基于多維度分析的黃芪六一湯抗2型糖尿病腎病藥效組分篩選及作用機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義近年來，隨著人們生活方式的改變以及老齡化進(jìn)程的加速，2型糖尿病的發(fā)病率呈現(xiàn)出顯著的上升趨勢，已成為全球性的公共衛(wèi)生問題。國際糖尿病聯(lián)盟（IDF）發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，全球糖尿病患者人數(shù)在不斷攀升，2021年已達(dá)5.37億，預(yù)計(jì)到2045年將增至7.83億。其中，2型糖尿病患者占比超過90%。而糖尿病腎?。―iabeticNephropathy，DN）作為2型糖尿病最為常見且嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，其患病率也居高不下。在我國，2型糖尿病患者中糖尿病腎病的患病率約為21.8%，意味著每5名2型糖尿病患者中就有超過1人可能受到糖尿病腎病的困擾。糖尿病腎病對患者的健康危害極大，它不僅會導(dǎo)致腎功能進(jìn)行性減退，引發(fā)蛋白尿、水腫、高血壓等一系列癥狀，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，還與心血管疾病風(fēng)險的增加密切相關(guān)，顯著縮短患者的壽命。據(jù)統(tǒng)計(jì)，糖尿病腎病患者發(fā)生心血管疾病的風(fēng)險是普通人群的3-5倍，約30%-40%的糖尿病腎病患者最終會發(fā)展為終末期腎?。‥nd-StageRenalDisease，ESRD），一旦進(jìn)展到ESRD階段，患者往往需要依賴透析或腎移植來維持生命，這不僅給患者帶來巨大的身心痛苦，也給家庭和社會造成了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)針對2型糖尿病腎病的治療主要包括嚴(yán)格控制血糖、血壓、血脂，以及使用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI）或血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（ARB）等藥物來延緩疾病進(jìn)展，但這些治療方法存在一定的局限性，且長期使用可能會帶來一些不良反應(yīng)。在這種背景下，中醫(yī)藥在治療2型糖尿病腎病方面展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢和潛力。中醫(yī)藥強(qiáng)調(diào)整體觀念和辨證論治，通過多靶點(diǎn)、多途徑的作用機(jī)制，不僅能夠改善患者的臨床癥狀，還能在一定程度上保護(hù)腎功能，延緩疾病進(jìn)展，且不良反應(yīng)相對較少。黃芪六一湯作為中醫(yī)經(jīng)典方劑，由黃芪和甘草兩味藥組成，具有益氣養(yǎng)陰、扶正固本等功效。在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，黃芪六一湯被廣泛應(yīng)用于治療各種虛證，近年來，越來越多的研究表明，黃芪六一湯在防治2型糖尿病腎病方面具有顯著的效果。其作用機(jī)制可能涉及調(diào)節(jié)糖脂代謝、抗炎、抗氧化、抑制腎纖維化等多個方面。然而，黃芪六一湯是一個復(fù)雜的體系，其化學(xué)成分眾多，不同成分之間可能存在協(xié)同或拮抗作用，目前對于黃芪六一湯中發(fā)揮抗2型糖尿病腎病作用的具體藥效組分尚不完全明確。因此，深入研究黃芪六一湯抗2型糖尿病腎病的藥效組分，不僅有助于揭示其作用機(jī)制，闡明中醫(yī)藥治療2型糖尿病腎病的科學(xué)內(nèi)涵，為臨床合理用藥提供理論依據(jù)；還能為新藥研發(fā)提供新思路和新靶點(diǎn)，開發(fā)出更高效、安全的治療藥物，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值，對于推動中醫(yī)藥現(xiàn)代化進(jìn)程也具有積極的促進(jìn)作用。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.12型糖尿病腎病的治療研究現(xiàn)狀在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，針對2型糖尿病腎病的治療手段不斷發(fā)展。嚴(yán)格控制血糖是延緩糖尿病腎病進(jìn)展的基礎(chǔ)，胰島素及各類口服降糖藥如二甲雙胍、磺脲類、格列奈類、α-葡萄糖苷酶抑制劑等被廣泛應(yīng)用。二甲雙胍通過提高胰島素敏感性、減少肝糖輸出等機(jī)制降低血糖，多項(xiàng)臨床研究表明，它在2型糖尿病患者的血糖控制中具有顯著效果，且對心血管具有一定的保護(hù)作用。然而，隨著病情進(jìn)展，單一降糖藥物往往難以達(dá)到理想的血糖控制目標(biāo)，聯(lián)合用藥成為常見的治療策略?？刂蒲獕簩τ谔悄虿∧I病患者同樣至關(guān)重要，ACEI和ARB類藥物是目前臨床治療的一線用藥。它們通過抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS），降低腎小球內(nèi)壓，減少蛋白尿，從而延緩腎功能惡化。大量臨床研究證實(shí)，ACEI類藥物卡托普利、依那普利，以及ARB類藥物氯沙坦、纈沙坦等，在降低糖尿病腎病患者血壓的同時，能夠有效減少尿蛋白排泄，保護(hù)腎功能。但部分患者使用這類藥物后可能出現(xiàn)干咳、低血壓、高鉀血癥等不良反應(yīng)。此外，調(diào)脂治療也不容忽視。他汀類藥物通過降低血脂，特別是低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平，減少脂質(zhì)在腎臟的沉積，減輕炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，對糖尿病腎病起到一定的保護(hù)作用。阿托伐他汀、瑞舒伐他汀等他汀類藥物在臨床中廣泛應(yīng)用，多項(xiàng)研究表明其能降低心血管事件風(fēng)險，對糖尿病腎病的進(jìn)展也有一定的延緩作用。近年來，新型降糖藥物如鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2抑制劑（SGLT2i）和胰高血糖素樣肽-1受體激動劑（GLP-1RA）的出現(xiàn)為2型糖尿病腎病的治療帶來了新的突破。SGLT2i通過抑制腎小管對葡萄糖的重吸收，促進(jìn)尿糖排泄來降低血糖，同時還具有降低血壓、減輕體重、減少心血管事件風(fēng)險等額外獲益。恩格列凈、達(dá)格列凈等SGLT2i藥物的多項(xiàng)大型臨床試驗(yàn)顯示，它們能夠顯著降低糖尿病腎病患者的蛋白尿水平，延緩腎功能下降速度。GLP-1RA則通過刺激胰島素分泌、抑制胰高血糖素分泌、延緩胃排空等多種機(jī)制降低血糖，還具有改善心血管功能、減輕體重等作用。利拉魯肽、司美格魯肽等GLP-1RA藥物在臨床研究中也展現(xiàn)出對糖尿病腎病的腎臟保護(hù)作用。1.2.2黃芪六一湯的研究現(xiàn)狀黃芪六一湯作為中醫(yī)經(jīng)典方劑，在中醫(yī)藥領(lǐng)域備受關(guān)注。古代醫(yī)籍中對黃芪六一湯的記載主要集中在其益氣扶正、補(bǔ)虛損的功效上，用于治療各種虛證。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對黃芪六一湯的研究逐漸深入到化學(xué)成分、藥理作用及臨床應(yīng)用等多個方面。在化學(xué)成分研究方面，黃芪主要含有黃芪皂苷、黃芪黃酮、黃芪多糖等成分。黃芪皂苷中的黃芪甲苷具有多種生物活性，如調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗炎等；黃芪黃酮具有抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)血脂等作用；黃芪多糖則具有免疫調(diào)節(jié)、降血糖、抗氧化等功效。甘草主要含有甘草酸、甘草黃酮、甘草多糖等成分。甘草酸具有抗炎、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫等作用；甘草黃酮具有抗氧化、抗炎、抗菌等活性；甘草多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化等功效。在藥理作用研究方面，黃芪六一湯被證實(shí)具有多種藥理活性。它能夠調(diào)節(jié)糖脂代謝，改善胰島素抵抗，降低血糖、血脂水平。一項(xiàng)動物實(shí)驗(yàn)研究表明，黃芪六一湯能夠降低2型糖尿病模型大鼠的空腹血糖、糖化血紅蛋白及血脂水平，提高胰島素敏感性，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路有關(guān)。黃芪六一湯還具有抗炎、抗氧化作用，能夠減輕腎臟炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷。在糖尿病腎病大鼠模型中，黃芪六一湯能夠降低炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）的表達(dá)，提高抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的活性，減少腎臟組織的氧化損傷。此外，黃芪六一湯還能抑制腎纖維化，減少細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，保護(hù)腎功能。研究發(fā)現(xiàn)，黃芪六一湯能夠下調(diào)腎纖維化相關(guān)蛋白如轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）、Ⅰ型膠原蛋白（ColⅠ）的表達(dá)，抑制腎纖維化的進(jìn)程。在臨床應(yīng)用方面，黃芪六一湯在2型糖尿病腎病的治療中取得了一定的療效。臨床研究表明，黃芪六一湯聯(lián)合常規(guī)西藥治療2型糖尿病腎病，能夠顯著降低患者的尿蛋白水平，改善腎功能，提高臨床療效。與單純使用西藥相比，聯(lián)合治療能更好地控制患者的血糖、血壓，減輕癥狀，提高生活質(zhì)量。1.2.3研究現(xiàn)狀分析盡管現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在2型糖尿病腎病的治療方面取得了顯著進(jìn)展，但仍存在諸多問題。目前的治療方法主要側(cè)重于控制血糖、血壓、血脂等指標(biāo)，雖然能在一定程度上延緩疾病進(jìn)展，但無法完全阻止糖尿病腎病的發(fā)展，部分患者最終仍會進(jìn)展為終末期腎病。