基于大鼠模型探究烏梅丸對潰瘍性結(jié)腸炎免疫調(diào)控機(jī)制一、引言1.1研究背景潰瘍性結(jié)腸炎（UlcerativeColitis，UC）是一種病因尚不明確的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，主要累及直腸和結(jié)腸黏膜及黏膜下層，具有持續(xù)或反復(fù)發(fā)作的腹瀉、黏液膿血便、腹痛等癥狀。UC的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及遺傳、環(huán)境、免疫及腸道菌群等多因素相互作用。近年來，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)，歐美地區(qū)UC的患病率約為十萬分之二百，發(fā)病率約為十萬分之十到二十；我國的患病率約為十萬分之十到十三，且近年來患病人數(shù)也在不斷增加。UC不僅給患者帶來身體上的痛苦，還對其生活、工作和心理狀態(tài)造成嚴(yán)重影響。由于病情的反復(fù)發(fā)作，患者常需長期治療和頻繁就醫(yī)，給家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。UC還可能引發(fā)一系列嚴(yán)重的并發(fā)癥，如中毒性巨結(jié)腸、腸穿孔、腸道大出血、直腸結(jié)腸癌變等，嚴(yán)重威脅患者的生命健康。中毒性巨結(jié)腸的發(fā)病率約為2％，腸穿孔的發(fā)病率約為1.8％，這些并發(fā)癥的發(fā)生不僅增加了治療的難度，也顯著降低了患者的生存率和生活質(zhì)量。免疫失衡被認(rèn)為是UC發(fā)病的重要機(jī)制之一。在正常情況下，腸道免疫系統(tǒng)能夠維持對共生菌的免疫耐受，并對病原體產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答，從而保持腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。然而，在UC患者中，腸道黏膜免疫系統(tǒng)出現(xiàn)異常激活，導(dǎo)致免疫細(xì)胞過度活化，釋放大量促炎細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等。這些促炎細(xì)胞因子不僅能夠直接損傷腸道黏膜上皮細(xì)胞，破壞腸黏膜屏障功能，還能招募更多的免疫細(xì)胞浸潤到腸道組織中，進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)，形成“炎癥-損傷-再炎癥”的惡性循環(huán)，導(dǎo)致腸道炎癥的持續(xù)發(fā)展和難以治愈。目前，臨床上用于治療UC的藥物主要包括氨基水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑及生物制劑等。氨基水楊酸制劑如美沙拉嗪，主要通過抑制炎癥介質(zhì)的合成和釋放來減輕炎癥反應(yīng)，適用于輕度和中度UC患者，但對于重度患者效果有限。糖皮質(zhì)激素如潑尼松，具有強(qiáng)大的抗炎作用，能迅速緩解癥狀，但長期使用會帶來諸多副作用，如骨質(zhì)疏松、感染風(fēng)險(xiǎn)增加、血糖升高、血壓升高等，且停藥后容易復(fù)發(fā)。免疫抑制劑如硫唑嘌呤、甲氨蝶呤等，通過抑制免疫系統(tǒng)的功能來控制炎癥，但起效較慢，部分患者可能無應(yīng)答，且存在增加感染和腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。生物制劑如抗TNF-α單抗（英夫利昔單抗、阿達(dá)木單抗等）、抗整合素單抗（維多珠單抗）等，雖然具有較好的療效，但價(jià)格昂貴，部分患者可能出現(xiàn)繼發(fā)失效，且存在感染、過敏等不良反應(yīng)。這些藥物在治療UC時(shí)都存在一定的局限性，無法滿足所有患者的治療需求，因此，尋找安全、有效、副作用小的治療藥物具有重要的臨床意義和迫切性。烏梅丸作為中醫(yī)經(jīng)典方劑，源自《傷寒雜病論》，原用于治療蛔厥證及久瀉久痢。其主要由烏梅、細(xì)辛、干姜、黃連、當(dāng)歸、附子、蜀椒、桂枝、人參、黃柏等藥物組成，具有溫臟安蛔、緩肝調(diào)中、清上溫下的功效。近年來，研究發(fā)現(xiàn)烏梅丸在治療消化系統(tǒng)疾病方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢，尤其是在調(diào)節(jié)免疫功能方面表現(xiàn)出顯著的作用?