ICS65.020

CCSB05

3715

聊城市地方標(biāo)準(zhǔn)

DB3715/T41—2023

羊肚菌液體菌種制備技術(shù)規(guī)程

2023-10-7發(fā)布2023-11-7實(shí)施

聊城市市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布

DB3715/T41—2023

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別這些專利的責(zé)任。

本文件由聊城市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局提出、組織實(shí)施并歸口。

本文件起草單位：聊城市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心、莘縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村綜合服務(wù)中心、聊城市東昌府區(qū)農(nóng)

業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心、聊城市農(nóng)業(yè)科學(xué)院、臨清市青年路街道辦事處農(nóng)技站、陽谷縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)

中心、山東蒙恩現(xiàn)代有限公司。

本文件主要起草人：李莉、劉芳、吳懷英、宋凌云、王澤奇、姜新、張靜、楊紅燕、申銅飛、劉晶、

張素芳、王遠(yuǎn)亮、趙岑、何小春、蘇靜、王鳳改、王光勇、付成龍。

I

DB3715/T41—2023

羊肚菌液體菌種制備技術(shù)規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了羊肚菌液體菌種制備的術(shù)語和定義、生產(chǎn)要求、生產(chǎn)技術(shù)和檔案管理等要求。

本文件適用于羊肚菌液體菌種的制備。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB150壓力容器

GB5749生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)

GB50073潔凈廠房設(shè)計(jì)規(guī)范

NY/T528食用菌菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程

NY/T1935食用菌栽培基質(zhì)質(zhì)量安全要求

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

液體菌種發(fā)酵罐liquidstrainfermentationtank

食用菌液體菌種培養(yǎng)的專用發(fā)酵設(shè)備，設(shè)備應(yīng)符合GB150要求。

3.2

接種搶inoculationgun

將液體菌種按無菌操作要求由發(fā)酵罐接種到固體培養(yǎng)機(jī)物料上的工具。

4生產(chǎn)要求

4.1人員要求

工作人員應(yīng)該保持個(gè)人衛(wèi)生，進(jìn)液體菌種發(fā)酵車間必須穿戴經(jīng)滅菌處理的工作服、口罩、鞋、帽。

4.2產(chǎn)地環(huán)境要求

4.2.1場(chǎng)所要求

生產(chǎn)場(chǎng)所應(yīng)場(chǎng)地開闊、路面硬化、衛(wèi)生清潔，符合NY/T528的環(huán)境衛(wèi)生要求，水源水質(zhì)符合GB5749

要求。

4.2.2廠房要求

1

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廠房設(shè)計(jì)應(yīng)符合NY/T528要求，發(fā)酵罐菌種培養(yǎng)室應(yīng)符合GB50073要求。冷卻區(qū)應(yīng)衛(wèi)生干凈、接

種區(qū)應(yīng)正壓無菌、培養(yǎng)室應(yīng)能控溫、通風(fēng)。

4.3生產(chǎn)設(shè)備與設(shè)施

4.3.1生產(chǎn)設(shè)備與用具

磅秤、天平、高壓蒸汽滅菌鍋、發(fā)酵罐、水凈化處理設(shè)備、恒溫?fù)u床、超凈工作臺(tái)、調(diào)溫設(shè)備、除

濕設(shè)備、恒溫培養(yǎng)箱、冰箱、顯微鏡等及常規(guī)用具。壓力容器，應(yīng)經(jīng)政府有關(guān)部門檢驗(yàn)合格，符合GB150

要求。應(yīng)具有備用電源。

4.3.2基本設(shè)施

發(fā)酵罐菌種培養(yǎng)室應(yīng)有調(diào)溫、通風(fēng)設(shè)施，空間潔凈度應(yīng)達(dá)到百級(jí)。菌種檢驗(yàn)室有相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)設(shè)

備、制種用的滅菌設(shè)施和常規(guī)用具。

5生產(chǎn)技術(shù)

