃冰箱保存，但一般建議盡快檢測(cè)，以免影響結(jié)果或發(fā)生變質(zhì)。

2.**長(zhǎng)期保存**：

(1)需要長(zhǎng)期保存的樣本應(yīng)置于-20℃或-80℃冰箱。

(2)分裝后凍存可減少反復(fù)凍融對(duì)樣本的影響。

3.**復(fù)溶樣本**：

(1)如樣本凍存前未分裝，復(fù)溶時(shí)需快速在室溫或4℃解凍，避免反復(fù)凍融。

**五、注意事項(xiàng)**

（一）避免污染

1.**操作規(guī)范**：

(1)每次更換樣本或試劑前，必須更換新的吸頭。

(2)使用一次性移液器吸頭，避免共用。

(3)操作時(shí)盡量減少說話和走動(dòng)，防止氣溶膠污染。

2.**環(huán)境控制**：

(1)在生物安全柜或超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行加樣、孵育等關(guān)鍵步驟。

(2)保持工作臺(tái)面清潔，使用70%酒精擦拭。

3.**容器處理**：

(1)所有接觸樣本的容器（離心管、移液管、酶標(biāo)板等）必須無菌、清潔。

(2)用后一次性棄置或按需高壓滅菌。

（二）試劑使用規(guī)范

1.**核對(duì)信息**：

(1)使用前核對(duì)試劑名稱、批號(hào)、有效期、儲(chǔ)存條件。

2.**配制準(zhǔn)確**：

(1)使用精確的稱量或移液設(shè)備配制試劑。

(2)混合試劑時(shí)需充分、均勻，如渦旋振蕩或顛倒混勻。

3.**避免光照**：

(1)對(duì)光敏感的試劑（如TMB底物、某些酶）需避光保存和使用。

4.**及時(shí)使用**：

(1)配制好的試劑，如底物液、洗滌液，應(yīng)盡快使用，避免長(zhǎng)時(shí)間放置導(dǎo)致活性下降或變質(zhì)。

（三）儀器操作與維護(hù)

1.**正確使用**：

(1)嚴(yán)格按照儀器說明書操作，避免超負(fù)荷或不當(dāng)使用。

(2)移液器使用后清潔針頭，必要時(shí)更換。

(3)離心機(jī)使用前檢查轉(zhuǎn)子是否平衡。

2.**定期校準(zhǔn)**：

(1)酶標(biāo)儀、移液器、離心機(jī)等關(guān)鍵設(shè)備需定期進(jìn)行性能校準(zhǔn)和維護(hù)，確保其準(zhǔn)確性。

3.**故障處理**：

(1)發(fā)現(xiàn)儀器異常，應(yīng)立即停止使用，并通知專業(yè)人員進(jìn)行維修。

**六、廢棄物處理**

（一）樣本處理

1.**剩余樣本**：

(1)未檢測(cè)或檢測(cè)后剩余的樣本，應(yīng)按生物危害物規(guī)定處理，如高壓滅菌后統(tǒng)一處理。

2.**不合格樣本**：

(1)溶血、黃疸或乳糜樣本，應(yīng)標(biāo)記后另作處理或廢棄。

3.**處理方式**：

(1)可行時(shí)，對(duì)廢棄樣本進(jìn)行高壓滅菌（121℃，15分鐘）。

(2)滅菌后，根據(jù)當(dāng)?shù)匾?guī)定進(jìn)行化學(xué)消毒（如加入10%次氯酸鈉溶液浸泡1小時(shí)）或直接作為醫(yī)療廢物處理。

（二）試劑處理

1.**過期或廢棄試劑**：

(1)按照化學(xué)品安全規(guī)定處理。

(2)如為強(qiáng)酸強(qiáng)堿，需用大量水稀釋后中和（如加入大量廢液或堿性物質(zhì)，并持續(xù)攪拌），再按廢水規(guī)定排放。

(3)有機(jī)溶劑需用專用廢液桶收集。

2.**清洗廢水**：

(1)日常洗滌液可按實(shí)驗(yàn)室廢水統(tǒng)一處理，如需特殊處理需查閱說明書或當(dāng)?shù)匾?guī)定。

（三）環(huán)境消毒與銳器處理

1.**工作區(qū)域**：

(1)每日實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，使用70%酒精擦拭操作臺(tái)面、設(shè)備表面。