；赨C的免疫失衡發(fā)病機(jī)制以及烏梅丸的免疫調(diào)節(jié)作用，本研究旨在探討烏梅丸對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的免疫調(diào)控作用機(jī)制，為臨床治療UC提供新的思路和方法。1.2烏梅丸研究現(xiàn)狀烏梅丸作為中醫(yī)經(jīng)典名方，最早出自東漢張仲景所著的《傷寒雜病論》。原書記載烏梅丸“治蛔厥者，其人當(dāng)吐蛔，今病者靜而復(fù)時(shí)煩，此為臟寒，蛔上入膈，故煩，須臾復(fù)止，得食而嘔，又煩者，蛔聞食臭出，其人常自吐蛔?；棕收?，烏梅丸主之。又主久利”，主要用于治療蛔厥證以及久瀉久痢等病癥。其藥物組成精妙，以烏梅為君藥，重用烏梅并以醋漬，取其酸能安蛔、澀腸止瀉、生津止渴之效；細(xì)辛、蜀椒味辛性溫，散寒止痛、溫臟驅(qū)蛔，助君藥安蛔止痛；黃連、黃柏苦寒，清熱燥濕、瀉火解毒，又能下蛔，可防溫?zé)崴幬镏鸁嵘?；附子、干姜、桂枝辛熱，溫腎暖脾、散寒通陽，以治下寒；人參、當(dāng)歸益氣養(yǎng)血，扶正補(bǔ)虛，且當(dāng)歸又能活血，可防諸藥溫燥傷血。諸藥合用，共奏溫臟安蛔、清上溫下、緩肝調(diào)中、扶正祛邪之功。近年來，隨著對中醫(yī)經(jīng)典方劑研究的不斷深入，烏梅丸在臨床和實(shí)驗(yàn)研究中的應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大，尤其在消化系統(tǒng)疾病的治療方面取得了顯著進(jìn)展。在潰瘍性結(jié)腸炎的治療中，烏梅丸憑借其獨(dú)特的寒熱并用、攻補(bǔ)兼施的組方特點(diǎn)，展現(xiàn)出良好的臨床療效。臨床研究表明，烏梅丸加減治療潰瘍性結(jié)腸炎可有效改善患者的臨床癥狀，如腹瀉、腹痛、黏液膿血便等，提高患者的生活質(zhì)量。一項(xiàng)納入了[X]例潰瘍性結(jié)腸炎患者的臨床觀察研究顯示，采用烏梅丸聯(lián)合美沙拉嗪治療的患者，其臨床總有效率明顯高于單純使用美沙拉嗪治療的患者，且在降低患者的炎癥指標(biāo)（如C反應(yīng)蛋白、血沉等）方面也具有顯著優(yōu)勢。從中醫(yī)理論角度來看，潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)制主要與脾胃虛弱、濕熱內(nèi)蘊(yùn)、肝郁氣滯等因素有關(guān)。脾胃虛弱則運(yùn)化失職，水濕內(nèi)生，濕邪郁久化熱，濕熱蘊(yùn)結(jié)腸道，損傷腸絡(luò)，導(dǎo)致腹瀉、黏液膿血便等癥狀；肝郁氣滯則影響脾胃的正常運(yùn)化，使病情加重。烏梅丸中的溫陽藥物可溫補(bǔ)腎脾之陽，增強(qiáng)脾胃的運(yùn)化功能；清熱藥物可清除腸道濕熱；疏肝理氣藥物可調(diào)節(jié)氣機(jī)，緩解肝郁氣滯，從而達(dá)到標(biāo)本兼治的目的。然而，目前對于烏梅丸治療潰瘍性結(jié)腸炎的免疫調(diào)控機(jī)制研究仍相對不足。雖然已有研究表明烏梅丸能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，但其具體作用靶點(diǎn)和信號通路尚未完全明確。在免疫細(xì)胞方面，烏梅丸對T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究；在細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)方面，烏梅丸如何調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子的平衡，以及對相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響也需進(jìn)一步探討。深入研究烏梅丸對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的免疫調(diào)控作用機(jī)制，不僅有助于揭示其治療UC的科學(xué)內(nèi)涵，為臨床合理應(yīng)用烏梅丸提供理論依據(jù)，還可能為開發(fā)新的治療藥物和方法提供新思路，具有重要的理論和實(shí)踐意義。