免疫學(xué)細(xì)菌檢測(cè)規(guī)范###一、概述

免疫學(xué)細(xì)菌檢測(cè)是一種利用抗原-抗體反應(yīng)原理，對(duì)細(xì)菌感染進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的診斷方法。本規(guī)范旨在明確免疫學(xué)細(xì)菌檢測(cè)的操作流程、質(zhì)量控制要點(diǎn)及結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)，確保檢測(cè)結(jié)果的可靠性和一致性。主要涵蓋標(biāo)本采集、試劑準(zhǔn)備、操作步驟、質(zhì)量控制及結(jié)果報(bào)告等環(huán)節(jié)。

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###二、標(biāo)本采集與處理

（一）標(biāo)本類(lèi)型

1.血液：適用于敗血癥、菌血癥等全身性感染的檢測(cè)。

2.尿液：適用于尿路感染、腎盂腎炎等泌尿系統(tǒng)感染的檢測(cè)。

3.痰液：適用于呼吸道感染的檢測(cè)。

4.膿液：適用于皮膚軟組織感染、骨髓炎等局部感染的檢測(cè)。

（二）標(biāo)本采集要點(diǎn)

1.嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)菌操作，避免污染。

2.按照檢測(cè)項(xiàng)目要求采集適量標(biāo)本（如血液5mL，尿液5mL）。

3.及時(shí)送檢，避免長(zhǎng)時(shí)間放置導(dǎo)致細(xì)菌降解或成分變化。

（三）標(biāo)本處理

1.血液：抗凝處理后立即檢測(cè)或冷藏保存（≤4℃）。

2.尿液：離心后取上清液檢測(cè)。

3.痰液：靜置30分鐘后取沉淀物涂片鏡檢，剩余標(biāo)本用于檢測(cè)。

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###三、試劑準(zhǔn)備與校準(zhǔn)

（一）試劑類(lèi)型

1.試劑盒：包含抗體微孔板、酶標(biāo)抗體、底物溶液等。

2.標(biāo)準(zhǔn)品：用于校準(zhǔn)檢測(cè)曲線，確保結(jié)果準(zhǔn)確性。

（二）試劑檢查

1.檢查試劑盒有效期，確保在有效期內(nèi)使用。

2.檢查試劑包裝是否完好，避免破損或凍融。

（三）校準(zhǔn)步驟

1.使用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行校準(zhǔn)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.校準(zhǔn)曲線R2值應(yīng)≥0.99，否則需重新校準(zhǔn)。

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###四、操作步驟

（一）免疫熒光法

1.**標(biāo)本稀釋**：按試劑盒說(shuō)明稀釋標(biāo)本（如1:10稀釋血液樣本）。

2.**加樣**：將稀釋后的標(biāo)本加入微孔板，每孔100μL。

3.**孵育**：37℃孵育30分鐘，封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。

4.**加酶標(biāo)抗體**：加入特異性酶標(biāo)抗體，37℃孵育30分鐘。

5.**顯色**：加入底物溶液，避光反應(yīng)10-20分鐘。

6.**終止**：加入終止液，混勻后酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值。

（二）ELISA法

1.**板孔封閉**：加入封閉液，37℃封閉1小時(shí)。

2.**加標(biāo)本**：每孔加入100μL標(biāo)本，37℃孵育1小時(shí)。

3.**洗滌**：用洗滌液洗滌3次，拍干。

4.**加酶標(biāo)抗體**：37℃孵育30分鐘。

5.**顯色與終止**：同免疫熒光法步驟。

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###五、質(zhì)量控制

（一）室內(nèi)質(zhì)控

1.每日檢測(cè)1份質(zhì)控品，結(jié)果應(yīng)處于允許范圍內(nèi)（如CV≤10%）。

2.每周進(jìn)行一次空白對(duì)照和陰性對(duì)照檢測(cè)。

（二）室間質(zhì)評(píng)

1.參加第三方機(jī)構(gòu)提供的免疫學(xué)檢測(cè)質(zhì)評(píng)項(xiàng)目。

2.定期評(píng)估檢測(cè)結(jié)果與參考值的偏差，及時(shí)調(diào)整操作流程。

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###六、結(jié)果判讀與報(bào)告

（一）結(jié)果判讀

1.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本濃度，與cut-off值比較判斷陽(yáng)性或陰性。

2.陽(yáng)性樣本需進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，確認(rèn)結(jié)果一致性。

（二）報(bào)告規(guī)范

1.報(bào)告格式：項(xiàng)目名稱(chēng)、樣本編號(hào)、檢測(cè)結(jié)果（陽(yáng)性/陰性）、參考范圍。

2.異常結(jié)果需注明稀釋倍數(shù)及單位（如ng/mL）。

（三）注意事項(xiàng)

1.高危樣本（如結(jié)核分枝桿菌）需進(jìn)行特殊處理，并標(biāo)注潛在風(fēng)險(xiǎn)。

2.結(jié)果報(bào)告需由授權(quán)人員審核簽字。

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###七、安全與廢棄物處理

（一）操作安全

1.佩戴防護(hù)用品（手套、口罩、實(shí)驗(yàn)服）。

2.避免標(biāo)本交叉污染，使用一次性吸頭和移液器。

（二）廢棄物處理

1.化學(xué)試劑按規(guī)范分類(lèi)存放，避免混放。

2.廢棄標(biāo)本和試劑需高溫高壓滅菌后統(tǒng)一處理。

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###一、概述

免疫學(xué)細(xì)菌檢測(cè)是一種利用抗原-抗體反應(yīng)原理，對(duì)細(xì)菌感染進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的診斷方法。本規(guī)范旨在明確免疫學(xué)細(xì)菌檢測(cè)的操作流程、質(zhì)量控制要點(diǎn)及結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)，確保檢測(cè)結(jié)果的可靠性和一致性。主要涵蓋標(biāo)本采集、試劑準(zhǔn)備、操作步驟、質(zhì)量控制及結(jié)果報(bào)告等環(huán)節(jié)。

免疫學(xué)細(xì)菌檢測(cè)方法多樣，包括但不限于免疫熒光法（IF）、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）、膠體金免疫層析法（GICA）等。不同方法適用于不同場(chǎng)景和樣本類(lèi)型。本規(guī)范以ELISA和GICA為代表的固相免疫吸附法為主進(jìn)行闡述，同時(shí)兼顧其他方法的共性要求。

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###二、標(biāo)本采集與處理

（一）標(biāo)本類(lèi)型

1.**血液**：適用于敗血癥、菌血癥、心內(nèi)膜炎等全身性細(xì)菌感染的檢測(cè)。建議采集靜脈血，對(duì)于新生兒或危重患者，可根據(jù)情況選擇動(dòng)脈血或毛細(xì)血管血，但需注意采血量和抗凝方式可能影響結(jié)果。

2.**尿液**：適用于尿路感染（如膀胱炎、腎盂腎炎）、前列腺炎等泌尿系統(tǒng)感染的檢測(cè)。推薦采集中段尿，避免污染。對(duì)于無(wú)法自行排尿者，需嚴(yán)格無(wú)菌操作下進(jìn)行導(dǎo)尿或留取膀胱穿刺尿。