(2)定期使用消毒液（如含氯消毒劑）對(duì)地面、墻角等進(jìn)行清潔消毒。

2.**銳器處理**：

(1)使用后的針頭、刀片等銳器必須立即放入符合標(biāo)準(zhǔn)的銳器盒中。

(2)銳器盒裝滿后，按醫(yī)療廢物規(guī)定交由專業(yè)機(jī)構(gòu)處理。

3.**個(gè)人衛(wèi)生**：

(1)操作前后必須洗手，接觸污染物后需立即消毒。

一、概述

免疫抗體檢測(cè)是通過體外實(shí)驗(yàn)手段，定量或定性分析生物樣本中特定抗體的存在與水平，廣泛應(yīng)用于臨床診斷、疾病監(jiān)測(cè)、疫苗研發(fā)等領(lǐng)域。本規(guī)程旨在規(guī)范免疫抗體檢測(cè)的操作流程，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

（一）試劑與耗材

1.樣本采集管：無菌采血管（如EDTA管、肝素管等）。

2.抗體檢測(cè)試劑盒：根據(jù)檢測(cè)目標(biāo)選擇相應(yīng)的試劑盒（如ELISA、化學(xué)發(fā)光法等）。

3.試劑配制：按照試劑盒說明書配制底物、洗滌液、標(biāo)準(zhǔn)品等。

4.其他耗材：移液器吸頭、微量離心管、酶標(biāo)板等。

（二）儀器設(shè)備

1.移液器：精確量取微量液體（范圍0.1-1000μL）。

2.離心機(jī)：樣本處理（轉(zhuǎn)速1000-12000r/min，時(shí)間5-10分鐘）。

3.酶標(biāo)儀/化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀：讀取檢測(cè)結(jié)果（檢測(cè)范圍0.01-5.0OD值）。

4.冰箱：樣本及試劑保存（溫度2-8℃）。

（三）實(shí)驗(yàn)環(huán)境

1.保持實(shí)驗(yàn)室清潔，避免污染。

2.操作臺(tái)面需用70%酒精擦拭消毒。

3.空氣凈化系統(tǒng)運(yùn)行正常，防止交叉污染。

三、操作步驟

（一）樣本采集與處理

1.采集靜脈血5-10mL，置于無菌采血管中。

2.室溫靜置30分鐘，避免劇烈振蕩。

3.3000r/min離心10分鐘，分離血清或血漿。

4.將樣本轉(zhuǎn)移至干凈離心管，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（二）試劑準(zhǔn)備

1.檢測(cè)前30分鐘，將試劑盒及樣本恢復(fù)至室溫（20-25℃）。

2.按說明書比例稀釋樣本，避免氣泡混入。

3.配制標(biāo)準(zhǔn)品曲線，設(shè)0、1、2、4、8、16μg/mL濃度梯度。

（三）檢測(cè)操作（以ELISA為例）

1.加樣：

(1)96孔板加入標(biāo)準(zhǔn)品及樣本（每孔100μL）。

(2)加入酶標(biāo)抗體（100μL/孔），覆膜37℃孵育60分鐘。

2.洗滌：

(1)棄去孔內(nèi)液體，甩干。

(2)每孔加入洗滌液250μL，靜置5秒后棄液。

(3)重復(fù)洗滌3次。

3.顯色：

(1)加入底物液100μL/孔，避光孵育30分鐘。

(2)加入終止液50μL/孔，混勻后酶標(biāo)儀檢測(cè)。

4.計(jì)算：

(1)用標(biāo)準(zhǔn)品濃度對(duì)數(shù)作橫坐標(biāo)，OD值作縱坐標(biāo)繪制曲線。

(2)樣本OD值代入曲線方程，計(jì)算抗體濃度。

（四）質(zhì)量控制

1.每批實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性對(duì)照、陽性對(duì)照及空白對(duì)照。