5.1工藝流程

母種制備→搖瓶液體菌種制備→發(fā)酵罐液體菌種生產(chǎn)→放罐接種

5.2母種制備

母種制備應(yīng)符合NY/T528的規(guī)定。

5.3搖瓶液體菌種制備

5.3.1培養(yǎng)基制備

培養(yǎng)基按下列配方配制，豆粕0.5%，葡萄糖2%，磷酸二氫鉀0.3%，硫酸鎂0.15%，原料應(yīng)符合

NY/T1935的規(guī)定。取定量的純水放入燒杯，煮沸后將上述原料按比例依次倒入燒杯中完全溶解,制成

培養(yǎng)液，冷卻備用。

5.3.2搖瓶裝液量

采用1000mL三角瓶，裝液量為500mL用紗布和牛皮紙封口。

5.3.3滅菌

采用高溫高壓滅菌，在121℃，壓力約1.5g/m2條件下保持30min。

5.3.4接種

培養(yǎng)基冷卻至常溫，在無菌條件下將3～4塊2cm3的母種菌塊接入搖瓶?jī)?nèi)。

5.3.5培養(yǎng)

靜置48h后置于恒溫?fù)u床，24℃～25℃、140r/min～160r/min，培養(yǎng)4d～6d。搖瓶液體菌種培

養(yǎng)液應(yīng)澄清透明，無雜菌、無異味；鏡檢無雜菌、菌絲淺白色且色澤均勻、形態(tài)正常；菌絲球密度達(dá)

70%～80%，菌絲球較小且均勻（菌球直徑小于0.5cm），菌絲體生物量大于8g/L，均勻懸浮于液體培

養(yǎng)基中，不分層。

5.3.6貯存

2

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搖瓶液體菌種若不能及時(shí)使用，可在0℃～4℃度低溫保藏不超過10d。

5.4發(fā)酵罐液體菌種生產(chǎn)

5.4.1雜菌檢測(cè)

接種前2d應(yīng)對(duì)搖瓶液體菌種進(jìn)行檢測(cè)，用注射器吸取少量菌液注射到培養(yǎng)基斜面上，36℃培養(yǎng)

24h，觀察有無雜菌。

5.4.2罐體清洗及注水

生產(chǎn)前，嚴(yán)格檢測(cè)罐體：內(nèi)檢與外檢，及時(shí)排查問題，確保安全生產(chǎn)。檢查后，罐體注入純凈水，

把各閥口套上保護(hù)套并緊牢固；打開各閥口用水沖洗干凈，沖洗好后關(guān)閉閥門注入純凈水，液位與過濾

器下沿齊平。

5.4.3投料

磨細(xì)玉米面4g/L，磨細(xì)豆粉5.6g/L，全麥粉1.25g/L，白糖5g/L，葡萄糖6.25g/L，磷酸二氫

鉀0.325g/L，硫酸鎂0.19g/L，0.15mL/L。按照配方要求稱取相應(yīng)重量的原料，倒入拌料桶中，加注

純凈水?dāng)嚢柚翢o顆粒，倒入罐內(nèi)，最后加入消泡劑。

5.4.4封罐滅菌

用潔凈的濕毛巾把罐口擦干凈，蓋上罐蓋，對(duì)角擰緊螺栓，半分位打開上排氣閥和接種閥排凈罐內(nèi)

空氣，然后關(guān)閉閥門。打開蒸汽閥門對(duì)培養(yǎng)液加熱，然后打開進(jìn)氣閥進(jìn)氣攪拌，蒸汽壓力由小到大，蒸

氣壓力介于0.2Mpa～0.3Mpa。當(dāng)溫度達(dá)到100℃時(shí)，關(guān)閉進(jìn)氣閥。持續(xù)加熱到罐內(nèi)溫度升到124℃～

126℃，調(diào)節(jié)排氣閥，控壓在0.14Mpa～0.15Mpa之間，恒溫維持60min，關(guān)閉所有閥門(由外向內(nèi)關(guān))，

滅菌完成。

5.4.5冷卻

打開冷卻水管開關(guān)對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行降溫；當(dāng)罐壓達(dá)到0.05Mpa～0.07Mpa時(shí)，此時(shí)可以打開進(jìn)氣閥通

氣攪拌，罐內(nèi)溫度降到28℃以下時(shí)，關(guān)閉冷水管、進(jìn)氣和排氣閥，罐體壓力保持0.05Mpa。

5.4.6接種前準(zhǔn)備

將排氣閥開到最大排氣，將火焰封口托板固定在接種口下方并放置酒精浸濕的脫脂棉，松開保護(hù)套

卡環(huán)并向外拔出約1cm，當(dāng)排氣閥有微弱氣體排出時(shí)，關(guān)閉排氣閥，準(zhǔn)備接種。

5.4.7接種與培養(yǎng)