3.**痰液**：適用于社區(qū)獲得性肺炎、醫(yī)院獲得性肺炎等呼吸道感染的檢測(cè)。指導(dǎo)患者深咳，收集深部痰液，避免唾液和上呼吸道分泌物污染。對(duì)于無(wú)力咳痰者，可經(jīng)纖支鏡或高流量吸痰器采集。

4.**膿液/病灶分泌物**：適用于皮膚軟組織感染（如膿腫、蜂窩織炎）、骨髓炎、腦膜炎等局部感染。用無(wú)菌棉簽蘸取膿液，或?qū)\表病灶進(jìn)行無(wú)菌針頭抽吸。深部病灶需在影像學(xué)引導(dǎo)下采集。

5.**腦脊液（CSF）**：適用于細(xì)菌性腦膜炎的檢測(cè)。需嚴(yán)格無(wú)菌操作下進(jìn)行腰椎穿刺，留取足夠量的腦脊液（通常3-5mL）。

6.**糞便**：在某些腸道細(xì)菌感染（如沙門(mén)氏菌、志賀氏菌）的檢測(cè)中可能使用，但需注意免疫學(xué)方法對(duì)糞便中細(xì)菌抗原的檢出率可能受食物殘?jiān)?、消化酶等因素影響，必要時(shí)結(jié)合培養(yǎng)法。

（二）標(biāo)本采集要點(diǎn)

1.**無(wú)菌操作**：所有操作必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌原則，使用無(wú)菌采集容器和工具，防止外源性細(xì)菌污染。操作前后徹底洗手或手消毒。

2.**適量采集**：根據(jù)檢測(cè)方法和樣本類(lèi)型，采集足量標(biāo)本。例如，血液檢測(cè)通常需5-10mL，尿液需5-10mL，痰液需足夠覆蓋痰液層的標(biāo)本量（約1-2mL），膿液需1-2mL，腦脊液需3-5mL。標(biāo)本量不足可能影響檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性。

3.**及時(shí)送檢**：標(biāo)本采集后應(yīng)盡快送檢。大部分標(biāo)本需在2小時(shí)內(nèi)完成檢測(cè)，若無(wú)法及時(shí)檢測(cè)，應(yīng)按照試劑盒要求進(jìn)行冷藏（通常2-8℃）或冷凍（需注明解凍順序），并記錄保存溫度和時(shí)間。避免反復(fù)凍融。

4.**標(biāo)識(shí)清晰**：標(biāo)本容器必須貼有清晰、完整的標(biāo)識(shí)，包括樣本類(lèi)型、患者信息（姓名、ID號(hào)）、采集時(shí)間、采集人員等。

5.**禁止使用防腐劑**：除非特殊說(shuō)明，采集的標(biāo)本中不得加入任何防腐劑或抗凝劑，這些物質(zhì)可能干擾檢測(cè)結(jié)果。

（三）標(biāo)本處理

1.**血液**：

-抗凝：若使用血漿，需使用合適的抗凝管（如EDTA、肝素或檸檬酸鈉，具體依檢測(cè)要求而定），充分混勻。若使用血清，需采集全血后室溫靜置30-60分鐘，待血液完全凝固后3000-4000rpm離心10分鐘，小心分離血清，避免溶血。

-處理：若檢測(cè)的是血漿，可直接使用；若檢測(cè)血清，需取上清。對(duì)于高脂血癥或黃疸樣本，可能需要進(jìn)行去脂或去黃疸處理（如用乙酸乙酯萃取）。

2.**尿液**：

-離心：取5mL尿液樣本，以3000rpm離心5分鐘，棄去上清，取沉淀物（白細(xì)胞等）進(jìn)行檢測(cè)。若檢測(cè)的是尿沉渣中的細(xì)菌抗原，此步驟至關(guān)重要。若檢測(cè)尿液中的可溶性抗原，可取上清液。

-處理：沉淀物應(yīng)立即加入適量樣本稀釋液（如pH7.4PBS緩沖液）懸浮，或直接加入ELISA板孔中。

3.**痰液**：

-涂片鏡檢：取少量痰液涂片，進(jìn)行革蘭染色或抗酸染色，觀察有無(wú)細(xì)菌及分類(lèi)，有助于初步判斷和優(yōu)化后續(xù)免疫學(xué)檢測(cè)。

-處理：剩余痰液加入1-2mL生理鹽水或?qū)Ｓ孟♂屢海浞终袷幓靹蛑瞥商祽乙?。必要時(shí)可通過(guò)離心沉淀去除大顆粒雜質(zhì)。

4.**膿液/病灶分泌物**：

-直接使用：對(duì)于GICA等快速檢測(cè)，可直接將膿液或分泌物點(diǎn)在檢測(cè)條上。對(duì)于ELISA，需用無(wú)菌吸管吸取適量樣本，加入稀釋液制成均勻懸液。

-排除壞死組織：盡量收集富含細(xì)菌的液體部分，避開(kāi)壞死組織。

5.**腦脊液**：

-直接使用：CSF通常無(wú)需特殊處理，可直接加入檢測(cè)反應(yīng)體系中。注意避免氣泡干擾。

-蛋白質(zhì)含量：若CSF蛋白含量過(guò)高（通常>100mg/dL），可能影響某些檢測(cè)方法的線性范圍，必要時(shí)可進(jìn)行適當(dāng)稀釋?zhuān)ㄐ枳⒚飨♂尡稊?shù)）。

6.**糞便**（若適用）：

-取樣：取粘液狀或膿血部分，避免糞便表面contamination。約1-2g糞便樣品。

-處理：稱(chēng)取糞便樣品，加入適量生理鹽水或緩沖液（如含0.1%吐溫-80的PBS），充分研磨勻漿。若檢測(cè)包涵體或細(xì)胞內(nèi)抗原，可能需要加入裂解液處理。

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###三、試劑準(zhǔn)備與校準(zhǔn)

（一）試劑類(lèi)型

1.**試劑盒**：

-**ELISA試劑盒**：通常包含預(yù)包被抗體微孔板、標(biāo)準(zhǔn)品（已知濃度）、酶標(biāo)抗體（二抗或檢測(cè)抗體）、底物溶液（如TMB）、終止液（硫酸或鹽酸）。

-**GICA試劑盒**：通常為即用型檢測(cè)條，包含硝酸纖維素膜、金標(biāo)抗體、樣本墊、質(zhì)控線（T線、C線）。

-**其他**：可能還需輔助試劑，如洗滌液（ELISA）、稀釋液（痰液、糞便等樣本）、封閉液（ELISA）、抗體稀釋液等。

2.**標(biāo)準(zhǔn)品**：高純度、高回收率的細(xì)菌抗原或抗體標(biāo)準(zhǔn)品，用于建立檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，是保證結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵。需在有效期內(nèi)使用，并妥善保存（通常2-8℃）。

3.**質(zhì)控品**：水平定值的質(zhì)控品（低、中、高），用于日常運(yùn)行監(jiān)控和室內(nèi)質(zhì)控。質(zhì)控品應(yīng)與樣本同條件檢測(cè)。

（二）試劑檢查

1.**包裝與外觀**：檢查試劑盒包裝是否完好無(wú)損，有無(wú)破損、泄漏。檢查試劑瓶有無(wú)裂紋，溶液顏色、透明度是否正常，有無(wú)沉淀或異物。開(kāi)封后的試劑是否在說(shuō)明書(shū)規(guī)定的有效期內(nèi)使用。