2.陰性對(duì)照無OD值，陽性對(duì)照在預(yù)期范圍內(nèi)。

3.空白對(duì)照OD值≤0.1，否則實(shí)驗(yàn)無效。

四、結(jié)果分析與保存

（一）結(jié)果判讀

1.抗體濃度高于閾值，判定為陽性。

2.低于閾值，判定為陰性。

3.臨界值附近需重復(fù)檢測(cè)確認(rèn)。

（二）數(shù)據(jù)記錄

1.記錄樣本編號(hào)、檢測(cè)日期、操作人。

2.保存原始數(shù)據(jù)及計(jì)算結(jié)果（電子版或紙質(zhì)版）。

（三）樣本保存

1.未檢測(cè)樣本需-20℃保存，有效期6個(gè)月。

2.廢棄樣本按生物危害物處理，避免泄漏。

五、注意事項(xiàng)

（一）避免污染

1.操作時(shí)佩戴手套，更換吸頭。

2.使用無菌移液器吸頭，避免交叉污染。

（二）試劑使用

1.試劑開封后需4小時(shí)內(nèi)使用完畢。

2.底物液避免光照，變色后立即終止實(shí)驗(yàn)。

（三）儀器校準(zhǔn)

1.酶標(biāo)儀每日校準(zhǔn)，確保讀數(shù)準(zhǔn)確。

2.離心機(jī)轉(zhuǎn)速定期檢測(cè)，避免誤差。

六、廢棄物處理

（一）樣本處理

1.使用后的采血管高溫高壓滅菌（15分鐘）。

2.血清樣本混入消毒劑后統(tǒng)一處理。

（二）試劑處理

1.底物液、洗滌液倒入指定廢液桶。

2.廢棄酶標(biāo)板用70%酒精浸泡后丟棄。

（三）環(huán)境消毒

1.實(shí)驗(yàn)臺(tái)面用消毒液擦拭，30分鐘后通風(fēng)。

2.手部接觸區(qū)域重點(diǎn)消毒，防止外泄。

**一、概述**

免疫抗體檢測(cè)是通過體外實(shí)驗(yàn)手段，定量或定性分析生物樣本中特定抗體的存在與水平，廣泛應(yīng)用于臨床診斷、疾病監(jiān)測(cè)、疫苗研發(fā)等領(lǐng)域。本規(guī)程旨在規(guī)范免疫抗體檢測(cè)的操作流程，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。主要涵蓋樣本采集、試劑準(zhǔn)備、檢測(cè)操作、質(zhì)量控制、結(jié)果判讀及廢棄物處理等環(huán)節(jié)。熟悉并嚴(yán)格執(zhí)行本規(guī)程，有助于減少操作誤差，提高檢測(cè)效率。

**二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備**

（一）試劑與耗材

1.**樣本采集管**：

(1)選擇合適的采血管，如含有EDTA抗凝劑的管用于全血樣本，或含有肝素抗凝劑的管用于血漿樣本，根據(jù)檢測(cè)目的和后續(xù)步驟選擇。

(2)確保采血管無破損、無污染，批號(hào)一致。

(3)配備采血針、止血帶、消毒棉簽（如70%酒精棉片）。

2.**抗體檢測(cè)試劑盒**：

(1)根據(jù)檢測(cè)目標(biāo)抗體（如IgG、IgM、IgA等）選擇對(duì)應(yīng)的試劑盒，常見類型包括：

(a)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒。

(b)化學(xué)發(fā)光免疫分析法試劑盒。

(c)時(shí)間分辨熒光免疫分析法（TRFIA）試劑盒。

(2)檢查試劑盒在有效期內(nèi)，包裝完好，無破損或泄漏。

(3)仔細(xì)閱讀并保存試劑盒說明書，理解原理、操作步驟及注意事項(xiàng)。

3.**試劑配制**：

(1)**底物溶液**：根據(jù)試劑盒要求，用無菌水或緩沖液配制成適當(dāng)濃度，如TMB（3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine）底物液。注意避光保存。

(2)**洗滌液**：使用預(yù)混好的洗滌液（通常是含Tween-20的PBS緩沖液），避免使用自來水或非無菌水。

(3)**標(biāo)準(zhǔn)品/校準(zhǔn)品**：使用試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品，或經(jīng)過驗(yàn)證的、定量的標(biāo)準(zhǔn)品原液，用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。確保標(biāo)準(zhǔn)品在有效期內(nèi)。