5.4.7.1接種量

接種比例為1：800。

5.4.7.2殺菌消毒

用酒精棉擦拭接種搖瓶軟管，點(diǎn)燃托板上的脫脂棉對(duì)接種口和搖瓶軟管口進(jìn)行火焰消毒并火焰封口。

5.4.7.3接種

迅速拔下保護(hù)套和搖瓶軟管口的棉塞，將軟管插入接種口，撤掉火焰及托板，用卡環(huán)箍緊軟管和接

種口。緩慢打開接種口排氣閥門排出罐體和軟管內(nèi)少量氣體后，按住搖瓶口的硅膠塞，高舉并傾斜搖瓶，

3

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緩捏軟管使菌液流入罐內(nèi)，完畢后用干凈的脫脂棉對(duì)接種口內(nèi)壁清理，關(guān)閉接種口閥門。

5.4.7.4培養(yǎng)

打開進(jìn)氣和排氣閥，對(duì)接種后的培養(yǎng)基進(jìn)行攪拌并將壓力保持在0.01Mpa，溫度控制在15℃～18℃

培養(yǎng)。再培養(yǎng)2d～3d即可接種，培養(yǎng)的后3d，因菌液粘稠，菌絲量增加，宜適當(dāng)加大通氣量攪拌。

5.4.7.5雜菌檢測(cè)

第4d進(jìn)行取樣檢測(cè)，先進(jìn)行排液，開閥門順序?yàn)橛蓛?nèi)向外，排液后，閥門關(guān)閉由外向內(nèi)。取樣時(shí)，

點(diǎn)燃托板上的脫脂棉對(duì)取樣口火焰封口。取樣完后用干凈的脫脂棉對(duì)取樣口內(nèi)壁清理。樣品在36℃培

養(yǎng)24h，無雜菌出現(xiàn)。

5.5放罐接種

5.5.1菌包培養(yǎng)料準(zhǔn)備

60%的麥粒，煮熟煮透無白芯；40%玉米芯，玉米芯顆粒大小在0.8cm～1cm，玉米芯泡透。將煮

熟的麥粒用其干重1.5%的輕質(zhì)碳酸鈣和5‰磷酸二氫鉀拌勻，浸泡過的玉米芯用其干重2%的輕質(zhì)碳

酸鈣拌勻，再將二者拌勻，含水量以60%～65%為宜。用生石灰調(diào)pH值到10～11之間。

5.5.2裝袋

5.5.2.1包裝規(guī)格

采用17cm×36cm×0.5cm聚丙烯袋包裝。

5.5.2.2菌包重量

每包重0.8kg左右。

5.5.2.3封口

套環(huán)+扣蓋。

5.5.3菌袋消毒滅菌

菌種袋采用高溫高壓消毒。將待接種的菌袋放入滅菌柜，抽真空兩次，階梯升溫，升溫到105℃保

持60min，升溫到115℃保持30min，升溫到121℃，達(dá)到滅菌溫度保持200min，再燜置30min。

5.5.4接種環(huán)境

應(yīng)符合GB50073要求。

5.5.5液體菌種接種器消毒

接種槍用酒精燈火焰消毒后使用。

5.5.6接種

接種時(shí)三人一組，兩人啟菌袋扣蓋，一人接種。接種罐體壓力為0.08Mpa(送氣壓力為0.1Mpa，排

氣閥微開)，霧化好，菌絲生長(zhǎng)快，接種量每包20mL～30mL，每接種120包，接種槍火焰消毒1次。

5.5.7培養(yǎng)

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培養(yǎng)溫度為13℃～15℃，15d左右長(zhǎng)滿菌袋。

5.5.8貯存

5℃～8℃條件下可保存20d。

6檔案管理

應(yīng)建立羊肚菌液體菌種生產(chǎn)記錄（見附錄A），定期由技術(shù)主管重核，簽字后歸檔保存，生產(chǎn)記錄

檔案應(yīng)保留至本批次菌種栽培出菇為止。

5

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A

A

附錄A

（資料性）

羊肚菌液體菌種生產(chǎn)記錄

羊肚菌液體菌種生產(chǎn)應(yīng)按表A.1記錄。

表A.1羊肚菌液體菌種生產(chǎn)記錄表

生產(chǎn)單位負(fù)責(zé)人

生產(chǎn)時(shí)間生產(chǎn)數(shù)量

具體操作記錄

日期生產(chǎn)活動(dòng)內(nèi)容投入品和使用量使用設(shè)備操作人技術(shù)負(fù)責(zé)人