2.**有效期**：核對(duì)試劑盒和標(biāo)準(zhǔn)品的生產(chǎn)日期、有效期。過(guò)期試劑嚴(yán)禁使用。

3.**儲(chǔ)存條件**：確認(rèn)試劑的儲(chǔ)存條件是否正確（如2-8℃、-20℃等），并檢查儲(chǔ)存是否合規(guī)。

4.**標(biāo)簽信息**：確認(rèn)試劑名稱(chēng)、批號(hào)、生產(chǎn)單位等信息是否清晰、準(zhǔn)確。

5.**溶解與復(fù)溶**：對(duì)于凍干試劑，需按說(shuō)明書(shū)要求用無(wú)菌水或指定緩沖液溶解，充分混勻，避免氣泡。復(fù)溶后的試劑需在規(guī)定時(shí)間內(nèi)使用，并在新包裝上注明復(fù)溶日期。

（三）校準(zhǔn)步驟（以ELISA為例）

1.**標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制**：

a.取出標(biāo)準(zhǔn)品，在室溫下平衡15-30分鐘。

b.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度和試劑盒說(shuō)明，設(shè)置不同濃度梯度（通常設(shè)6-7個(gè)濃度點(diǎn)，包含零標(biāo)準(zhǔn)）。

c.將標(biāo)準(zhǔn)品按梯度加入已包被的ELISA板孔中，每孔100-200μL，設(shè)置空白孔（加樣本稀釋液）。

d.置于濕盒中，按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行封閉（通常37℃，1小時(shí)）。

e.棄封閉液，用洗滌液洗滌板孔（通常洗滌5-6次，每次3分鐘，吸水拍干或使用洗板機(jī)）。

f.加入酶標(biāo)抗體，37℃孵育30分鐘。

g.棄酶標(biāo)抗體，同法洗滌。

h.加入底物溶液，避光反應(yīng)（如TMB顯色，通常10-30分鐘，時(shí)間依說(shuō)明書(shū)和顏色深淺調(diào)整）。

i.加入終止液，終止反應(yīng)（如加入硫酸，顏色由藍(lán)變黃）。

j.使用酶標(biāo)儀在指定波長(zhǎng)（如450nm）測(cè)定各孔吸光度值（OD值）。

k.以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。選擇線性關(guān)系最好的部分（R2應(yīng)≥0.99）進(jìn)行擬合，得到線性回歸方程（y=mx+b）。

2.**校準(zhǔn)驗(yàn)證**：

a.檢查標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍是否滿足實(shí)際樣本濃度要求。

b.計(jì)算曲線斜率（m）和截距（b），評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)曲線的靈敏度。

c.若R2值不達(dá)標(biāo)，需重新校準(zhǔn)或檢查試劑、操作是否存在問(wèn)題。

3.**GICA校準(zhǔn)**：GICA通常使用內(nèi)置的質(zhì)控線（C線）進(jìn)行定性或半定量校準(zhǔn)。C線陽(yáng)性表示檢測(cè)系統(tǒng)工作正常。若C線不顯色，則表明試劑無(wú)效或操作不當(dāng)。定量GICA可能需要使用標(biāo)準(zhǔn)品制作校準(zhǔn)曲線。

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###四、操作步驟

（一）免疫熒光法（IF）

1.****標(biāo)本制備****：

(1)血液/組織樣本：制備細(xì)胞懸液或組織切片（如冰凍切片）。

(2)尿液/膿液等：直接使用或適當(dāng)稀釋。

2.****固定****：

(1)將標(biāo)本滴加在載玻片上，室溫晾干或37℃干燥5-10分鐘。

(2)用固定液（如冷丙酮、甲醇或含福爾馬林的固定液）固定5-10分鐘，固定液需預(yù)冷或新鮮配制。

(3)吸去固定液，空氣干燥。

3.****封閉****：

(1)滴加封閉液（如5%BSA或脫脂奶粉溶液），37℃孵育30分鐘，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。

(2)吸去封閉液，用PBS或TBS緩沖液洗滌3次，每次5分鐘。

4.****加一抗****：

(1)滴加特異性第一抗體（針對(duì)細(xì)菌抗原），37℃孵育30-60分鐘。

(2)若檢測(cè)溫度敏感抗體，可置4℃過(guò)夜孵育。

5.****洗滌****：

(1)用洗滌緩沖液（含0.05%Tween-20的PBS/TBS）洗滌3-5次，每次5分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。

6.****加二抗****：

(1)滴加親和素標(biāo)記的二抗（若一抗為動(dòng)物源性）或生物素標(biāo)記的二抗（若一抗為人源性，需先加親和素/生物素）。

(2)37℃孵育30分鐘。

7.****洗滌****：同步驟5。

8.****顯色/熒光檢測(cè)****：

(1)**熒光素標(biāo)記**：滴加熒光標(biāo)記劑（如異硫氰酸熒光素FITC、藻紅蛋白PE），避光孵育10-20分鐘。

(2)**酶標(biāo)記**：滴加酶底物溶液（如DAB或AEC），室溫顯色5-10分鐘，觀察顏色變化。

(3)**直接熒光標(biāo)記**：若二抗已帶熒光素，則直接洗滌后用熒光顯微鏡觀察。

9.****終止與觀察****：

(1)熒光法：蓋上蓋玻片，置于熒光顯微鏡下，調(diào)節(jié)光源和濾光片，觀察熒光信號(hào)（通常用DAPI復(fù)染細(xì)胞核）。

(2)酶標(biāo)法：用蒸餾水或PBS洗滌終止顯色，顯微鏡下觀察顏色陽(yáng)性細(xì)胞或部位。

（二）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）

1.****板孔準(zhǔn)備****：

(1)從冰箱中取出包被板，室溫平衡15-30分鐘。

(2)若板孔內(nèi)殘留液體，可吸去或用吸水紙吸干。

2.****加樣本/標(biāo)準(zhǔn)品****：

(1)按照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制或試劑盒說(shuō)明，設(shè)置空白孔、陰性對(duì)照孔、陽(yáng)性對(duì)照孔及樣本孔。

(2)每孔加入100-200μL樣本稀釋液或標(biāo)準(zhǔn)品，輕輕晃動(dòng)板架混勻，室溫孵育1-2小時(shí)。

3.****洗滌****：

(1)棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液（含0.05%Tween-20）洗滌5-6次，每次3分鐘。

(2)洗滌后用吸水紙拍干板底，或使用洗板機(jī)吸除液體。

(3)注意避免吸干，保持微濕。

4.****加酶標(biāo)抗體****：

(1)按說(shuō)明加入酶標(biāo)抗體，每孔100-200μL，輕輕混勻，37℃孵育30分鐘。

5.****再次洗滌****：同步驟3。

6.****加底物****：

(1)棄去洗滌液，加入新鮮配制的底物溶液（如TMB），每孔100-200μL。

(2)避光反應(yīng)，時(shí)間依說(shuō)明書(shū)和顏色變化調(diào)整（如10-30分鐘）。

7.****終止反應(yīng)****：

(1)加入終止液（如2MH?SO?），每孔100-200μL，混勻。

(2)顏色由藍(lán)變黃。

8.****酶標(biāo)儀檢測(cè)****：

(1)立即使用酶標(biāo)儀在指定波長(zhǎng)下測(cè)定各孔OD值（如450nm，參考波長(zhǎng)600-630nm）。

(2)記錄數(shù)據(jù)，確保OD值在檢測(cè)范圍內(nèi)。

（三）膠體金免疫層析法（GICA）

1.****樣本準(zhǔn)備****：

(1)將樣本用稀釋液按說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行稀釋?zhuān)ㄈ缒蛞簶颖局苯邮褂?，血液需用?zhuān)用稀釋液）。