(4)**終止液**：對(duì)于ELISA等需要終止反應(yīng)的檢測(cè)，使用硫酸或氫氧化鈉溶液，配制時(shí)需精確控制pH值。

4.**其他耗材**：

(1)**移液器及吸頭**：配置不同量程的移液器（如10-100μL,100-1000μL），并準(zhǔn)備與實(shí)驗(yàn)需求匹配的無菌吸頭。定期檢查移液器準(zhǔn)確性。

(2)**微量離心管**：選擇合適規(guī)格（如1.5mL,2mL）的一次性離心管，確保管蓋密封良好。

(3)**酶標(biāo)板/微孔板**：使用無菌、透明、表面光潔的96孔或384孔酶標(biāo)板。配備酶標(biāo)板架、吸水紙。

(4)**微量加樣器（移液器）**：用于精確移取少量試劑（如標(biāo)準(zhǔn)品稀釋、樣本稀釋）。

(5)**槍頭架/移液器架**：方便放置和整理吸頭。

（二）儀器設(shè)備

1.**移液器**：

(1)檢查移液器功能是否正常，包括啟動(dòng)、停止、重復(fù)性等。必要時(shí)進(jìn)行校準(zhǔn)。

(2)根據(jù)不同量程選擇合適的移液器類型（如單道、八道）。

2.**離心機(jī)**：

(1)確保離心機(jī)轉(zhuǎn)子平衡，關(guān)好門后才能啟動(dòng)。

(2)根據(jù)樣本類型和實(shí)驗(yàn)要求設(shè)置合適的轉(zhuǎn)速（如全血樣本常需3000-5000r/min，血漿樣本1000-3000r/min）和時(shí)間（如10-15分鐘）。

(3)離心后確保樣本完全分離，小心開蓋取管。

3.**酶標(biāo)儀/化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀**：

(1)開機(jī)預(yù)熱至少30分鐘。

(2)使用標(biāo)準(zhǔn)白板或校準(zhǔn)品進(jìn)行每日校準(zhǔn)，確保波長(zhǎng)準(zhǔn)確性（如450nm,520nm,630nm等）。

(3)清潔檢測(cè)窗口，確保無指紋或污漬。

(4)對(duì)于化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀，檢查閃爍計(jì)數(shù)器是否正常工作。