而且，長期使用西藥可能會帶來一系列不良反應(yīng)，影響患者的依從性和生活質(zhì)量。此外，現(xiàn)有治療藥物的作用機(jī)制相對單一，難以針對糖尿病腎病復(fù)雜的病理生理過程進(jìn)行全面干預(yù)。對于黃芪六一湯的研究，雖然已經(jīng)取得了不少成果，但其抗2型糖尿病腎病的藥效組分尚未完全明確。目前的研究多集中在方劑整體的藥理作用和臨床療效上，對于方劑中具體化學(xué)成分在治療糖尿病腎病過程中的作用機(jī)制及相互關(guān)系研究較少。不同產(chǎn)地、炮制方法的黃芪和甘草，其化學(xué)成分的含量和活性可能存在差異，這也給藥效組分的研究帶來了一定的困難。同時，缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的研究方法和質(zhì)量控制體系，導(dǎo)致不同研究之間的結(jié)果可比性較差。因此，深入研究黃芪六一湯抗2型糖尿病腎病的藥效組分，對于揭示其作用機(jī)制、提高臨床療效、開發(fā)新藥具有重要的意義。1.3研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)1.3.1研究目的本研究旨在系統(tǒng)篩選黃芪六一湯抗2型糖尿病腎病的藥效組分，并深入揭示其作用機(jī)制，具體目標(biāo)如下：藥效組分篩選：運(yùn)用現(xiàn)代分離技術(shù)，如大孔吸附樹脂法、堿液萃取法、水提醇沉法等，對黃芪六一湯中的黃芪總皂苷、黃芪總黃酮、黃芪多糖及甘草酸、甘草總黃酮、甘草多糖等組分進(jìn)行提取和分離。通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，以2型糖尿病腎病動物模型和相關(guān)細(xì)胞模型為研究對象，觀察各組分對糖尿病腎病相關(guān)指標(biāo)的影響，如血糖、尿白蛋白、血肌酐、尿素氮、炎癥因子、氧化應(yīng)激指標(biāo)等，篩選出具有顯著抗2型糖尿病腎病作用的藥效組分。作用機(jī)制研究：基于篩選出的藥效組分，進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。從細(xì)胞和分子水平入手，研究藥效組分對2型糖尿病腎病相關(guān)信號通路的調(diào)控作用，如PI3K/Akt、MAPK、TGF-β1/Smad等信號通路。分析藥效組分對腎臟細(xì)胞增殖、凋亡、纖維化等生物學(xué)過程的影響，闡明其在改善腎功能、減輕腎臟損傷方面的作用機(jī)制。1.3.2創(chuàng)新點(diǎn)本研究在方法、視角、成果轉(zhuǎn)化等方面均有創(chuàng)新之處，有望為2型糖尿病腎病的治療提供新的思路和方法。研究方法創(chuàng)新：采用多學(xué)科交叉的研究方法，綜合運(yùn)用中藥學(xué)、藥理學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科的技術(shù)和手段，對黃芪六一湯進(jìn)行全面深入的研究。結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)的方法，構(gòu)建黃芪六一湯抗2型糖尿病腎病的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控模型，從整體層面揭示其多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的作用機(jī)制，彌補(bǔ)傳統(tǒng)研究方法的局限性。研究視角創(chuàng)新：突破以往對黃芪六一湯整體研究或單一成分研究的局限，從藥效組分的角度出發(fā)，研究方劑中不同成分之間的協(xié)同作用，更全面、準(zhǔn)確地揭示黃芪六一湯抗2型糖尿病腎病的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制。關(guān)注黃芪六一湯對2型糖尿病腎病發(fā)病過程中多個環(huán)節(jié)的干預(yù)作用，不僅研究其對血糖、尿蛋白等傳統(tǒng)指標(biāo)的影響，還深入探討其對炎癥、氧化應(yīng)激、腎纖維化等病理生理過程的調(diào)節(jié)作用，為中醫(yī)藥治療2型糖尿病腎病提供更深入的理論依據(jù)。成果轉(zhuǎn)化創(chuàng)新：研究成果有望為2型糖尿病腎病的臨床治療提供新的藥物選擇或輔助治療方案，提高臨床療效。篩選出的藥效組分可作為新藥研發(fā)的先導(dǎo)化合物，為開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗2型糖尿病腎病中藥新藥奠定基礎(chǔ)，推動中醫(yī)藥現(xiàn)代化和國際化進(jìn)程。二、2型糖尿病腎病概述2.1發(fā)病機(jī)制2型糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，是由多種因素共同作用的結(jié)果，目前尚未完全明確。高血糖作為糖尿病的主要特征，在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中起著核心作用。長期的高血糖狀態(tài)會導(dǎo)致腎臟局部糖代謝異常，使腎小球系膜細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞等攝取葡萄糖增加，進(jìn)而激活多元醇通路、蛋白激酶C（PKC）通路以及己糖胺通路。多元醇通路激活后，醛糖還原酶活性增強(qiáng)，將葡萄糖轉(zhuǎn)化為山梨醇，山梨醇在細(xì)胞內(nèi)大量積聚，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)滲透壓升高，引起細(xì)胞腫脹、損傷。PKC通路激活則會影響血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）等細(xì)胞因子的表達(dá)，導(dǎo)致腎小球基底膜增厚、系膜擴(kuò)張和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）積聚。己糖胺通路的激活會使葡萄糖代謝產(chǎn)物UDP-N-乙酰葡糖胺增加，促進(jìn)蛋白質(zhì)的O-糖基化修飾，影響細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)和基因表達(dá)。血流動力學(xué)改變也是糖尿病腎病發(fā)生的重要因素。高血糖會引起腎小球高灌注、高跨膜壓和高濾過，即所謂的“三高”狀態(tài)。高血糖導(dǎo)致血糖水平升高，使得腎小球?yàn)V過的葡萄糖增多，近端腎小管對葡萄糖的重吸收增加，從而產(chǎn)生球-管反饋失衡，入球小動脈擴(kuò)張，腎小球內(nèi)壓升高，導(dǎo)致腎小球高灌注和高濾過。長期的高灌注和高濾過會使腎小球系膜細(xì)胞增生、肥大，系膜基質(zhì)合成增加，導(dǎo)致腎小球硬化。同時，高血糖還會使血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）生成增加，AngⅡ具有強(qiáng)烈的縮血管作用，可進(jìn)一步升高腎小球內(nèi)壓，加重腎臟損傷。氧化應(yīng)激在糖尿病腎病的發(fā)病過程中也扮演著重要角色。高血糖狀態(tài)下，線粒體電子傳遞鏈產(chǎn)生過多的活性氧（ROS），如超氧陰離子、過氧化氫等。ROS的過度積累會導(dǎo)致氧化應(yīng)激，損傷細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和DNA，引發(fā)細(xì)胞凋亡和壞死。氧化應(yīng)激還會激活核因子-κB（NF-κB）等轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等的表達(dá)，加重腎臟炎癥反應(yīng)。此外，氧化應(yīng)激還會促進(jìn)腎纖維化相關(guān)因子如TGF-β1、結(jié)締組織生長因子（CTGF）等的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積，加速腎纖維化進(jìn)程。免疫炎癥因素在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮著重要作用。糖尿病患者體內(nèi)存在免疫功能紊亂，免疫系統(tǒng)被異常激活，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞浸潤和炎癥因子釋放。單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞在腎臟局部聚集，分泌TNF-α、IL-6、IL-1β等炎癥因子，這些炎癥因子會損傷腎臟細(xì)胞，促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞增生和細(xì)胞外基質(zhì)合成，導(dǎo)致腎臟炎癥和纖維化。此外，免疫復(fù)合物在腎小球內(nèi)沉積，激活補(bǔ)體系統(tǒng)，產(chǎn)生膜攻擊復(fù)合物，也會導(dǎo)致腎小球損傷。遺傳因素也參與了糖尿病腎病的發(fā)生。研究表明，遺傳易感性在糖尿病腎病的發(fā)病中起重要作用。不同個體對糖尿病腎病的易感性存在差異，某些基因的多態(tài)性與糖尿病腎病的發(fā)生風(fēng)險相關(guān)。如血管緊張素原基因、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶基因、醛固酮合成酶基因等的多態(tài)性，可能影響腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的功能，從而增加糖尿病腎病的發(fā)病風(fēng)險。此外，一些與糖代謝、脂代謝、炎癥反應(yīng)等相關(guān)的基因多態(tài)性也與糖尿病腎病的發(fā)生有關(guān)。2.2臨床癥狀與診斷標(biāo)準(zhǔn)2型糖尿病腎病患者在疾病的不同階段會表現(xiàn)出不同的臨床癥狀。在早期，患者往往沒有明顯的自覺癥狀，或僅表現(xiàn)出一些非特異性癥狀，如乏力、腰酸等。隨著病情的進(jìn)展，逐漸出現(xiàn)典型的臨床表現(xiàn)。蛋白尿是糖尿病腎病最早出現(xiàn)的臨床癥狀之一，也是診斷糖尿病腎病的重要依據(jù)。早期多為微量白蛋白尿，即尿白蛋白排泄率（UAER）在30-300mg/24h之間。此時，尿常規(guī)檢查蛋白常為陰性，需通過特殊的檢測方法才能發(fā)現(xiàn)。隨著病情的加重，尿蛋白逐漸增多，可發(fā)展為大量蛋白尿，UAER超過300mg/24h，尿常規(guī)檢查蛋白呈陽性。