(2)充分混勻樣本。

2.****加樣**：

(1)將樣本用吸管垂直滴加到檢測(cè)條的樣本孔（SampleWell）中，注意滴加量需在說(shuō)明書(shū)要求的范圍內(nèi)（如2-3滴，約100-200μL），避免溢出。

3.****反應(yīng)與顯色**：

(1)將檢測(cè)條平放，用吸管吸少量樣本稀釋液（若有）滴加在質(zhì)控線（C線）外側(cè)，以啟動(dòng)反應(yīng)。

(2)放置在室溫（通常15-30℃）下反應(yīng)，等待結(jié)果出現(xiàn)。

(3)時(shí)間依說(shuō)明書(shū)而定（如10-15分鐘）。

4.****結(jié)果判讀**：

(1)觀察檢測(cè)線（T線）和質(zhì)控線（C線）是否顯色。

(2)**陽(yáng)性**：T線和C線均顯色。

(3)**陰性**：僅C線顯色，T線不顯色。

(4)**無(wú)效**：C線不顯色（無(wú)論T線是否顯色），提示試劑或操作無(wú)效，需重新檢測(cè)。

5.****記錄**：**記錄樣本編號(hào)和結(jié)果（陽(yáng)性/陰性/無(wú)效）。

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###五、質(zhì)量控制

（一）室內(nèi)質(zhì)控（IQC）

1.****質(zhì)控頻率****：每日檢測(cè)至少一份定值質(zhì)控品，每周進(jìn)行一次高、中、低三個(gè)水平質(zhì)控品的檢測(cè)。

2.****質(zhì)控范圍**：質(zhì)控結(jié)果應(yīng)在試劑盒說(shuō)明書(shū)規(guī)定的允許范圍內(nèi)（通常以均值±標(biāo)準(zhǔn)差或固定閾值表示）。若質(zhì)控值超出范圍，必須查找原因并糾正后方可繼續(xù)檢測(cè)。

3.****質(zhì)控項(xiàng)目**：

-**ELISA**：檢測(cè)線性范圍、靈敏度（低濃度點(diǎn)）、重復(fù)性（同一樣本多次檢測(cè)CV值）?？墒褂觅|(zhì)控圖（如Levey-Jennings圖）監(jiān)控趨勢(shì)。

-**GICA**：主要觀察質(zhì)控線（C線）是否穩(wěn)定顯色。

4.****失控處理**：質(zhì)控失控時(shí)，應(yīng)立即停止檢測(cè)，檢查試劑、儀器、操作流程等，問(wèn)題解決并重新驗(yàn)證后，方可重新開(kāi)始檢測(cè)，并對(duì)受影響樣本進(jìn)行重新檢測(cè)或標(biāo)記。

（二）室間質(zhì)評(píng)（EQA）

1.****參加計(jì)劃**：定期參加由第三方機(jī)構(gòu)（如臨檢中心、廠商等）組織的免疫學(xué)細(xì)菌檢測(cè)室間質(zhì)評(píng)計(jì)劃。

2.****樣本處理與檢測(cè)**：按照質(zhì)評(píng)計(jì)劃要求處理樣本并完成檢測(cè)。

3.****結(jié)果上報(bào)與反饋**：按時(shí)上報(bào)檢測(cè)結(jié)果，分析偏差原因，參與能力評(píng)估和結(jié)果反饋會(huì)議。

4.****持續(xù)改進(jìn)**：根據(jù)EQA結(jié)果評(píng)估實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力，優(yōu)化操作流程和質(zhì)控策略。

（三）方法學(xué)比較與驗(yàn)證（必要時(shí)）

1.****新方法引入**：當(dāng)引入新的檢測(cè)方法或試劑時(shí)，需進(jìn)行方法學(xué)比較和驗(yàn)證，確保其性能滿足臨床要求。

2.****驗(yàn)證項(xiàng)目**：包括線性范圍、靈敏度、特異性、抗干擾能力、重復(fù)性、回收率等。需使用合適的驗(yàn)證樣本（如新鮮樣本、凍存樣本、質(zhì)控品）進(jìn)行評(píng)估。

3.****結(jié)果確認(rèn)**：驗(yàn)證結(jié)果滿足預(yù)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)后方可正式用于臨床檢測(cè)。

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###六、結(jié)果判讀與報(bào)告

（一）結(jié)果計(jì)算（以ELISA為例）

1.****樣本濃度計(jì)算**：根據(jù)樣本的OD值和標(biāo)準(zhǔn)曲線方程（y=mx+b），計(jì)算樣本的細(xì)菌抗原濃度（如ng/mL或pg/mL）。

公式：樣本濃度=(樣本OD值-b)/m

2.****結(jié)果判定**：將計(jì)算出的樣本濃度與試劑盒提供的cut-off值（閾值）進(jìn)行比較。

-**陽(yáng)性**：樣本濃度≥cut-off值

-**陰性**：樣本濃度<cut-off值

3.****Cut-off值確定**：通常使用歷史樣本數(shù)據(jù)、ROC曲線分析或廠家建議的cut-off值。定期評(píng)估和校準(zhǔn)cut-off值。

（二）結(jié)果解釋

1.****陽(yáng)性結(jié)果**：提示樣本中存在目標(biāo)細(xì)菌抗原，可能存在細(xì)菌感染。需結(jié)合臨床癥狀、體征及其他檢查結(jié)果綜合判斷。

2.****陰性結(jié)果**：提示樣本中未檢出目標(biāo)細(xì)菌抗原。注意陰性結(jié)果不能完全排除感染可能（如感染早期、抗原量過(guò)低、檢測(cè)方法靈敏度限制等）。

3.****臨界值**：若樣本結(jié)果接近c(diǎn)ut-off值（如±10%），建議重復(fù)檢測(cè)或結(jié)合其他方法確認(rèn)。

（三）報(bào)告規(guī)范

1.****報(bào)告格式**：

-項(xiàng)目名稱(chēng)（如：大腸桿菌抗原定量ELISA）

-樣本標(biāo)識(shí)（姓名/ID，樣本類(lèi)型，檢測(cè)日期）

-檢測(cè)結(jié)果（陽(yáng)性/陰性/濃度值，單位）

-參考范圍（如有）

-方法學(xué)信息（如：免疫熒光法/ELISA）

-其他（如稀釋倍數(shù)、質(zhì)控狀態(tài)）

2.****報(bào)告內(nèi)容**：

-準(zhǔn)確記錄樣本信息和檢測(cè)項(xiàng)目。

-明確標(biāo)注結(jié)果（陽(yáng)性/陰性或具體數(shù)值）。

-如有特殊情況（如標(biāo)本不合格、結(jié)果可疑），需在報(bào)告上注明。

3.****報(bào)告審核**：所有檢測(cè)報(bào)告必須由授權(quán)技術(shù)人員審核簽字后方可發(fā)出。

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###七、安全與廢棄物處理

（一）操作安全

1.****個(gè)人防護(hù)**：實(shí)驗(yàn)人員在操作過(guò)程中必須穿戴實(shí)驗(yàn)服、手套、口罩。處理潛在污染樣本（如血液、腦脊液、膿液）時(shí)，應(yīng)佩戴防護(hù)眼鏡和耐刺穿鞋套。