4.**冰箱**：

(1)用于樣本和試劑的低溫保存。確保溫度穩(wěn)定在2-8℃。定期檢查溫度記錄。

(2)分區(qū)存放：樣本區(qū)、試劑區(qū)（按需冷藏或冷凍）。

5.**水浴鍋/恒溫振蕩器**：

(1)用于樣本或試劑的孵育，需設(shè)置并驗(yàn)證溫度（如37℃±0.5℃）。

(2)恒溫振蕩器可提高孵育效率，確保混勻。

（三）實(shí)驗(yàn)環(huán)境

1.**實(shí)驗(yàn)室布局**：

(1)檢測(cè)區(qū)域應(yīng)與樣本準(zhǔn)備、試劑配制、廢棄物處理區(qū)域分開，減少交叉污染風(fēng)險(xiǎn)。

(2)配備生物安全柜或超凈工作臺(tái)，用于開蓋、加樣等高風(fēng)險(xiǎn)操作。

2.**清潔與消毒**：

(1)每日實(shí)驗(yàn)前使用70%酒精擦拭操作臺(tái)面、設(shè)備表面。

(2)實(shí)驗(yàn)后徹底清潔，去除殘留物。

(3)定期（如每周）使用消毒劑對(duì)地面、墻面進(jìn)行消毒。

3.**個(gè)人防護(hù)**：

(1)操作時(shí)必須佩戴一次性手套。

(2)根據(jù)需要佩戴護(hù)目鏡或面屏，防止試劑濺射。

(3)穿戴實(shí)驗(yàn)服或隔離衣。

**三、操作步驟**

（一）樣本采集與處理

1.**樣本采集**：

(1)向受試者解釋采集目的和流程，獲取知情同意。

(2)根據(jù)需要使用止血帶，按要求部位（通常為肘正中靜脈）進(jìn)行穿刺。

(3)避免止血帶過緊或壓迫時(shí)間過長(zhǎng)，以免影響樣本結(jié)果。

(4)使用無菌采血管，緩慢注入血液，避免產(chǎn)生氣泡。

(5)采集完成后，松開止血帶，按壓穿刺點(diǎn)止血，整理好針頭和采血管。

2.**樣本運(yùn)輸**：

(1)立即蓋緊采血管蓋，避免樣本溢出。

(2)根據(jù)要求將樣本送至實(shí)驗(yàn)室，如需冷藏，應(yīng)在1小時(shí)內(nèi)送達(dá)。

3.**樣本處理**：

(1)檢查采血管是否有破損、凝血或溶血。溶血樣本可能影響某些檢測(cè)。

(2)將采血管置于渦旋振蕩器上，充分混勻（如10-15秒）。

(3)3000-5000r/min離心10-15分鐘，分離血清或血漿。

(4)小心吸取上層血清/血漿至干凈、無菌的1.5mL或2mL離心管中，避免吸到管底的紅細(xì)胞。

(5)如需檢測(cè)IgM等不耐熱抗體，需立即分離并凍存血漿。

(6)若樣本量不足或無法立即處理，可加入防腐劑（如甲苯）或立即凍存（-20℃或-80℃）。

（二）試劑準(zhǔn)備與校準(zhǔn)

1.**試劑平衡**：

(1)所有試劑（樣本、標(biāo)準(zhǔn)品、試劑）在使用前應(yīng)恢復(fù)至室溫（通常為20-25℃），避免低溫導(dǎo)致結(jié)晶或反應(yīng)不完全。

(2)檢查試劑有無沉淀、變色或渾濁，如有異常，不得使用。

2.**標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)備**：

(1)按照說明書要求，用稀釋液（通常是試劑盒配套的稀釋液或生理鹽水）將高濃度標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行系列稀釋，配制出一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品工作液。

(2)確保稀釋過程準(zhǔn)確無誤，建議使用微量移液器。

(3)記錄各標(biāo)準(zhǔn)品孔的濃度。

3.**儀器校準(zhǔn)**：

(1)檢查酶標(biāo)儀的波長(zhǎng)設(shè)置是否與試劑盒要求一致。

(2)使用配套校準(zhǔn)品或標(biāo)準(zhǔn)白板，在設(shè)定波長(zhǎng)下進(jìn)行校準(zhǔn)，確保讀數(shù)準(zhǔn)確。

（三）檢測(cè)操作（以ELISA為例）

1.**加樣**：

(1)在潔凈的酶標(biāo)板上，用記號(hào)筆標(biāo)明樣本孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔、對(duì)照孔的位置。

(2)使用不同吸頭分別吸取樣本、標(biāo)準(zhǔn)品、試劑，避免交叉污染。

(3)按順序加入樣本/標(biāo)準(zhǔn)品，每孔100μL，加樣均勻，避免氣泡。

(4)蓋上封板膜或板蓋，防止蒸發(fā)和污染。

2.**孵育**：

(1)將酶標(biāo)板置于37℃水浴鍋中，或使用恒溫振蕩器在37℃孵育60分鐘。

(2)如使用化學(xué)發(fā)光法，孵育時(shí)間可能不同，請(qǐng)嚴(yán)格按說明書操作。

3.**洗滌**：

(1)小心取出酶標(biāo)板，棄去孔內(nèi)液體。

(2)在酶標(biāo)板架上，每孔加入洗滌液250-300μL，輕輕晃動(dòng)或用洗板機(jī)洗滌1-2次。

(3)棄去洗滌液，甩干或用吸水紙吸干邊緣殘留液體，注意不要吸干孔內(nèi)液體。

(4)重復(fù)洗滌3-4次，以充分去除未結(jié)合物。

4.**加酶標(biāo)抗體/底物**：

(1)加入酶標(biāo)抗體（或酶標(biāo)記物，如辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗）100μL/孔。