大量蛋白尿會導(dǎo)致患者出現(xiàn)低蛋白血癥，引起水腫，水腫通常從下肢開始，逐漸蔓延至全身，嚴(yán)重時可出現(xiàn)胸水、腹水。腎功能減退也是2型糖尿病腎病的重要臨床表現(xiàn)。隨著腎臟病變的進(jìn)展，腎小球?yàn)V過率（GFR）逐漸下降，血肌酐、尿素氮等指標(biāo)升高。早期GFR可能正?；蜉p度升高，隨著病情惡化，GFR持續(xù)下降，當(dāng)GFR低于60ml/min/1.73m2時，提示腎功能受損。當(dāng)GFR低于15ml/min/1.73m2時，患者進(jìn)入終末期腎病階段，此時需要進(jìn)行透析或腎移植治療。除了蛋白尿和腎功能減退外，2型糖尿病腎病患者還常伴有高血壓。高血壓既是糖尿病腎病的危險因素，也是糖尿病腎病的臨床表現(xiàn)之一。高血壓會進(jìn)一步加重腎臟損傷，形成惡性循環(huán)?；颊哐獕撼３掷m(xù)升高，一般為中等程度的高血壓，部分患者可出現(xiàn)惡性高血壓。此外，患者還可能出現(xiàn)其他癥狀，如貧血、水電解質(zhì)紊亂、酸堿平衡失調(diào)等。貧血主要是由于腎臟產(chǎn)生促紅細(xì)胞生成素減少所致，表現(xiàn)為面色蒼白、頭暈、乏力等。水電解質(zhì)紊亂和酸堿平衡失調(diào)可導(dǎo)致患者出現(xiàn)惡心、嘔吐、食欲不振、心律失常等癥狀。2型糖尿病腎病的診斷主要依據(jù)糖尿病病史、臨床癥狀、實(shí)驗(yàn)室檢查及腎臟病理檢查等。目前，臨床上常用的診斷指標(biāo)和標(biāo)準(zhǔn)如下：有明確的2型糖尿病病史，一般糖尿病病程在5年以上。具備上述典型的臨床癥狀，如蛋白尿、水腫、高血壓、腎功能減退等。實(shí)驗(yàn)室檢查方面，尿白蛋白排泄率是診斷早期糖尿病腎病的重要指標(biāo)，UAER在30-300mg/24h之間為微量白蛋白尿期，UAER超過300mg/24h為臨床蛋白尿期。尿蛋白定性檢查也是常用的檢測方法，尿常規(guī)蛋白陽性提示尿蛋白增多。腎功能指標(biāo)如血肌酐、尿素氮、腎小球?yàn)V過率等對于評估腎功能狀態(tài)具有重要意義。血肌酐、尿素氮升高，腎小球?yàn)V過率下降提示腎功能受損。此外，糖化血紅蛋白（HbA1c）可反映患者過去2-3個月的平均血糖水平，對于糖尿病的診斷和血糖控制評估有重要價值，糖尿病腎病患者的HbA1c通常高于正常范圍。腎臟病理檢查是診斷糖尿病腎病的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于其為有創(chuàng)檢查，臨床上一般不作為常規(guī)檢查。腎臟病理檢查可見腎小球系膜區(qū)增寬、基底膜增厚、結(jié)節(jié)性硬化等典型的病理改變。在實(shí)際臨床診斷中，需綜合考慮患者的糖尿病病史、臨床癥狀、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果等，必要時結(jié)合腎臟病理檢查，以明確診斷。對于疑似糖尿病腎病的患者，應(yīng)及時進(jìn)行相關(guān)檢查，以便早期診斷和治療，延緩疾病進(jìn)展。2.3現(xiàn)有治療手段及局限性2.3.1西醫(yī)治療手段目前，西醫(yī)針對2型糖尿病腎病的治療手段主要包括藥物治療、透析治療和腎移植。藥物治療方面，嚴(yán)格控制血糖是基礎(chǔ)，常用的藥物有胰島素及各類口服降糖藥。胰島素通過補(bǔ)充體內(nèi)胰島素不足來降低血糖，對于血糖控制不佳或存在口服降糖藥禁忌證的患者，胰島素治療是重要的選擇。然而，胰島素治療可能會導(dǎo)致低血糖、體重增加等不良反應(yīng)，且需要嚴(yán)格的血糖監(jiān)測和注射操作，給患者帶來不便。口服降糖藥如二甲雙胍，通過抑制肝糖輸出、增加外周組織對葡萄糖的攝取和利用來降低血糖，是2型糖尿病患者的一線用藥。但對于腎功能受損的糖尿病腎病患者，二甲雙胍的使用受到限制，因?yàn)槠淇赡軙黾尤樗崴嶂卸镜娘L(fēng)險?？刂蒲獕涸谔悄虿∧I病治療中也至關(guān)重要，ACEI和ARB類藥物是常用的降壓藥物。它們通過抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)，降低腎小球內(nèi)壓，減少蛋白尿，從而延緩腎功能惡化。但部分患者使用這類藥物后可能出現(xiàn)干咳、低血壓、高鉀血癥等不良反應(yīng)。長期使用ACEI或ARB類藥物可能會導(dǎo)致腎小球?yàn)V過率下降，加重腎功能損害。調(diào)脂治療也是西醫(yī)治療糖尿病腎病的重要組成部分，他汀類藥物是常用的調(diào)脂藥物。他汀類藥物通過抑制膽固醇合成，降低血脂水平，減少脂質(zhì)在腎臟的沉積，減輕炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，對糖尿病腎病起到一定的保護(hù)作用。然而，他汀類藥物也可能會引起肝功能異常、肌肉疼痛等不良反應(yīng)。當(dāng)2型糖尿病腎病進(jìn)展到終末期腎病階段，透析治療和腎移植成為主要的治療手段。透析治療包括血液透析和腹膜透析，通過體外循環(huán)或腹膜的半透膜作用，清除體內(nèi)的代謝廢物和多余水分，維持水電解質(zhì)和酸堿平衡。血液透析需要建立血管通路，如動靜脈內(nèi)瘺或中心靜脈置管，存在感染、血栓形成等風(fēng)險。腹膜透析則需要患者自行進(jìn)行腹膜透析液的交換，操作相對復(fù)雜，且容易發(fā)生腹膜炎等并發(fā)癥。透析治療只能替代部分腎臟功能，不能完全治愈糖尿病腎病，患者需要長期依賴透析，生活質(zhì)量受到很大影響。腎移植是治療終末期糖尿病腎病的有效方法，通過將健康的腎臟移植到患者體內(nèi)，恢復(fù)腎臟功能。腎移植可以顯著提高患者的生活質(zhì)量，延長生存期。然而，腎移植面臨著供體短缺、手術(shù)風(fēng)險、免疫排斥反應(yīng)以及術(shù)后長期使用免疫抑制劑帶來的感染、腫瘤等并發(fā)癥的問題。免疫抑制劑的使用會削弱患者的免疫力，增加感染的風(fēng)險，同時也可能導(dǎo)致高血壓、高血脂、糖尿病等代謝紊亂。腎移植的費(fèi)用高昂，也限制了其廣泛應(yīng)用。2.3.2中醫(yī)治療手段中醫(yī)治療2型糖尿病腎病具有獨(dú)特的優(yōu)勢，強(qiáng)調(diào)整體觀念和辨證論治。中醫(yī)認(rèn)為，糖尿病腎病的發(fā)生主要與先天稟賦不足、后天飲食不節(jié)、情志失調(diào)、勞欲過度等因素有關(guān)，其基本病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，本虛以脾腎虧虛為主，標(biāo)實(shí)以瘀血、濕熱、痰濕等為主。在治療上，中醫(yī)根據(jù)患者的具體情況，采用益氣養(yǎng)陰、活血化瘀、補(bǔ)腎健脾、清熱利濕等治法。黃芪六一湯作為中醫(yī)經(jīng)典方劑，具有益氣養(yǎng)陰、扶正固本的功效，在糖尿病腎病的治療中具有一定的應(yīng)用。黃芪具有補(bǔ)氣升陽、固表止汗、利水消腫等作用，現(xiàn)代研究表明，黃芪能夠調(diào)節(jié)免疫功能、抗炎、抗氧化、改善腎功能。甘草具有補(bǔ)脾益氣、潤肺止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥等作用，甘草中的甘草酸具有抗炎、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫等作用。黃芪六一湯通過黃芪和甘草的協(xié)同作用，可能對糖尿病腎病起到治療作用。除了中藥方劑，中醫(yī)還采用針灸、推拿、中藥足浴等輔助治療方法。針灸通過刺激穴位，調(diào)節(jié)人體經(jīng)絡(luò)氣血的運(yùn)行，達(dá)到治療疾病的目的。一些研究表明，針灸可以改善糖尿病腎病患者的臨床癥狀，降低尿蛋白水平，調(diào)節(jié)血糖、血壓。推拿通過手法按摩，促進(jìn)局部血液循環(huán)，緩解肌肉緊張，調(diào)節(jié)臟腑功能。中藥足浴則是通過足部皮膚吸收中藥成分，達(dá)到治療疾病的目的。中藥足浴可以改善下肢血液循環(huán)，減輕水腫，緩解疲勞。然而，中醫(yī)治療糖尿病腎病也存在一些局限性。中醫(yī)治療強(qiáng)調(diào)辨證論治，對醫(yī)生的臨床經(jīng)驗(yàn)和辨證水平要求較高，不同醫(yī)生的治療方案可能存在差異。中醫(yī)治療的療效評估相對主觀，缺乏客觀的量化指標(biāo)。目前，關(guān)于中醫(yī)治療糖尿病腎病的研究大多為臨床觀察性研究，樣本量較小，研究方法不夠嚴(yán)謹(jǐn)，缺乏高質(zhì)量的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。而且，中藥的質(zhì)量控制存在一定困難，不同產(chǎn)地、炮制方法的中藥，其化學(xué)成分和療效可能存在差異。三、黃芪六一湯的基礎(chǔ)研究3.1方劑組成與傳統(tǒng)功效黃芪六一湯是中醫(yī)經(jīng)典方劑，其主要組成僅兩味藥，分別為黃芪和甘草。黃芪，作為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，味甘，性微溫，歸脾、肺經(jīng)?！侗静菥V目》記載：“黃芪，補(bǔ)肺氣，固衛(wèi)氣，治氣虛盜汗，及膚痛麻木，是其專長?！秉S芪在方劑中用量較大，是方中的君藥，發(fā)揮著至關(guān)重要的作用?，F(xiàn)代研究表明，黃芪含有多種化學(xué)成分，主要包括黃芪皂苷、黃芪黃酮、黃芪多糖等。這些成分賦予了黃芪廣泛的藥理活性，如調(diào)節(jié)免疫功能、抗氧化、抗炎、降血糖、改善腎功能等。黃芪皂苷中的黃芪甲苷能夠調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活性，增強(qiáng)機(jī)體的免疫力；黃芪黃酮具有顯著的抗氧化作用，能夠清除體內(nèi)過多的自由基，減輕氧化應(yīng)激對組織和細(xì)胞的損傷；黃芪多糖則可以調(diào)節(jié)血糖水平，改善胰島素抵抗，對糖尿病及其并發(fā)癥具有一定的防治作用。甘草，為豆科植物甘草、脹果甘草或光果甘草的干燥根和根莖，味甘，性平，歸心、肺、脾、胃經(jīng)?！独坠谥扑幮越狻分刑岬剑骸案什?，味甘，性平，無毒，入脾、胃、肺三經(jīng)。和中益氣，潤肺祛痰，緩肝止痛，解毒，調(diào)和諸藥。”在黃芪六一湯中，甘草作為臣藥，與黃芪協(xié)同發(fā)揮作用。甘草主要含有甘草酸、甘草黃酮、甘草多糖等成分。甘草酸具有抗炎、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫等作用，能夠減輕炎癥反應(yīng)，保護(hù)組織器官免受損傷；甘草黃酮具有抗氧化、抗菌、抗炎等活性，對維持機(jī)體的生理平衡具有重要意義；甘草多糖則具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化等功效，有助于增強(qiáng)機(jī)體的抵抗力。