2.****生物安全**：所有樣本均視為潛在傳染源，嚴(yán)格遵守生物安全等級(jí)操作要求。禁止樣本在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部共享或隨意丟棄。

3.****銳器處理**：使用后的針頭、注射器、解剖刀等銳器應(yīng)立即放入符合標(biāo)準(zhǔn)的銳器盒中，定期由專(zhuān)業(yè)機(jī)構(gòu)處理。

4.****化學(xué)品安全**：正確使用和儲(chǔ)存化學(xué)試劑（如固定液、底物溶液、洗滌液）。熟悉化學(xué)品安全數(shù)據(jù)表（SDS），了解其危害性和應(yīng)急處理措施。

5.****儀器操作**：嚴(yán)格按照儀器說(shuō)明書(shū)操作酶標(biāo)儀、熒光顯微鏡等設(shè)備，定期進(jìn)行維護(hù)和校準(zhǔn)。

6.****實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)**：確保實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)良好，特別是在進(jìn)行揮發(fā)性化學(xué)品操作或處理氣溶膠風(fēng)險(xiǎn)較高的樣本時(shí)。

（二）廢棄物處理

1.****分類(lèi)收集**：實(shí)驗(yàn)廢棄物應(yīng)按照風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)進(jìn)行分類(lèi)收集。

2.****標(biāo)本處理**：廢棄標(biāo)本必須經(jīng)過(guò)滅活處理（如高壓蒸汽滅菌15分鐘以上）后，方可作為醫(yī)療廢物處理。

3.****液體廢棄物**：含氯試劑（如固定液）和廢酶標(biāo)液等，需用大量水稀釋后中和（如加入碳酸鈉溶液），確保pH值中性后再排放。廢底物溶液（如TMB）需先酸化（如加入硫酸）并充分萃取，或按有害廢物規(guī)定處理。

4.****固體廢棄物**：吸水紙、離心管、試管等一次性耗材，若無(wú)污染可作為普通醫(yī)療廢物處理；若接觸過(guò)血液或體液，需視為潛在傳染源，放入防滲漏袋中統(tǒng)一處理。廢棄化學(xué)試劑瓶需空置、清洗、標(biāo)記后，按危險(xiǎn)廢物規(guī)定處理。

5.****消毒與清潔**：定期對(duì)實(shí)驗(yàn)臺(tái)面、設(shè)備表面、地面進(jìn)行清潔和消毒（使用70-75%酒精或有效氯消毒液）。操作結(jié)束后徹底清潔雙手。

6.****廢棄物處置**：所有醫(yī)療廢物和化學(xué)危險(xiǎn)廢物必須交由有資質(zhì)的專(zhuān)業(yè)公司進(jìn)行無(wú)害化處理，并做好處置記錄。

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###一、概述

免疫學(xué)細(xì)菌檢測(cè)是一種利用抗原-抗體反應(yīng)原理，對(duì)細(xì)菌感染進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的診斷方法。本規(guī)范旨在明確免疫學(xué)細(xì)菌檢測(cè)的操作流程、質(zhì)量控制要點(diǎn)及結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)，確保檢測(cè)結(jié)果的可靠性和一致性。主要涵蓋標(biāo)本采集、試劑準(zhǔn)備、操作步驟、質(zhì)量控制及結(jié)果報(bào)告等環(huán)節(jié)。

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###二、標(biāo)本采集與處理

（一）標(biāo)本類(lèi)型

1.血液：適用于敗血癥、菌血癥等全身性感染的檢測(cè)。

2.尿液：適用于尿路感染、腎盂腎炎等泌尿系統(tǒng)感染的檢測(cè)。

3.痰液：適用于呼吸道感染的檢測(cè)。

4.膿液：適用于皮膚軟組織感染、骨髓炎等局部感染的檢測(cè)。

（二）標(biāo)本采集要點(diǎn)

1.嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)菌操作，避免污染。

2.按照檢測(cè)項(xiàng)目要求采集適量標(biāo)本（如血液5mL，尿液5mL）。

3.及時(shí)送檢，避免長(zhǎng)時(shí)間放置導(dǎo)致細(xì)菌降解或成分變化。

（三）標(biāo)本處理

1.血液：抗凝處理后立即檢測(cè)或冷藏保存（≤4℃）。

2.尿液：離心后取上清液檢測(cè)。

3.痰液：靜置30分鐘后取沉淀物涂片鏡檢，剩余標(biāo)本用于檢測(cè)。

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###三、試劑準(zhǔn)備與校準(zhǔn)

（一）試劑類(lèi)型

1.試劑盒：包含抗體微孔板、酶標(biāo)抗體、底物溶液等。

2.標(biāo)準(zhǔn)品：用于校準(zhǔn)檢測(cè)曲線，確保結(jié)果準(zhǔn)確性。

（二）試劑檢查

1.檢查試劑盒有效期，確保在有效期內(nèi)使用。

2.檢查試劑包裝是否完好，避免破損或凍融。

（三）校準(zhǔn)步驟

1.使用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行校準(zhǔn)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.校準(zhǔn)曲線R2值應(yīng)≥0.99，否則需重新校準(zhǔn)。

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###四、操作步驟

（一）免疫熒光法

1.**標(biāo)本稀釋**：按試劑盒說(shuō)明稀釋標(biāo)本（如1:10稀釋血液樣本）。

2.**加樣**：將稀釋后的標(biāo)本加入微孔板，每孔100μL。

3.**孵育**：37℃孵育30分鐘，封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。

4.**加酶標(biāo)抗體**：加入特異性酶標(biāo)抗體，37℃孵育30分鐘。

5.**顯色**：加入底物溶液，避光反應(yīng)10-20分鐘。

6.**終止**：加入終止液，混勻后酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值。

（二）ELISA法

1.**板孔封閉**：加入封閉液，37℃封閉1小時(shí)。

2.**加標(biāo)本**：每孔加入100μL標(biāo)本，37℃孵育1小時(shí)。

3.**洗滌**：用洗滌液洗滌3次，拍干。

4.**加酶標(biāo)抗體**：37℃孵育30分鐘。

5.**顯色與終止**：同免疫熒光法步驟。

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###五、質(zhì)量控制

（一）室內(nèi)質(zhì)控

1.每日檢測(cè)1份質(zhì)控品，結(jié)果應(yīng)處于允許范圍內(nèi)（如CV≤10%）。

2.每周進(jìn)行一次空白對(duì)照和陰性對(duì)照檢測(cè)。

（二）室間質(zhì)評(píng)