(2)如為TMB底物，則直接加入TMB底物液100μL/孔。

(3)蓋上封板膜或板蓋，室溫避光孵育30-60分鐘。

5.**終止反應(yīng)**：

(1)小心取出酶標(biāo)板，棄去孔內(nèi)液體。

(2)加入終止液50-100μL/孔，混勻（可輕輕拍打或用移液器混勻）。

(3)終止液會(huì)改變酶促反應(yīng)的顏色，如TMB由藍(lán)變黃。

（四）結(jié)果讀取與計(jì)算

1.**酶標(biāo)儀檢測(cè)**：

(1)立即將終止后的酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀中。

(2)設(shè)置讀數(shù)波長(zhǎng)（如TMB法為450nm，設(shè)參考波長(zhǎng)為630nm或?yàn)V光片空白調(diào)零）。

(3)讀取各孔的OD值（吸光度值）。

2.**數(shù)據(jù)記錄**：

(1)記錄所有孔的原始OD值，包括空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣本孔、對(duì)照孔。

(2)計(jì)算空白孔校正值（各孔OD值-空白孔OD值）。

3.**標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制與樣本濃度計(jì)算**：

(1)以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)（log）為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的校正OD值為縱坐標(biāo)，在Excel等軟件中繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(2)選擇合適的曲線回歸方程（如線性回歸，R2值應(yīng)大于0.99）。

(3)將樣本的校正OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出樣本中抗體的濃度（或相對(duì)含量）。

（五）質(zhì)量控制（QC）

1.**空白對(duì)照**：

(1)空白孔應(yīng)加稀釋液或樣本稀釋液，用于校正背景吸收。

(2)空白孔校正OD值應(yīng)小于0.1（或根據(jù)試劑盒說明書要求），否則實(shí)驗(yàn)無效。

2.**陰性對(duì)照**：

(1)陰性對(duì)照應(yīng)使用已知不含目標(biāo)抗體的樣本或稀釋液。

(2)陰性對(duì)照結(jié)果應(yīng)為陰性，OD值在閾值以下。

3.**陽性對(duì)照**：

(1)陽性對(duì)照應(yīng)使用已知含目標(biāo)抗體的樣本或標(biāo)準(zhǔn)品。

(2)陽性對(duì)照結(jié)果應(yīng)為陽性，OD值在閾值以上，且在預(yù)期范圍內(nèi)。

4.**重復(fù)性檢測(cè)**：

(1)對(duì)于臨界值或結(jié)果可疑的樣本，建議進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)。

5.**室內(nèi)質(zhì)控（IQC）**：

(1)每日或按頻率使用質(zhì)控品進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)估實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性。

(2)質(zhì)控品結(jié)果應(yīng)在允許范圍內(nèi)，否則需查找原因并重做實(shí)驗(yàn)。

**四、結(jié)果分析與保存**

（一）結(jié)果判讀

1.**閾值設(shè)定**：

(1)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和陰性對(duì)照結(jié)果，確定檢測(cè)的陽性/陰性閾值。通常以陰性對(duì)照OD值的2-3倍或根據(jù)廠家建議設(shè)定。

2.**結(jié)果判定**：

(1)樣本校正OD值≥閾值，判讀為陽性。

(2)樣本校正OD值<閾值，判讀為陰性。

3.**結(jié)果報(bào)告**：

(1)以具體數(shù)值（如ng/mL、IU/mL）和陽性/陰性狀態(tài)報(bào)告結(jié)果。

(2)如結(jié)果處于臨界范圍，需注明并建議復(fù)查。

（二）數(shù)據(jù)記錄與保存

1.**原始數(shù)據(jù)**：

(1)實(shí)驗(yàn)記錄本或電子記錄系統(tǒng)應(yīng)記錄：樣本編號(hào)、日期、操作員、試劑批號(hào)、儀器型號(hào)、所有原始OD值、計(jì)算過程、質(zhì)控結(jié)果等。

(2)保留原始酶標(biāo)板掃描圖像或電子版數(shù)據(jù)。

2.**結(jié)果報(bào)告**：

(1)按規(guī)定格式生成檢測(cè)報(bào)告，包含樣本信息、檢測(cè)結(jié)果、參考區(qū)間（如有）、檢測(cè)方法、操作人員等。

3.**文檔保存**：

(1)原始數(shù)據(jù)和報(bào)告按檔案管理規(guī)