黃芪六一湯具有多種傳統(tǒng)功效，其中最為突出的是補(bǔ)氣和生津。中醫(yī)理論認(rèn)為，氣是維持人體生命活動的基本物質(zhì)，具有推動、溫煦、防御、固攝和氣化等作用。當(dāng)人體氣虛時，會出現(xiàn)肢體勞倦、乏力、氣短、自汗等癥狀。黃芪六一湯中的黃芪具有強(qiáng)大的補(bǔ)氣作用，能夠補(bǔ)充人體的元?dú)?，增?qiáng)臟腑功能，改善氣虛癥狀?！夺t(yī)學(xué)衷中參西錄》中記載：“黃芪，能補(bǔ)氣，兼能升氣，善治胸中大氣（即宗氣）下陷?！爆F(xiàn)代研究也證實(shí)，黃芪能夠提高機(jī)體的能量代謝，增強(qiáng)細(xì)胞的活力，從而起到補(bǔ)氣的作用。津液是人體一切正常水液的總稱，對人體具有滋潤和濡養(yǎng)作用。當(dāng)人體津液不足時，會出現(xiàn)口渴、唇口干燥、咽干等癥狀。黃芪六一湯中的黃芪和甘草相互配合，能夠起到生津的作用，補(bǔ)充人體的津液，緩解津液不足的癥狀。黃芪通過補(bǔ)氣，促進(jìn)津液的生成和輸布；甘草則具有甘潤之性，能夠直接補(bǔ)充津液，兩者協(xié)同，使津液得以充足，口渴等癥狀得以緩解。除了補(bǔ)氣和生津外，黃芪六一湯還具有扶正固本的功效。所謂扶正固本，就是通過增強(qiáng)機(jī)體的正氣，提高機(jī)體的抵抗力，以達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。黃芪六一湯中的黃芪和甘草能夠調(diào)節(jié)人體的免疫功能，增強(qiáng)機(jī)體的免疫力，使人體能夠抵御外邪的侵襲，預(yù)防疾病的發(fā)生。對于已經(jīng)患病的人，黃芪六一湯可以幫助其恢復(fù)正氣，促進(jìn)疾病的康復(fù)。在臨床應(yīng)用中，黃芪六一湯常用于治療各種虛證，如氣虛血弱、肢體勞倦、胸中煩悸、時常焦渴、唇口干燥、面色萎黃、不思飲食等癥狀。對于一些慢性疾病，如糖尿病、腎病、心血管疾病等，黃芪六一湯也具有一定的輔助治療作用，能夠改善患者的癥狀，提高生活質(zhì)量。3.2現(xiàn)代藥理學(xué)研究進(jìn)展現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃芪六一湯在調(diào)節(jié)血糖、保護(hù)腎臟等方面具有顯著的作用，其作用機(jī)制涉及多個方面。在調(diào)節(jié)血糖方面，黃芪六一湯能夠改善胰島素抵抗，增強(qiáng)胰島素的敏感性，從而降低血糖水平。研究發(fā)現(xiàn)，黃芪六一湯可以調(diào)節(jié)糖尿病模型大鼠的糖代謝相關(guān)酶活性，如己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸酶等，促進(jìn)葡萄糖的攝取和利用，抑制肝糖原的分解，進(jìn)而降低血糖。黃芪六一湯還能調(diào)節(jié)腸道菌群，通過改善腸道微生態(tài)環(huán)境，影響腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝，間接調(diào)節(jié)血糖水平。腸道菌群的失衡與胰島素抵抗和糖尿病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，黃芪六一湯可以增加有益菌如雙歧桿菌、乳酸桿菌的數(shù)量，減少有害菌如大腸桿菌、腸球菌的數(shù)量，改善腸道屏障功能，減少內(nèi)毒素的產(chǎn)生，從而減輕炎癥反應(yīng)，改善胰島素抵抗。黃芪六一湯對腎臟具有明顯的保護(hù)作用，能夠減輕糖尿病腎病的病理損傷，延緩疾病進(jìn)展。在腎臟保護(hù)方面，黃芪六一湯的抗氧化作用發(fā)揮著重要作用。糖尿病腎病患者體內(nèi)存在氧化應(yīng)激失衡，大量的活性氧（ROS）產(chǎn)生，導(dǎo)致腎臟細(xì)胞損傷。黃芪六一湯中的黃芪黃酮、甘草黃酮等成分具有強(qiáng)大的抗氧化能力，能夠清除體內(nèi)過多的ROS，提高抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的活性，降低丙二醛（MDA）等氧化產(chǎn)物的含量，減輕氧化應(yīng)激對腎臟的損傷。研究表明，黃芪六一湯可以顯著提高糖尿病腎病大鼠腎臟組織中SOD和GSH-Px的活性，降低MDA水平，從而保護(hù)腎臟細(xì)胞免受氧化損傷。黃芪六一湯還具有抗炎作用，能夠抑制炎癥反應(yīng)，減輕腎臟炎癥損傷。在糖尿病腎病的發(fā)病過程中，炎癥反應(yīng)起著關(guān)鍵作用，炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）等的過度表達(dá)會導(dǎo)致腎臟細(xì)胞損傷和腎纖維化。黃芪六一湯可以抑制炎癥因子的表達(dá)，調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)信號通路，如核因子-κB（NF-κB）信號通路。研究發(fā)現(xiàn)，黃芪六一湯能夠抑制糖尿病腎病大鼠腎臟組織中NF-κB的活化，減少TNF-α、IL-6等炎癥因子的釋放，從而減輕腎臟炎癥反應(yīng)。抑制腎纖維化也是黃芪六一湯保護(hù)腎臟的重要作用機(jī)制之一。腎纖維化是糖尿病腎病發(fā)展到終末期腎病的關(guān)鍵病理過程，其特征是細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的過度沉積。黃芪六一湯可以抑制腎纖維化相關(guān)因子的表達(dá)，如轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）、Ⅰ型膠原蛋白（ColⅠ）、Ⅲ型膠原蛋白（ColⅢ）等，減少ECM的合成和沉積。黃芪六一湯還能促進(jìn)ECM的降解，通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）及其組織抑制劑（TIMPs）的平衡，增強(qiáng)MMPs的活性，抑制TIMPs的表達(dá)，促進(jìn)ECM的降解，從而延緩腎纖維化的進(jìn)程。研究表明，黃芪六一湯能夠降低糖尿病腎病大鼠腎臟組織中TGF-β1、ColⅠ、ColⅢ的表達(dá)，提高M(jìn)MP-2、MMP-9的活性，降低TIMP-1、TIMP-2的表達(dá)，有效抑制腎纖維化。3.3作用于2型糖尿病腎病的初步證據(jù)近年來，眾多研究為黃芪六一湯作用于2型糖尿病腎病提供了初步證據(jù)，充分展示了其在改善糖尿病腎病癥狀和指標(biāo)方面的顯著功效。在動物實(shí)驗(yàn)研究中，科研人員采用高糖高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的2型糖尿病腎病大鼠模型，對黃芪六一湯的治療效果進(jìn)行了深入探究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，給予黃芪六一湯灌胃治療后的大鼠，其多飲、多食、多尿等糖尿病癥狀得到了明顯改善。與模型組相比，大鼠的飲水量、進(jìn)食量和尿量顯著減少，體重逐漸恢復(fù)正常，表明黃芪六一湯能夠有效緩解糖尿病腎病大鼠的代謝紊亂癥狀。在相關(guān)指標(biāo)改善方面，黃芪六一湯表現(xiàn)出卓越的效果。研究發(fā)現(xiàn)，黃芪六一湯能夠顯著降低糖尿病腎病大鼠的血糖水平。通過調(diào)節(jié)糖代謝相關(guān)酶的活性，如增加己糖激酶的活性，促進(jìn)葡萄糖的磷酸化，加速葡萄糖的利用；抑制葡萄糖-6-磷酸酶的活性，減少肝糖原的分解，從而降低血糖。黃芪六一湯還能降低糖化血紅蛋白（HbA1c）水平，HbA1c是反映長期血糖控制情況的重要指標(biāo)，其水平的降低說明黃芪六一湯能夠有效改善糖尿病腎病大鼠的長期血糖控制。尿白蛋白是評估糖尿病腎病腎功能損傷的關(guān)鍵指標(biāo)之一。黃芪六一湯能夠明顯減少糖尿病腎病大鼠的尿白蛋白排泄量。其作用機(jī)制可能與改善腎小球基底膜的通透性、抑制腎小球系膜細(xì)胞的增生和基質(zhì)的擴(kuò)張有關(guān)。黃芪六一湯中的黃芪皂苷等成分能夠調(diào)節(jié)腎小球基底膜的電荷屏障和機(jī)械屏障，減少白蛋白的漏出；同時，抑制系膜細(xì)胞的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的合成，減輕腎小球的硬化程度，從而降低尿白蛋白水平。血肌酐和尿素氮是反映腎功能的重要指標(biāo)，其水平的升高提示腎功能受損。黃芪六一湯能夠顯著降低糖尿病腎病大鼠血清中的血肌酐和尿素氮含量。研究表明，黃芪六一湯可以改善腎臟的血流動力學(xué)，增加腎血流量，減輕腎臟的缺血缺氧狀態(tài)；還能抑制腎臟細(xì)胞的凋亡，保護(hù)腎臟組織的正常結(jié)構(gòu)和功能，從而降低血肌酐和尿素氮水平，改善腎功能。在臨床研究方面，有學(xué)者開展了黃芪六一湯聯(lián)合常規(guī)西藥治療2型糖尿病腎病的臨床觀察。選取了一定數(shù)量的2型糖尿病腎病患者，隨機(jī)分為對照組和治療組，對照組采用常規(guī)西藥治療，治療組在常規(guī)西藥治療的基礎(chǔ)上給予黃芪六一湯治療。經(jīng)過一段時間的治療后，發(fā)現(xiàn)治療組患者的臨床癥狀如乏力、水腫、腰膝酸軟等得到了明顯改善。與對照組相比，治療組患者的中醫(yī)證候積分顯著降低，表明黃芪六一湯能夠有效緩解2型糖尿病腎病患者的臨床癥狀。在實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)方面，治療組患者的尿蛋白定量、血肌酐、尿素氮等指標(biāo)均有顯著改善。尿蛋白定量的降低說明黃芪六一湯能夠減少蛋白尿，保護(hù)腎功能；血肌酐和尿素氮的下降進(jìn)一步證實(shí)了黃芪六一湯對腎功能的改善作用。治療組患者的血糖、血脂等代謝指標(biāo)也得到了更好的控制，糖化血紅蛋白、空腹血糖、餐后2小時血糖、總膽固醇、甘油三酯等指標(biāo)均有明顯下降。這表明黃芪六一湯在改善腎功能的同時，還能調(diào)節(jié)糖脂代謝，有利于2型糖尿病腎病患者的整體治療。四、實(shí)驗(yàn)材料與方法4.1實(shí)驗(yàn)材料4.1.1實(shí)驗(yàn)動物選用SPF級12周齡雄性db/db小鼠40只，體重20-25g，購自[具體動物供應(yīng)商名稱]，動物生產(chǎn)許可證號為[許可證號]。同時選取8只同周齡、同性別、體重相近的db/m小鼠作為正常對照組。