1.參加第三方機(jī)構(gòu)提供的免疫學(xué)檢測(cè)質(zhì)評(píng)項(xiàng)目。

2.定期評(píng)估檢測(cè)結(jié)果與參考值的偏差，及時(shí)調(diào)整操作流程。

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###六、結(jié)果判讀與報(bào)告

（一）結(jié)果判讀

1.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本濃度，與cut-off值比較判斷陽(yáng)性或陰性。

2.陽(yáng)性樣本需進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，確認(rèn)結(jié)果一致性。

（二）報(bào)告規(guī)范

1.報(bào)告格式：項(xiàng)目名稱(chēng)、樣本編號(hào)、檢測(cè)結(jié)果（陽(yáng)性/陰性）、參考范圍。

2.異常結(jié)果需注明稀釋倍數(shù)及單位（如ng/mL）。

（三）注意事項(xiàng)

1.高危樣本（如結(jié)核分枝桿菌）需進(jìn)行特殊處理，并標(biāo)注潛在風(fēng)險(xiǎn)。

2.結(jié)果報(bào)告需由授權(quán)人員審核簽字。

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###七、安全與廢棄物處理

（一）操作安全

1.佩戴防護(hù)用品（手套、口罩、實(shí)驗(yàn)服）。

2.避免標(biāo)本交叉污染，使用一次性吸頭和移液器。

（二）廢棄物處理

1.化學(xué)試劑按規(guī)范分類(lèi)存放，避免混放。

2.廢棄標(biāo)本和試劑需高溫高壓滅菌后統(tǒng)一處理。

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###一、概述

免疫學(xué)細(xì)菌檢測(cè)是一種利用抗原-抗體反應(yīng)原理，對(duì)細(xì)菌感染進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的診斷方法。本規(guī)范旨在明確免疫學(xué)細(xì)菌檢測(cè)的操作流程、質(zhì)量控制要點(diǎn)及結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)，確保檢測(cè)結(jié)果的可靠性和一致性。主要涵蓋標(biāo)本采集、試劑準(zhǔn)備、操作步驟、質(zhì)量控制及結(jié)果報(bào)告等環(huán)節(jié)。

免疫學(xué)細(xì)菌檢測(cè)方法多樣，包括但不限于免疫熒光法（IF）、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）、膠體金免疫層析法（GICA）等。不同方法適用于不同場(chǎng)景和樣本類(lèi)型。本規(guī)范以ELISA和GICA為代表的固相免疫吸附法為主進(jìn)行闡述，同時(shí)兼顧其他方法的共性要求。

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###二、標(biāo)本采集與處理

（一）標(biāo)本類(lèi)型

1.**血液**：適用于敗血癥、菌血癥、心內(nèi)膜炎等全身性細(xì)菌感染的檢測(cè)。建議采集靜脈血，對(duì)于新生兒或危重患者，可根據(jù)情況選擇動(dòng)脈血或毛細(xì)血管血，但需注意采血量和抗凝方式可能影響結(jié)果。

2.**尿液**：適用于尿路感染（如膀胱炎、腎盂腎炎）、前列腺炎等泌尿系統(tǒng)感染的檢測(cè)。推薦采集中段尿，避免污染。對(duì)于無(wú)法自行排尿者，需嚴(yán)格無(wú)菌操作下進(jìn)行導(dǎo)尿或留取膀胱穿刺尿。

3.**痰液**：適用于社區(qū)獲得性肺炎、醫(yī)院獲得性肺炎等呼吸道感染的檢測(cè)。指導(dǎo)患者深咳，收集深部痰液，避免唾液和上呼吸道分泌物污染。對(duì)于無(wú)力咳痰者，可經(jīng)纖支鏡或高流量吸痰器采集。

4.**膿液/病灶分泌物**：適用于皮膚軟組織感染（如膿腫、蜂窩織炎）、骨髓炎、腦膜炎等局部感染。用無(wú)菌棉簽蘸取膿液，或?qū)\表病灶進(jìn)行無(wú)菌針頭抽吸。深部病灶需在影像學(xué)引導(dǎo)下采集。

5.**腦脊液（CSF）**：適用于細(xì)菌性腦膜炎的檢測(cè)。需嚴(yán)格無(wú)菌操作下進(jìn)行腰椎穿刺，留取足夠量的腦脊液（通常3-5mL）。

6.**糞便**：在某些腸道細(xì)菌感染（如沙門(mén)氏菌、志賀氏菌）的檢測(cè)中可能使用，但需注意免疫學(xué)方法對(duì)糞便中細(xì)菌抗原的檢出率可能受食物殘?jiān)?、消化酶等因素影響，必要時(shí)結(jié)合培養(yǎng)法。

（二）標(biāo)本采集要點(diǎn)

1.**無(wú)菌操作**：所有操作必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌原則，使用無(wú)菌采集容器和工具，防止外源性細(xì)菌污染。操作前后徹底洗手或手消毒。

2.**適量采集**：根據(jù)檢測(cè)方法和樣本類(lèi)型，采集足量標(biāo)本。例如，血液檢測(cè)通常需5-10mL，尿液需5-10mL，痰液需足夠覆蓋痰液層的標(biāo)本量（約1-2mL），膿液需1-2mL，腦脊液需3-5mL。標(biāo)本量不足可能影響檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性。

3.**及時(shí)送檢**：標(biāo)本采集后應(yīng)盡快送檢。大部分標(biāo)本需在2小時(shí)內(nèi)完成檢測(cè)，若無(wú)法及時(shí)檢測(cè)，應(yīng)按照試劑盒要求進(jìn)行冷藏（通常2-8℃）或冷凍（需注明解凍順序），并記錄保存溫度和時(shí)間。避免反復(fù)凍融。

4.**標(biāo)識(shí)清晰**：標(biāo)本容器必須貼有清晰、完整的標(biāo)識(shí)，包括樣本類(lèi)型、患者信息（姓名、ID號(hào)）、采集時(shí)間、采集人員等。

5.**禁止使用防腐劑**：除非特殊說(shuō)明，采集的標(biāo)本中不得加入任何防腐劑或抗凝劑，這些物質(zhì)可能干擾檢測(cè)結(jié)果。

（三）標(biāo)本處理

1.**血液**：

-抗凝：若使用血漿，需使用合適的抗凝管（如EDTA、肝素或檸檬酸鈉，具體依檢測(cè)要求而定），充分混勻。若使用血清，需采集全血后室溫靜置30-60分鐘，待血液完全凝固后3000-4000rpm離心10分鐘，小心分離血清，避免溶血。

-處理：若檢測(cè)的是血漿，可直接使用；若檢測(cè)血清，需取上清。對(duì)于高脂血癥或黃疸樣本，可能需要進(jìn)行去脂或去黃疸處理（如用乙酸乙酯萃?。?。

2.**尿液**：

-離心：取5mL尿液樣本，以3000rpm離心5分鐘，棄去上清，取沉淀物（白細(xì)胞等）進(jìn)行檢測(cè)。若檢測(cè)的是尿沉渣中的細(xì)菌抗原，此步驟至關(guān)重要。若檢測(cè)尿液中的可溶性抗原，可取上清液。