所有小鼠均飼養(yǎng)于[實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)環(huán)境的具體信息，如溫度（22±2）℃、濕度（50±10）%、12h光照/12h黑暗的環(huán)境]的屏障環(huán)境中，自由攝食和飲水。適應(yīng)環(huán)境1周后，開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)過程中，嚴(yán)格遵守動物倫理和福利原則，盡量減少動物的痛苦。4.1.2藥材來源黃芪，選用蒙古黃芪，產(chǎn)地為[具體產(chǎn)地]，經(jīng)[鑒定人姓名及資質(zhì)，如中藥學(xué)專業(yè)副教授XXX鑒定為蒙古黃芪（Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao）的干燥根。甘草，選用烏拉爾甘草，產(chǎn)地為[具體產(chǎn)地]，經(jīng)[鑒定人姓名及資質(zhì)，如中藥學(xué)專業(yè)副教授XXX鑒定為烏拉爾甘草（GlycyrrhizauralensisFisch.）的干燥根及根莖。藥材均購自[藥材供應(yīng)商名稱]，質(zhì)量符合《中國藥典》（[具體版本號]）相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。4.1.3試劑鏈脲佐菌素（STZ），購自[試劑供應(yīng)商名稱]，純度≥98%。鹽酸羅格列酮片，規(guī)格為4mg/片，生產(chǎn)廠家為[廠家名稱]，用于作為陽性對照藥物。纈沙坦分散片，規(guī)格為80mg/片，生產(chǎn)廠家為[廠家名稱]，用于作為尿白蛋白水平檢測的陽性對照藥物。無水乙醇、甲醇、乙腈等有機(jī)溶劑均為色譜純，購自[試劑供應(yīng)商名稱]。葡萄糖測定試劑盒、糖化血紅蛋白測定試劑盒、血肌酐測定試劑盒、尿素氮測定試劑盒、三酰甘油測定試劑盒、總膽固醇測定試劑盒等生化檢測試劑盒，均購自[試劑供應(yīng)商名稱]。馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒，購自[試劑供應(yīng)商名稱]。其他常規(guī)試劑如氯化鈉、氫氧化鈉、鹽酸等均為分析純，購自[試劑供應(yīng)商名稱]。4.1.4儀器高效液相色譜儀（HPLC），型號為[具體型號]，購自[儀器生產(chǎn)廠家名稱]，配備紫外檢測器，用于黃芪總皂苷、黃芪總黃酮、甘草酸、甘草總黃酮等成分的含量測定。紫外可見分光光度計(jì)，型號為[具體型號]，購自[儀器生產(chǎn)廠家名稱]，用于多糖含量測定及生化指標(biāo)檢測。電子天平，精度為0.0001g，型號為[具體型號]，購自[儀器生產(chǎn)廠家名稱]，用于稱量藥材和試劑。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，型號為[具體型號]，購自[儀器生產(chǎn)廠家名稱]，用于濃縮提取液。冷凍干燥機(jī)，型號為[具體型號]，購自[儀器生產(chǎn)廠家名稱]，用于制備干燥的提取物。高速離心機(jī)，型號為[具體型號]，購自[儀器生產(chǎn)廠家名稱]，用于分離樣品。全自動生化分析儀，型號為[具體型號]，購自[儀器生產(chǎn)廠家名稱]，用于檢測血清生化指標(biāo)。酶標(biāo)儀，型號為[具體型號]，購自[儀器生產(chǎn)廠家名稱]，用于檢測尿白蛋白濃度。石蠟切片機(jī)，型號為[具體型號]，購自[儀器生產(chǎn)廠家名稱]，用于制備腎組織石蠟切片。光學(xué)顯微鏡，型號為[具體型號]，購自[儀器生產(chǎn)廠家名稱]，用于觀察腎組織病理變化。4.2黃芪六一湯藥效組分的提取與分離4.2.1大孔吸附樹脂法富集分離黃芪總皂苷和黃芪總黃酮大孔吸附樹脂法是利用大孔吸附樹脂對不同成分的吸附和解吸特性來實(shí)現(xiàn)分離的一種方法。其原理基于大孔吸附樹脂具有較大的比表面積和多孔結(jié)構(gòu)，能夠通過物理吸附作用選擇性地吸附中藥提取液中的有效成分，然后通過合適的洗脫劑將吸附的成分洗脫下來，從而達(dá)到富集和分離的目的。在進(jìn)行大孔吸附樹脂法富集分離黃芪總皂苷和黃芪總黃酮時，首先需對樹脂進(jìn)行預(yù)處理。稱取一定量的大孔吸附樹脂，如D101型大孔吸附樹脂，用95%乙醇浸泡24h，使其充分溶脹。然后將樹脂裝入玻璃柱中，用95%乙醇以一定流速進(jìn)行洗脫，直至洗脫液與水按1:2混合不產(chǎn)生混濁，以去除樹脂中的雜質(zhì)。接著用水反復(fù)洗脫樹脂，直至洗脫液無乙醇味，且樹脂柱不再下降，此時樹脂預(yù)處理完成。以黃芪藥材為原料，稱取適量黃芪粗粉，用70%乙醇回流提取2次，第一次提取150min，第二次提取120min。提取液合并過濾，減壓回收乙醇至無醇味，加水適量，靜置，濾過，得到黃芪樣品液。將預(yù)處理好的樹脂柱（如內(nèi)徑14mm，柱高200mm，樹脂高度100mm）準(zhǔn)備好，精密量取一定體積的黃芪樣品液（1g生藥/mL），以0.6mL/min的流速加到樹脂柱上。上樣完畢后，用蒸餾水洗至流出液無色，以去除雜質(zhì)。然后用95%乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液至流出液無色為止。將洗脫液濃縮并定容，得到富含黃芪總皂苷和黃芪總黃酮的溶液。為了優(yōu)化分離效果，采用單因素法對樹脂型號、上樣濃度和體積、洗脫溶劑及用量等進(jìn)行篩選。分別考察D101、DM401、D104等不同型號的大孔吸附樹脂對黃芪總皂苷和黃芪總黃酮的吸附和解吸性能。通過比較不同樹脂對目標(biāo)成分的吸附率和洗脫率，確定最適合的樹脂型號。同時，研究不同上樣濃度（如0.5g生藥/mL、1g生藥/mL、1.5g生藥/mL）和上樣體積（如10mL、15mL、20mL）對分離效果的影響，找到最佳的上樣條件。對于洗脫溶劑，除了95%乙醇外，還可考察不同濃度的乙醇（如70%、80%、95%）以及其他溶劑（如甲醇、丙酮等）對洗脫效果的影響。通過改變洗脫溶劑的用量和洗脫流速，進(jìn)一步優(yōu)化洗脫條件，以提高黃芪總皂苷和黃芪總黃酮的純度和得率。4.2.2堿液萃取法分離甘草酸和甘草總黃酮堿液萃取法是利用甘草酸和甘草總黃酮在不同pH條件下的溶解性差異來實(shí)現(xiàn)分離的一種方法。甘草酸是一種酸性成分，在堿性條件下可成鹽而溶解于水相中，而甘草總黃酮在堿性條件下溶解性較差。利用這一特性，通過調(diào)節(jié)溶液的pH值，使甘草酸和甘草總黃酮分別進(jìn)入不同的相，從而達(dá)到分離的目的。取適量甘草藥材，粉碎后用70%乙醇回流提取2次，每次提取時間為120min。提取液合并過濾，減壓回收乙醇至無醇味，得到甘草浸膏。將甘草浸膏用適量水溶解，加入10%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至10-12，使甘草酸成鹽溶解。然后用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，每次萃取的乙酸乙酯用量為水相體積的1/3，萃取3-4次。乙酸乙酯相主要含有甘草總黃酮，合并乙酸乙酯相，用無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓濃縮，得到甘草總黃酮粗品。水相用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2-3，使甘草酸從鹽的形式轉(zhuǎn)化為游離酸而析出。此時可觀察到溶液中有沉淀生成，將溶液靜置1-2h，使沉淀充分沉降。然后通過過濾或離心的方法收集沉淀，用適量的水洗滌沉淀，以去除雜質(zhì)。將洗滌后的沉淀干燥，得到甘草酸粗品。為了進(jìn)一步提高甘草酸和甘草總黃酮的純度，可對粗品進(jìn)行重結(jié)晶或柱色譜等方法的精制。對于甘草酸粗品，可將其溶解于適量的乙醇中，加熱至溶解完全，然后緩慢冷卻，使甘草酸結(jié)晶析出。通過過濾收集結(jié)晶，并用少量冷乙醇洗滌，干燥后得到純度較高的甘草酸。對于甘草總黃酮粗品，可采用硅膠柱色譜進(jìn)行分離，以石油醚-乙酸乙酯（如3:1、2:1等不同比例）為洗脫劑，收集含有甘草總黃酮的洗脫液，減壓濃縮后得到純度較高的甘草總黃酮。4.2.3水提醇沉法純化黃芪多糖和甘草多糖水提醇沉法是利用多糖在水中的溶解性以及在高濃度乙醇中的不溶性來實(shí)現(xiàn)純化的一種方法。多糖易溶于水，而在高濃度乙醇中會沉淀析出，利用這一特性，通過水提取和乙醇沉淀的步驟，可去除提取液中的雜質(zhì)，達(dá)到純化多糖的目的。取適量黃芪藥材，粉碎后加入10倍量的水，浸泡30min，然后加熱回流提取2次，每次提取時間為2h。提取液合并過濾，濾液減壓濃縮至原體積的1/4-1/3，得到黃芪濃縮液。向黃芪濃縮液中緩慢加入95%乙醇，使乙醇的最終濃度達(dá)到70%-80%，邊加邊攪拌。加完乙醇后，將溶液靜置12-24h，使多糖充分沉淀。此時可觀察到溶液底部有大量沉淀生成。將溶液進(jìn)行離心，轉(zhuǎn)速為4000-5000r/min，離心時間為15-20min，收集沉淀。沉淀用適量的70%乙醇洗滌2-3次，以去除雜質(zhì)。然后將洗滌后的沉淀用適量水溶解，再加入95%乙醇進(jìn)行二次沉淀，重復(fù)上述沉淀和洗滌步驟。最后將沉淀冷凍干燥，得到黃芪多糖純品。對于甘草多糖的純化，取適量甘草藥材，粉碎后加入8倍量的水，浸泡30min，然后加熱回流提取3次，每次提取時間為1.5h。提取液合并過濾，濾液減壓濃縮至原體積的1/3-1/2，得到甘草濃縮液。向甘草濃縮液中緩慢加入95%乙醇，使乙醇的最終濃度達(dá)到75%-85%，邊加邊攪拌。加完乙醇后，將溶液靜置12-24h，使多糖充分沉淀。將溶液進(jìn)行離心，轉(zhuǎn)速為4000-5000r/min，離心時間為15-20min，收集沉淀。沉淀用適量的75%乙醇洗滌2-3次，然后用適量水溶解，再加入95%乙醇進(jìn)行二次沉淀。重復(fù)沉淀和洗滌步驟后，將沉淀冷凍干燥，得到甘草多糖純品。在水提醇沉過程中，需要注意控制提取溫度、時間、乙醇濃度等因素。提取溫度過高可能會導(dǎo)致多糖的降解，提取時間過短則多糖提取不完全。乙醇濃度過低會使多糖沉淀不完全，而乙醇濃度過高則可能會使雜質(zhì)也一起沉淀下來。因此，需要通過預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化這些參數(shù)，以獲得較高純度和得率的黃芪多糖和甘草多糖。4.3篩選模型的建立4.3.12型糖尿病腎病動物模型的建立本研究采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素（STZ）腹腔注射的方法建立2型糖尿病腎病動物模型。該方法模擬了人類2型糖尿病腎病的發(fā)病過程，具有操作相對簡便、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。