-處理：沉淀物應(yīng)立即加入適量樣本稀釋液（如pH7.4PBS緩沖液）懸浮，或直接加入ELISA板孔中。

3.**痰液**：

-涂片鏡檢：取少量痰液涂片，進(jìn)行革蘭染色或抗酸染色，觀察有無(wú)細(xì)菌及分類(lèi)，有助于初步判斷和優(yōu)化后續(xù)免疫學(xué)檢測(cè)。

-處理：剩余痰液加入1-2mL生理鹽水或?qū)Ｓ孟♂屢海浞终袷幓靹蛑瞥商祽乙?。必要時(shí)可通過(guò)離心沉淀去除大顆粒雜質(zhì)。

4.**膿液/病灶分泌物**：

-直接使用：對(duì)于GICA等快速檢測(cè)，可直接將膿液或分泌物點(diǎn)在檢測(cè)條上。對(duì)于ELISA，需用無(wú)菌吸管吸取適量樣本，加入稀釋液制成均勻懸液。

-排除壞死組織：盡量收集富含細(xì)菌的液體部分，避開(kāi)壞死組織。

5.**腦脊液**：

-直接使用：CSF通常無(wú)需特殊處理，可直接加入檢測(cè)反應(yīng)體系中。注意避免氣泡干擾。

-蛋白質(zhì)含量：若CSF蛋白含量過(guò)高（通常>100mg/dL），可能影響某些檢測(cè)方法的線性范圍，必要時(shí)可進(jìn)行適當(dāng)稀釋?zhuān)ㄐ枳⒚飨♂尡稊?shù)）。

6.**糞便**（若適用）：

-取樣：取粘液狀或膿血部分，避免糞便表面contamination。約1-2g糞便樣品。

-處理：稱(chēng)取糞便樣品，加入適量生理鹽水或緩沖液（如含0.1%吐溫-80的PBS），充分研磨勻漿。若檢測(cè)包涵體或細(xì)胞內(nèi)抗原，可能需要加入裂解液處理。

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###三、試劑準(zhǔn)備與校準(zhǔn)

（一）試劑類(lèi)型

1.**試劑盒**：

-**ELISA試劑盒**：通常包含預(yù)包被抗體微孔板、標(biāo)準(zhǔn)品（已知濃度）、酶標(biāo)抗體（二抗或檢測(cè)抗體）、底物溶液（如TMB）、終止液（硫酸或鹽酸）。

-**GICA試劑盒**：通常為即用型檢測(cè)條，包含硝酸纖維素膜、金標(biāo)抗體、樣本墊、質(zhì)控線（T線、C線）。

-**其他**：可能還需輔助試劑，如洗滌液（ELISA）、稀釋液（痰液、糞便等樣本）、封閉液（ELISA）、抗體稀釋液等。

2.**標(biāo)準(zhǔn)品**：高純度、高回收率的細(xì)菌抗原或抗體標(biāo)準(zhǔn)品，用于建立檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，是保證結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵。需在有效期內(nèi)使用，并妥善保存（通常2-8℃）。

3.**質(zhì)控品**：水平定值的質(zhì)控品（低、中、高），用于日常運(yùn)行監(jiān)控和室內(nèi)質(zhì)控。質(zhì)控品應(yīng)與樣本同條件檢測(cè)。

（二）試劑檢查

1.**包裝與外觀**：檢查試劑盒包裝是否完好無(wú)損，有無(wú)破損、泄漏。檢查試劑瓶有無(wú)裂紋，溶液顏色、透明度是否正常，有無(wú)沉淀或異物。開(kāi)封后的試劑是否在說(shuō)明書(shū)規(guī)定的有效期內(nèi)使用。

2.**有效期**：核對(duì)試劑盒和標(biāo)準(zhǔn)品的生產(chǎn)日期、有效期。過(guò)期試劑嚴(yán)禁使用。

3.**儲(chǔ)存條件**：確認(rèn)試劑的儲(chǔ)存條件是否正確（如2-8℃、-20℃等），并檢查儲(chǔ)存是否合規(guī)。

4.**標(biāo)簽信息**：確認(rèn)試劑名稱(chēng)、批號(hào)、生產(chǎn)單位等信息是否清晰、準(zhǔn)確。

5.**溶解與復(fù)溶**：對(duì)于凍干試劑，需按說(shuō)明書(shū)要求用無(wú)菌水或指定緩沖液溶解，充分混勻，避免氣泡。復(fù)溶后的試劑需在規(guī)定時(shí)間內(nèi)使用，并在新包裝上注明復(fù)溶日期。

（三）校準(zhǔn)步驟（以ELISA為例）

1.**標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制**：

a.取出標(biāo)準(zhǔn)品，在室溫下平衡15-30分鐘。

b.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度和試劑盒說(shuō)明，設(shè)置不同濃度梯度（通常設(shè)6-7個(gè)濃度點(diǎn)，包含零標(biāo)準(zhǔn)）。

c.將標(biāo)準(zhǔn)品按梯度加入已包被的ELISA板孔中，每孔100-200μL，設(shè)置空白孔（加樣本稀釋液）。

d.置于濕盒中，按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行封閉（通常37℃，1小時(shí)）。

e.棄封閉液，用洗滌液洗滌板孔（通常洗滌5-6次，每次3分鐘，吸水拍干或使用洗板機(jī)）。

f.加入酶標(biāo)抗體，37℃孵育30分鐘。

g.棄酶標(biāo)抗體，同法洗滌。

h.加入底物溶液，避光反應(yīng)（如TMB顯色，通常10-30分鐘，時(shí)間依說(shuō)明書(shū)和顏色深淺調(diào)整）。

i.加入終止液，終止反應(yīng)（如加入硫酸，顏色由藍(lán)變黃）。

j.使用酶標(biāo)儀在指定波長(zhǎng)（如450nm）測(cè)定各孔吸光度值（OD值）。

k.以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。選擇線性關(guān)系最好的部分（R2應(yīng)≥0.99）進(jìn)行擬合，得到線性回歸方程（y=mx+b）。

2.**校準(zhǔn)驗(yàn)證**：

a.檢查標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍是否滿足實(shí)際樣本濃度要求。

b.計(jì)算曲線斜率（m）和截距（b），評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)曲線的靈敏度。

c.若R2值不達(dá)標(biāo)，需重新校準(zhǔn)或檢查試劑、操作是否存在問(wèn)題。

3.**GICA校準(zhǔn)**：GICA通常使用內(nèi)置的質(zhì)控線（C線）進(jìn)行定性或半定量校準(zhǔn)。C線陽(yáng)性表示檢測(cè)系統(tǒng)工作正常。若C線不顯色，則表明試劑無(wú)效或操作不當(dāng)。定量GICA可能需要使用標(biāo)準(zhǔn)品制作校準(zhǔn)曲線。

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###四、操作步驟

（一）免疫熒光法（IF）

1.****標(biāo)本制備****：

(1)血液/組織樣本：制備細(xì)胞懸液或組織切片（如冰凍切片）。

(2)尿液/膿液等：直接使用或適當(dāng)稀釋。

2.****固定****：

(1)將標(biāo)本滴加在載玻片上，室溫晾干或37℃干燥5-10分鐘。

(2)用固定液（如冷丙酮、甲醇或含福爾馬林的固定液）固定5-10分鐘，固定液需預(yù)冷或新鮮配制。

(3)吸去固定液，空氣干燥。

3.****封閉****：

(1)滴加封閉液（如5%BSA或脫脂奶粉溶液），37℃孵育30分鐘，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。