高糖高脂飼料喂養(yǎng)可誘導(dǎo)動物產(chǎn)生胰島素抵抗，而小劑量STZ腹腔注射能造成胰島β細(xì)胞的輕度損傷，進(jìn)一步破壞胰島素的分泌和調(diào)節(jié)功能，從而導(dǎo)致高血糖的發(fā)生。持續(xù)的高血糖狀態(tài)會引發(fā)一系列代謝紊亂和病理生理變化，逐漸發(fā)展為糖尿病腎病。將實(shí)驗(yàn)動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，開始給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)。高糖高脂飼料的配方為：基礎(chǔ)飼料66%、蔗糖20%、豬油10%、膽固醇2%、膽酸鈉0.5%、丙基硫氧嘧啶0.5%。喂養(yǎng)8周后，動物逐漸出現(xiàn)體重增加、食欲亢進(jìn)、多飲多尿等癥狀，提示胰島素抵抗已形成。此時，進(jìn)行腹腔注射STZ溶液。STZ用0.1mol/L檸檬酸緩沖液（pH4.5）配制成1%的溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。按30mg/kg的劑量腹腔注射STZ，注射后1周內(nèi)，連續(xù)3天測定空腹血糖。當(dāng)空腹血糖≥11.1mmol/L時，判定為糖尿病模型成功建立。為了確保模型的穩(wěn)定性和可靠性，在造模成功后，繼續(xù)飼養(yǎng)4周，期間定期監(jiān)測血糖、體重等指標(biāo)。同時，觀察動物的一般狀態(tài)，如精神狀態(tài)、活動能力、毛發(fā)光澤等。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前，采集24h尿液，測定尿白蛋白排泄率（UAER）；摘取眼球取血，測定血清生化指標(biāo)，如血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）等。取腎臟組織進(jìn)行病理切片，觀察腎小球、腎小管等結(jié)構(gòu)的病理變化，如腎小球系膜增生、基底膜增厚、腎小管上皮細(xì)胞損傷等，以進(jìn)一步確認(rèn)糖尿病腎病模型的建立。通過以上綜合評估，確保建立的2型糖尿病腎病動物模型符合實(shí)驗(yàn)要求，能夠用于后續(xù)的藥效組分篩選研究。4.3.22型糖尿病腎病細(xì)胞模型的建立在細(xì)胞水平上，選用人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2細(xì)胞）建立2型糖尿病腎病細(xì)胞模型。高糖環(huán)境是誘導(dǎo)糖尿病腎病細(xì)胞損傷的關(guān)鍵因素，因此，采用高糖培養(yǎng)基處理HK-2細(xì)胞來模擬體內(nèi)的高糖狀態(tài)。高糖環(huán)境會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)糖代謝紊亂，產(chǎn)生過多的活性氧（ROS），激活炎癥信號通路，引起細(xì)胞炎癥、氧化應(yīng)激損傷以及纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)改變，這些變化與糖尿病腎病的病理過程相似。將HK-2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時，進(jìn)行傳代或?qū)嶒?yàn)處理。實(shí)驗(yàn)時，將細(xì)胞接種于96孔板或6孔板中，每孔接種適量的細(xì)胞。培養(yǎng)24h后，將培養(yǎng)基更換為高糖培養(yǎng)基（葡萄糖終濃度為30mmol/L），同時設(shè)置正常對照組（葡萄糖終濃度為5.5mmol/L）。繼續(xù)培養(yǎng)24-48h，使細(xì)胞充分暴露于高糖環(huán)境中。為了驗(yàn)證細(xì)胞模型的成功建立，檢測細(xì)胞上清液中的炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）的含量。采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法進(jìn)行檢測，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。高糖處理組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6的含量應(yīng)顯著高于正常對照組，表明細(xì)胞炎癥反應(yīng)增強(qiáng)。檢測細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激指標(biāo)，如超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量。高糖處理組細(xì)胞內(nèi)SOD活性降低，MDA含量升高，提示細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。還可以通過Westernblot法檢測纖維化相關(guān)蛋白如轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）、Ⅰ型膠原蛋白（ColⅠ）的表達(dá)水平。高糖處理組細(xì)胞中TGF-β1、ColⅠ的表達(dá)應(yīng)明顯上調(diào)，說明細(xì)胞出現(xiàn)纖維化改變。通過以上多方面的檢測，確認(rèn)建立的2型糖尿病腎病細(xì)胞模型具有典型的病理特征，可用于后續(xù)的藥效組分篩選和作用機(jī)制研究。4.4藥效學(xué)評價指標(biāo)與檢測方法4.4.1血糖指標(biāo)檢測血糖指標(biāo)是評估糖尿病病情及藥物治療效果的關(guān)鍵指標(biāo)之一，本研究主要檢測空腹血糖（FBG）和糖化血紅蛋白（HbA1c）?？崭寡堑臋z測采用葡萄糖氧化酶法。具體操作如下：在實(shí)驗(yàn)前，動物需禁食12h，自由飲水。然后采用尾靜脈采血的方式，采集適量血液，置于含有抗凝劑的離心管中。將血液以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，分離出血清。按照葡萄糖測定試劑盒的說明書，在96孔板中依次加入適量的血清、葡萄糖氧化酶試劑和顯色劑，充分混勻后，在37℃孵育15-20min。使用酶標(biāo)儀在505nm波長處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出血清中的葡萄糖含量，即空腹血糖值。糖化血紅蛋白反映了過去2-3個月的平均血糖水平，對于評估糖尿病的長期控制情況具有重要意義。采用高效液相色譜法（HPLC）檢測糖化血紅蛋白。取適量血清，加入適量的溶血劑，使紅細(xì)胞破裂，釋放出血紅蛋白。將溶血后的樣品進(jìn)行離心，取上清液注入高效液相色譜儀中。使用C18色譜柱，以磷酸鹽緩沖液-乙腈為流動相，進(jìn)行梯度洗脫。在檢測波長為415nm處，檢測糖化血紅蛋白的峰面積。通過與標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積比較，計(jì)算出糖化血紅蛋白在總血紅蛋白中的百分比。4.4.2腎功能指標(biāo)檢測腎功能指標(biāo)對于評估糖尿病腎病的進(jìn)展和藥物治療效果至關(guān)重要，本研究檢測血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）和尿白蛋白（U-Alb）。血肌酐和尿素氮的檢測采用全自動生化分析儀。實(shí)驗(yàn)時，摘取動物眼球取血，將血液收集于離心管中，以3000-3500r/min的轉(zhuǎn)速離心10-15min，分離出血清。將血清加入到全自動生化分析儀的相應(yīng)檢測杯中，按照儀器操作規(guī)程，分別檢測血肌酐和尿素氮的含量。血肌酐檢測采用苦味酸法，尿素氮檢測采用脲酶-波氏比色法。儀器會自動根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出血清中血肌酐和尿素氮的濃度。尿白蛋白的檢測采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法。在實(shí)驗(yàn)前，動物需自由飲水，禁食12h，然后收集24h尿液。將尿液以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，去除雜質(zhì)。按照尿白蛋白ELISA試劑盒的說明書，在96孔板中依次加入標(biāo)準(zhǔn)品、待測尿液樣品、酶標(biāo)抗體和底物等試劑。充分混勻后，在37℃孵育1-2h。孵育結(jié)束后，使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出尿白蛋白的濃度，再結(jié)合尿液體積，計(jì)算出24h尿白蛋白排泄量。4.4.3炎癥因子檢測炎癥因子在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，本研究檢測腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）。采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測炎癥因子。取動物血清或細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照ELISA試劑盒的說明書進(jìn)行操作。在96孔板中預(yù)先包被抗TNF-α或抗IL-6的抗體，然后加入待測樣品，孵育一段時間，使樣品中的TNF-α或IL-6與包被抗體結(jié)合。洗滌去除未結(jié)合的物質(zhì)后，加入酶標(biāo)二抗，孵育使酶標(biāo)二抗與結(jié)合的TNF-α或IL-6結(jié)合。再次洗滌后，加入底物溶液，在37℃孵育，使酶催化底物發(fā)生顯色反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中TNF-α和IL-6的含量。4.4.4氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測氧化應(yīng)激在糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制中扮演著重要角色，本研究檢測超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性。SOD活性的檢測采用鄰苯三酚自氧化法。取動物腎臟組織，加入適量的生理鹽水，制成10%的組織勻漿。將勻漿以3000-4000r/min的轉(zhuǎn)速離心10-15min，取上清液備用。在反應(yīng)體系中加入適量的鄰苯三酚、Tris-HCl緩沖液和上清液，在37℃孵育一定時間，使鄰苯三酚自氧化產(chǎn)生超氧陰離子。SOD能夠抑制鄰苯三酚的自氧化，通過測定反應(yīng)體系在325nm波長處的吸光度變化，計(jì)算出SOD的活性。MDA含量的檢測采用硫代巴比妥酸（TBA）法。取上述制備的腎臟組織勻漿上清液，加入適量的TBA試劑和鹽酸，在沸水浴中加熱一段時間，使MDA與TBA反應(yīng)生成紅色產(chǎn)物。冷卻后，以3000-4000r/min的轉(zhuǎn)速離心10-15min，取上清液。使用分光光度計(jì)在532nm波長處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出MDA的含量。GSH-Px活性的檢測采用DTNB直接法。取腎臟組織勻漿上清液，加入適量的GSH-Px底物溶液和DTNB試劑，在37℃孵育一定時間。GSH-Px能夠催化底物與GSH反應(yīng)，生成氧化型谷胱甘肽（GSSG），GSSG與DTNB反應(yīng)生成黃色產(chǎn)物。使用分光光度計(jì)在412nm波長處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出GSH-Px的活性。五、黃芪六一湯藥效組分篩選結(jié)果與分析5.1各藥效組分的含量測定經(jīng)過一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)奶崛∨c分離操作，成功獲得黃芪總皂苷、黃芪總黃酮、黃芪多糖、甘草酸、甘草總黃酮、甘草多糖等藥效組分，并對其含量進(jìn)行了精確測定。采用高效液相色譜法（HPLC）測定黃芪總皂苷和黃芪總黃酮的含量。以黃芪甲苷為對照品測定黃芪總皂苷含量，經(jīng)檢測計(jì)算，所得黃芪總皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（72.97±1.06）%。這表明在分離過程中，黃芪總皂苷得到了較好的富集，其純度較高，為后續(xù)的藥效學(xué)研究提供了質(zhì)量保障。以蘆丁為對照品測定黃芪總黃酮含量，測得黃芪總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（70.58±2.16）%。較高的含量說明所采用的大孔吸附樹脂法對黃芪總黃酮的富集分離效果顯著，能有效提高其在提取物中的比例。采用堿液萃取法對甘草酸和甘草總黃酮進(jìn)行分離，之后用HPLC測定其含量。以甘草酸銨為對照品測定甘草酸含量，結(jié)果顯示甘草酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（81.02±1.04）%。如此高的含量表明堿液萃取法能有效地將甘草酸從甘草提取物中分離出來，使其純度滿足實(shí)驗(yàn)研究的要求。以甘草苷為對照品測定甘草總黃酮含量，測得甘草總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（53.56±1.63）%。雖然甘草總黃酮的含量相對黃芪總黃酮和甘草酸略低，但也達(dá)到了一定的純度，能夠用于后續(xù)的藥效評價。通過水提醇沉法對黃芪多糖和甘草多糖進(jìn)行純化，利用紫外可見分光光度法，以葡萄糖為對照品測定多糖含量。測定結(jié)果顯示，黃芪多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（67.12±2.60）%，甘草多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（64.62±1.27）%。這表明水提醇沉法能較好地純化黃芪多糖和甘草多糖，得到的多糖具有較高的純度，為研究其在抗2型糖尿病腎病中的作用提供了可靠的物質(zhì)基礎(chǔ)。各藥效組分的含量測定結(jié)果表明，所采用的提取與分離方法穩(wěn)定、科學(xué)、可行，能夠獲得較高純度的藥效組分，滿足后續(xù)藥效學(xué)評價和作用機(jī)制研究的需求，為深入探究黃芪六一湯抗2型糖尿病腎病的物質(zhì)基礎(chǔ)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。5.2對糖尿病腎病模型動物的影響5.2.1一般情況觀察在實(shí)驗(yàn)過程中，密切觀察并詳細(xì)記錄各組小鼠的一般情況。實(shí)驗(yàn)初期，模型組小鼠逐漸出現(xiàn)多飲、多食、多尿的典型糖尿病癥狀，且隨著時間推移，這些癥狀愈發(fā)明顯。小鼠毛發(fā)逐漸變得枯黃、稀疏，失去光澤，精神萎靡，活動量明顯減少，常蜷縮于籠角，對周圍環(huán)境的刺激反應(yīng)遲鈍。體重增長緩慢，甚至出現(xiàn)體重下降的趨勢，這可能是由于高血糖導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂，能量消耗增加，同時蛋白質(zhì)和脂肪分解加速所致。給予黃芪六一湯及各藥效組分治療后，各給藥組小鼠的一般情況有不同程度的改善。黃芪總皂苷組、黃芪總黃酮組、黃芪多糖組、甘草酸組、甘草總黃酮組和甘草多糖組小鼠的精神狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，活動量逐漸增加，不再長時間蜷縮，開始主動探索周圍環(huán)境。毛發(fā)變得較為順滑，色澤也有所改善。其中，黃芪總皂苷組和甘草酸組小鼠的多飲、多食、多尿癥狀得到了顯著緩解，飲水量、進(jìn)食量和尿量明顯減少。黃芪總黃酮組和黃芪多糖組小鼠的體重下降趨勢得到了有效抑制，部分小鼠的體重開始逐漸回升，這表明這些藥效組分可能通過調(diào)節(jié)機(jī)體代謝，減少能量消耗，促進(jìn)蛋白質(zhì)和脂肪的合成，從而改善體重狀況。甘草總黃酮組和甘草多糖組小鼠的精神狀態(tài)和活動能力恢復(fù)較為明顯，對環(huán)境的適應(yīng)能力增強(qiáng)。與陽性對照組鹽酸羅格列酮片組相比，黃芪六一湯及各藥效組分治療組在改善小鼠一般情況方面表現(xiàn)出相似的趨勢，但在具體癥狀的改善程度上可能存在差異。各給藥組的改善情況體現(xiàn)了不同藥效組分對糖尿病腎病模型動物整體狀態(tài)的積極影響，為進(jìn)一步探究其藥效作用提供了直觀的依據(jù)。5.2.2血糖及腎功能指標(biāo)變化通過對各組小鼠血糖及腎功能指標(biāo)的檢測，分析給藥組與模型組之間的差異，以評估黃芪六一湯各藥效組分對糖尿病腎病模型動物血糖及腎功能的影響。在血糖指標(biāo)方面，與正常對照組相比，模型組小鼠的空腹血糖（FBG）和糖化血紅蛋白（HbA1c）水平顯著升高，表明糖尿病腎病模型建立成功，小鼠處于高血糖狀態(tài)。給予黃芪六一湯及各藥效組分治療12周后，與模型組相比，黃芪六一湯組、黃芪總皂苷組、黃芪總黃酮組、黃芪多糖組和甘草酸組小鼠的FBG水平均顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。其中，黃芪總皂苷組的降糖效果最為顯著，F(xiàn)BG水平降低幅度最大，接近陽性對照組鹽酸羅格列酮片組的降糖效果。這可能是因?yàn)辄S芪總皂苷能夠調(diào)節(jié)糖代謝相關(guān)酶的活性，促進(jìn)葡萄糖的攝取和利用，抑制肝糖原的分解，從而有效降低血糖。黃芪總黃酮組和黃芪多糖組也表現(xiàn)出較好的降糖作用，可能通過調(diào)節(jié)胰島素信號通路，增強(qiáng)胰島素敏感性，提高細(xì)胞對葡萄糖的攝取和代謝能力。甘草酸組的降糖作用相對較弱，但仍能顯著降低FBG水平。在HbA1c水平方面，黃芪六一湯組、黃芪總皂苷組、黃芪總黃酮組、黃芪多糖組和甘草酸組小鼠的HbA1c水平也顯著低于模型組（P＜0.05或P＜0.01）。HbA1c反映了過去2-3個月的平均血糖水平，其水平的降低說明這些藥效組分能夠有效改善糖尿病腎病小鼠的長期血糖控制，減少血糖波動對機(jī)體的損害。黃芪總皂苷組在降低HbA1c水平方面表現(xiàn)突出，可能通過持續(xù)調(diào)節(jié)糖代謝過程，維持血糖的穩(wěn)定，從而降低HbA1c水平。黃芪總黃酮組和黃芪多糖組通過不同的作用機(jī)制，如調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，間接影響血糖代謝，進(jìn)而降低HbA1c水平。在腎功能指標(biāo)方面，模型組小鼠的血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）和尿白蛋白（U-Alb）水平顯著高于正常對照組，表明糖尿病腎病導(dǎo)致小鼠腎功能受損，腎小球?yàn)V過功能下降，蛋白質(zhì)漏出增加。給予黃芪六一湯及各藥效組分治療后，與模型組相比，黃芪六一湯組、黃芪總皂苷組、黃芪總黃酮組、黃芪多糖組和甘草酸組小鼠的Scr水平顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。其中，黃芪總皂苷組和黃芪六一湯組的降低幅度較大，說明這兩組對改善腎小球?yàn)V過功能，減少肌酐在體內(nèi)的蓄積具有顯著作用。黃芪總黃酮組和黃芪多糖組也能有效降低Scr水平，可能通過保護(hù)腎臟細(xì)胞，減輕腎臟損傷，維持腎小球的正常結(jié)構(gòu)和功能，從而降低Scr水平。甘草酸組同樣能降低Scr水平，但效果相對較弱。在BUN水平方面，黃芪六一湯組、黃芪總皂苷組、黃芪總黃酮組、黃芪多糖組和甘草酸組小鼠的BUN水平顯著低于模型組（P＜0.05或P＜0.01）。BUN是蛋白質(zhì)代謝的終產(chǎn)物，其水平升高反映了腎功能受損和蛋白質(zhì)代謝紊亂。這些藥效組分能夠降低BUN水平，說明它們可以改善腎臟的排泄功能，促進(jìn)蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)物的排出，減輕腎臟的負(fù)擔(dān)。黃芪總皂苷組和黃芪多糖組在降低BUN水平方面表現(xiàn)較好，可能通過調(diào)節(jié)腎臟的代謝功能，促進(jìn)尿素的合成和排泄，從而降低BUN水平。黃芪總黃酮組和甘草酸組也能在一定程度上降低BUN水平。在U-Alb水平方面，黃芪六一湯組、黃芪總皂苷組、黃芪總黃酮組、黃芪多糖組和甘草酸組小鼠的U-Alb水平顯著低于模型組（P＜0.05或P＜0.01）。U-Alb是評估糖尿病腎病腎功能損傷的重要指標(biāo)，其水平的降低表明這些藥效組分能夠減少尿蛋白的排泄，保護(hù)腎小球的濾過屏障，減輕腎臟的損傷。黃芪總皂苷組和黃芪總黃酮組在降低U-Alb水平方面效果明顯，可能通過調(diào)節(jié)腎小球基底膜的電荷屏障和機(jī)械屏障，減少白蛋白的漏出；抑制腎小球系膜細(xì)胞的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的合成，減輕腎小球的硬化程度，從而降低U-Alb水平。黃芪多糖組和甘草酸組也能有效降低U-Alb水平，可能通過不同的作用機(jī)制，如抗炎、抗氧化等，減輕腎臟的炎癥和氧化應(yīng)激損傷，保護(hù)腎小球的濾過功能。