(2)吸去封閉液，用PBS或TBS緩沖液洗滌3次，每次5分鐘。

4.****加一抗****：

(1)滴加特異性第一抗體（針對(duì)細(xì)菌抗原），37℃孵育30-60分鐘。

(2)若檢測(cè)溫度敏感抗體，可置4℃過(guò)夜孵育。

5.****洗滌****：

(1)用洗滌緩沖液（含0.05%Tween-20的PBS/TBS）洗滌3-5次，每次5分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。

6.****加二抗****：

(1)滴加親和素標(biāo)記的二抗（若一抗為動(dòng)物源性）或生物素標(biāo)記的二抗（若一抗為人源性，需先加親和素/生物素）。

(2)37℃孵育30分鐘。

7.****洗滌****：同步驟5。

8.****顯色/熒光檢測(cè)****：

(1)**熒光素標(biāo)記**：滴加熒光標(biāo)記劑（如異硫氰酸熒光素FITC、藻紅蛋白PE），避光孵育10-20分鐘。

(2)**酶標(biāo)記**：滴加酶底物溶液（如DAB或AEC），室溫顯色5-10分鐘，觀察顏色變化。

(3)**直接熒光標(biāo)記**：若二抗已帶熒光素，則直接洗滌后用熒光顯微鏡觀察。

9.****終止與觀察****：

(1)熒光法：蓋上蓋玻片，置于熒光顯微鏡下，調(diào)節(jié)光源和濾光片，觀察熒光信號(hào)（通常用DAPI復(fù)染細(xì)胞核）。

(2)酶標(biāo)法：用蒸餾水或PBS洗滌終止顯色，顯微鏡下觀察顏色陽(yáng)性細(xì)胞或部位。

（二）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）

1.****板孔準(zhǔn)備****：

(1)從冰箱中取出包被板，室溫平衡15-30分鐘。

(2)若板孔內(nèi)殘留液體，可吸去或用吸水紙吸干。

2.****加樣本/標(biāo)準(zhǔn)品****：

(1)按照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制或試劑盒說(shuō)明，設(shè)置空白孔、陰性對(duì)照孔、陽(yáng)性對(duì)照孔及樣本孔。

(2)每孔加入100-200μL樣本稀釋液或標(biāo)準(zhǔn)品，輕輕晃動(dòng)板架混勻，室溫孵育1-2小時(shí)。

3.****洗滌****：

(1)棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液（含0.05%Tween-20）洗滌5-6次，每次3分鐘。

(2)洗滌后用吸水紙拍干板底，或使用洗板機(jī)吸除液體。

(3)注意避免吸干，保持微濕。

4.****加酶標(biāo)抗體****：

(1)按說(shuō)明加入酶標(biāo)抗體，每孔100-200μL，輕輕混勻，37℃孵育30分鐘。

5.****再次洗滌****：同步驟3。

6.****加底物****：

(1)棄去洗滌液，加入新鮮配制的底物溶液（如TMB），每孔100-200μL。

(2)避光反應(yīng)，時(shí)間依說(shuō)明書(shū)和顏色變化調(diào)整（如10-30分鐘）。

7.****終止反應(yīng)****：

(1)加入終止液（如2MH?SO?），每孔100-200μL，混勻。

(2)顏色由藍(lán)變黃。

8.****酶標(biāo)儀檢測(cè)****：

(1)立即使用酶標(biāo)儀在指定波長(zhǎng)下測(cè)定各孔OD值（如450nm，參考波長(zhǎng)600-630nm）。

(2)記錄數(shù)據(jù)，確保OD值在檢測(cè)范圍內(nèi)。

（三）膠體金免疫層析法（GICA）

1.****樣本準(zhǔn)備****：

(1)將樣本用稀釋液按說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行稀釋?zhuān)ㄈ缒蛞簶颖局苯邮褂?，血液需用?zhuān)用稀釋液）。

(2)充分混勻樣本。

2.****加樣**：

(1)將樣本用吸管垂直滴加到檢測(cè)條的樣本孔（SampleWell）中，注意滴加量需在說(shuō)明書(shū)要求的范圍內(nèi)（如2-3滴，約100-200μL），避免溢出。

3.****反應(yīng)與顯色**：

(1)將檢測(cè)條平放，用吸管吸少量樣本稀釋液（若有）滴加在質(zhì)控線（C線）外側(cè)，以啟動(dòng)反應(yīng)。

(2)放置在室溫（通常15-30℃）下反應(yīng)，等待結(jié)果出現(xiàn)。

(3)時(shí)間依說(shuō)明書(shū)而定（如10-15分鐘）。

4.****結(jié)果判讀**：

(1)觀察檢測(cè)線（T線）和質(zhì)控線（C線）是否顯色。

(2)**陽(yáng)性**：T線和C線均顯色。

(3)**陰性**：僅C線顯色，T線不顯色。

(4)**無(wú)效**：C線不顯色（無(wú)論T線是否顯色），提示試劑或操作無(wú)效，需重新檢測(cè)。

5.****記錄**：**記錄樣本編號(hào)和結(jié)果（陽(yáng)性/陰性/無(wú)效）。

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###五、質(zhì)量控制

（一）室內(nèi)質(zhì)控（IQC）

1.****質(zhì)控頻率****：每日檢測(cè)至少一份定值質(zhì)控品，每周進(jìn)行一次高、中、低三個(gè)水平質(zhì)控品的檢測(cè)。

2.****質(zhì)控范圍**：質(zhì)控結(jié)果應(yīng)在試劑盒說(shuō)明書(shū)規(guī)定的允許范圍內(nèi)（通常以均值±標(biāo)準(zhǔn)差或固定閾值表示）。若質(zhì)控值超出范圍，必須查找原因并糾正后方可繼續(xù)檢測(cè)。

3.****質(zhì)控項(xiàng)目**：

-**ELISA**：檢測(cè)線性范圍、靈敏度（低濃度點(diǎn)）、重復(fù)性（同一樣本多次檢測(cè)CV值）。可使用質(zhì)控圖（如Levey-Jennings圖）監(jiān)控趨勢(shì)。

-**GICA**：主要觀察質(zhì)控線（C線）是否穩(wěn)定顯色。

4.****失控處理**：質(zhì)控失控時(shí)，應(yīng)立即停止檢測(cè)，檢查試劑、儀器、操作流程等，問(wèn)題解決并重新驗(yàn)證后，方可重新開(kāi)始檢測(cè)，并對(duì)受影響樣本進(jìn)行重新檢測(cè)或標(biāo)記。

（二）室間質(zhì)評(píng)（EQA）

1.****參加計(jì)劃**：定期參加由第三方機(jī)構(gòu)（如臨檢中心、廠商等）組織的免疫學(xué)細(xì)菌檢測(cè)室間質(zhì)評(píng)計(jì)劃。

2.****樣本處理與檢測(cè)**：按照質(zhì)評(píng)計(jì)劃要求處理樣本并完成檢測(cè)。

3.****結(jié)果上報(bào)與反饋**：按時(shí)上報(bào)檢測(cè)結(jié)果，分析偏差原因，參與能力評(píng)估和結(jié)果反