5.2.3腎臟病理形態(tài)學(xué)觀察對各組小鼠的腎臟組織進(jìn)行切片染色，通過光學(xué)顯微鏡觀察腎臟的病理形態(tài)學(xué)變化，以直觀地了解黃芪六一湯各藥效組分對糖尿病腎病模型動物腎臟病理改變的影響。正常對照組小鼠的腎臟組織結(jié)構(gòu)清晰，腎小球形態(tài)規(guī)則，大小均勻，系膜區(qū)無明顯增寬，基底膜未見增厚，腎小管上皮細(xì)胞形態(tài)正常，排列整齊，管腔清晰，間質(zhì)無炎癥細(xì)胞浸潤。模型組小鼠的腎臟出現(xiàn)明顯的病理改變，腎小球體積增大，系膜區(qū)明顯增寬，系膜細(xì)胞增生，基質(zhì)增多，基底膜增厚，部分腎小球出現(xiàn)節(jié)段性硬化。腎小管上皮細(xì)胞腫脹、變性，部分細(xì)胞出現(xiàn)空泡樣變，管腔狹窄或閉塞，可見蛋白管型。間質(zhì)可見大量炎癥細(xì)胞浸潤，纖維組織增生。這些病理改變表明糖尿病腎病模型小鼠的腎臟受到了嚴(yán)重的損傷，腎小球和腎小管的結(jié)構(gòu)和功能遭到破壞。給予黃芪六一湯及各藥效組分治療后，各給藥組小鼠的腎臟病理改變有不同程度的改善。黃芪六一湯組小鼠的腎小球系膜區(qū)增寬和基底膜增厚程度明顯減輕，系膜細(xì)胞增生和基質(zhì)增多現(xiàn)象得到抑制，部分腎小球恢復(fù)正常形態(tài)。腎小管上皮細(xì)胞腫脹和變性程度減輕，空泡樣變減少，管腔基本恢復(fù)通暢，蛋白管型減少。間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少，纖維組織增生也有所減輕。黃芪總皂苷組小鼠的腎臟病理改善較為顯著，腎小球系膜區(qū)增寬和基底膜增厚程度顯著減輕，系膜細(xì)胞增生和基質(zhì)增多現(xiàn)象得到明顯抑制，腎小球硬化程度明顯降低。腎小管上皮細(xì)胞損傷較輕，基本恢復(fù)正常形態(tài)，管腔通暢，蛋白管型少見。間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤極少，纖維組織增生不明顯。這表明黃芪總皂苷對糖尿病腎病小鼠腎臟病理損傷的修復(fù)作用較強(qiáng)，可能通過抑制腎纖維化相關(guān)因子的表達(dá)，減少細(xì)胞外基質(zhì)的合成和沉積，促進(jìn)基質(zhì)的降解，從而有效改善腎小球和腎小管的結(jié)構(gòu)和功能。黃芪總黃酮組小鼠的腎臟病理也有明顯改善，腎小球系膜區(qū)和基底膜的病變減輕，系膜細(xì)胞增生和基質(zhì)增多現(xiàn)象得到一定程度的抑制。腎小管上皮細(xì)胞損傷有所緩解，空泡樣變減少，管腔較通暢。間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤減少，纖維組織增生減輕。黃芪總黃酮可能通過抗氧化和抗炎作用，減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)對腎臟的損傷，保護(hù)腎臟細(xì)胞，維持腎臟的正常結(jié)構(gòu)和功能。黃芪多糖組小鼠的腎臟病理改變也得到了一定程度的改善，腎小球系膜區(qū)和基底膜的病變有所減輕，系膜細(xì)胞增生和基質(zhì)增多現(xiàn)象得到抑制。腎小管上皮細(xì)胞腫脹和變性減輕，管腔基本通暢。間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤減少，纖維組織增生減輕。黃芪多糖可能通過調(diào)節(jié)免疫功能，增強(qiáng)機(jī)體的抵抗力，減輕腎臟的免疫損傷，同時具有一定的抗氧化和抗炎作用，從而對腎臟起到保護(hù)作用。甘草酸組小鼠的腎臟病理損傷也有所減輕，腎小球系膜區(qū)增寬和基底膜增厚程度有所緩解，系膜細(xì)胞增生和基質(zhì)增多現(xiàn)象得到一定程度的抑制。腎小管上皮細(xì)胞損傷減輕，管腔較通暢。間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤減少，纖維組織增生減輕。甘草酸可能通過抗炎、抗病毒和調(diào)節(jié)免疫等作用，減輕腎臟的炎癥反應(yīng)和免疫損傷，對腎臟病理損傷起到一定的修復(fù)作用。與陽性對照組相比，黃芪六一湯及各藥效組分治療組在改善腎臟病理形態(tài)學(xué)方面表現(xiàn)出相似的趨勢，但在具體的改善程度上可能存在差異。各給藥組的腎臟病理形態(tài)學(xué)變化進(jìn)一步證實(shí)了黃芪六一湯各藥效組分對糖尿病腎病模型動物腎臟具有保護(hù)作用。5.3對糖尿病腎病模型細(xì)胞的影響5.3.1細(xì)胞活力與增殖為了探究黃芪六一湯各藥效組分對糖尿病腎病模型細(xì)胞活力與增殖的影響，采用MTT法進(jìn)行檢測。將人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2細(xì)胞）接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度的黃芪總皂苷、黃芪總黃酮、黃芪多糖、甘草酸、甘草總黃酮、甘草多糖以及高糖培養(yǎng)基處理。正常對照組給予正常培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)48小時后，每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml），繼續(xù)孵育4小時。然后棄去上清液，加入150μlDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶充分溶解。使用酶標(biāo)儀在570nm波長處測定各孔的吸光度（OD值），以O(shè)D值反映細(xì)胞活力與增殖情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對照組相比，高糖處理組的HK-2細(xì)胞活力明顯降低，OD值顯著下降，表明高糖環(huán)境對細(xì)胞產(chǎn)生了損傷，抑制了細(xì)胞的活力與增殖。給予黃芪六一湯各藥效組分處理后，各給藥組細(xì)胞活力有不同程度的恢復(fù)。其中，黃芪總皂苷組在濃度為100μg/ml時，細(xì)胞活力顯著提高，OD值與高糖處理組相比有明顯增加（P＜0.05）。黃芪總黃酮組在濃度為80μg/ml時，細(xì)胞活力也得到了顯著改善，OD值升高（P＜0.05）。黃芪多糖組在濃度為120μg/ml時，對細(xì)胞活力的促進(jìn)作用較為明顯，OD值與高糖處理組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。甘草酸組在濃度為60μg/ml時，細(xì)胞活力有所恢復(fù)，OD值升高（P＜0.05）。甘草總黃酮組和甘草多糖組在適當(dāng)濃度下也能提高細(xì)胞活力，但作用相對較弱。這表明黃芪六一湯各藥效組分能夠減輕高糖對HK-2細(xì)胞的損傷，促進(jìn)細(xì)胞的活力與增殖，其中黃芪總皂苷、黃芪總黃酮和黃芪多糖的作用較為顯著。5.3.2炎癥與氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)變化在炎癥相關(guān)指標(biāo)方面，采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測細(xì)胞上清液中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）的含量。結(jié)果顯示，與正常對照組相比，高糖處理組細(xì)胞上清液中TNF-α和IL-6的含量顯著升高，表明高糖環(huán)境誘導(dǎo)了細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。給予黃芪六一湯各藥效組分處理后，各給藥組細(xì)胞上清液中TNF-α和IL-6的含量均有不同程度的降低。黃芪總皂苷組在濃度為100μg/ml時，TNF-α和IL-6的含量顯著降低（P＜0.05）。黃芪總黃酮組在濃度為80μg/ml時，對TNF-α和IL-6的抑制作用明顯，含量顯著下降（P＜0.05）。黃芪多糖組在濃度為120μg/ml時，也能有效降低TNF-α和IL-6的含量（P＜0.05）。甘草酸組在濃度為60μg/ml時，可使TNF-α和IL-6的含量降低（P＜0.05）。這說明黃芪六一湯各藥效組分能夠抑制高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥反應(yīng)，減少炎癥因子的釋放，其中黃芪總皂苷、黃芪總黃酮和黃芪多糖的抗炎作用較為突出。在氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)方面，檢測細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性。結(jié)果表明，與正常對照組相比，高糖處理組細(xì)胞內(nèi)SOD活性和GSH-Px活性顯著降低，MDA含量顯著升高，說明高糖導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激水平升高，抗氧化能力下降。給予黃芪六一湯各藥效組分處理后，各給藥組細(xì)胞內(nèi)SOD活性和GSH-Px活性有不同程度的升高，MDA含量有不同程度的降低。黃芪總皂苷組在濃度為100μg/ml時，SOD活性和GSH-Px活性顯著升高，MDA含量顯著降低（P＜0.05）。黃芪總黃酮組在濃度為80μg/ml時，能有效提高SOD活性和GSH-Px活性，降低MDA含量（P＜0.05）。黃芪多糖組在濃度為120μg/ml時，對細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激指標(biāo)的改善作用明顯，SOD活性和GSH-Px活性升高，MDA含量降低（P＜0.05）。甘草酸組在濃度為60μg/ml時，也能使SOD活性和GSH-Px活性升高，MDA含量降低（P＜0.05）。這表明黃芪六一湯各藥效組分能夠增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力，減輕氧化應(yīng)激損傷，其中黃芪總皂苷、黃芪總黃酮和黃芪多糖的抗氧化作用較為顯著。5.4篩選結(jié)果總結(jié)綜合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，明確黃芪總皂苷、黃芪總黃酮、黃芪多糖及甘草酸為黃芪六一湯抗2型糖尿病腎病的主要藥效組分。黃芪總皂苷在降低血糖、改善腎功能、減輕腎臟病理損傷等方面表現(xiàn)突出，能夠顯著降低空腹血糖和糖化血紅蛋白水平，減少血肌酐、尿素氮和尿白蛋白的排泄，抑制腎小球系膜細(xì)胞增生和基質(zhì)增多，減輕基底膜增厚，對腎臟具有全面而有效的保護(hù)作用。黃芪總黃酮具有顯著的抗炎