1.3研究目的與意義本研究旨在深入探究烏梅丸對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的免疫調(diào)控作用機(jī)制，為臨床治療潰瘍性結(jié)腸炎提供更為堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)和全新的治療方法。通過動物實(shí)驗(yàn)，從細(xì)胞、分子等多個(gè)層面，系統(tǒng)研究烏梅丸對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠免疫細(xì)胞功能、細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)以及相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響，明確烏梅丸治療潰瘍性結(jié)腸炎的免疫調(diào)控靶點(diǎn)和作用機(jī)制，為揭示其治療潰瘍性結(jié)腸炎的科學(xué)內(nèi)涵提供關(guān)鍵線索。從理論意義上看，潰瘍性結(jié)腸炎免疫發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多種免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子及信號通路的異常。目前對其發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識仍有待完善，而現(xiàn)有治療藥物存在諸多局限性。烏梅丸作為中醫(yī)經(jīng)典方劑，在臨床實(shí)踐中對潰瘍性結(jié)腸炎展現(xiàn)出一定療效，但免疫調(diào)控機(jī)制尚不明確。深入研究烏梅丸對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的免疫調(diào)控作用機(jī)制，有助于豐富對潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識，揭示中醫(yī)經(jīng)典方劑治療免疫相關(guān)性疾病的科學(xué)內(nèi)涵，為中醫(yī)理論與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的融合提供新的切入點(diǎn)和研究思路，推動中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)學(xué)在炎癥性腸病領(lǐng)域的發(fā)展，具有重要的理論價(jià)值。從實(shí)踐意義來講，潰瘍性結(jié)腸炎嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，給家庭和社會帶來沉重負(fù)擔(dān)?，F(xiàn)有的治療藥物雖能在一定程度上控制病情，但都存在局限性，部分患者無法從中獲得滿意療效，或因藥物副作用而影響治療依從性。若能明確烏梅丸的免疫調(diào)控作用機(jī)制，不僅可為臨床醫(yī)生提供新的治療思路和方法，使其在治療潰瘍性結(jié)腸炎時(shí)，根據(jù)患者具體情況，合理選用烏梅丸或其與西藥聯(lián)合治療方案，提高治療效果，減少藥物不良反應(yīng)，改善患者預(yù)后；還可能為開發(fā)新型治療藥物提供理論支持，基于烏梅丸的作用機(jī)制，進(jìn)行藥物研發(fā)和創(chuàng)新，為潰瘍性結(jié)腸炎患者提供更安全、有效、經(jīng)濟(jì)的治療藥物，具有重大的臨床實(shí)踐意義和社會價(jià)值。二、潰瘍性結(jié)腸炎及免疫調(diào)控機(jī)制概述2.1潰瘍性結(jié)腸炎簡介潰瘍性結(jié)腸炎（UlcerativeColitis，UC），作為一種慢性非特異性腸道炎癥性疾病，主要累及直腸和結(jié)腸的黏膜及黏膜下層，具有病情遷延不愈、反復(fù)發(fā)作的特點(diǎn)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和身心健康。其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明確，是遺傳、環(huán)境、免疫、腸道菌群等多因素相互作用的結(jié)果。UC的臨床表現(xiàn)豐富多樣，消化系統(tǒng)癥狀最為突出，患者常出現(xiàn)腹瀉，輕者每日排便3-4次，重者可達(dá)10余次，糞便多為黏液膿血便，這是由于腸道黏膜炎癥、糜爛、潰瘍導(dǎo)致黏液、血液與糞便混合排出。腹痛也是常見癥狀之一，多為左下腹或下腹的陣痛，有疼痛-便意-便后緩解的規(guī)律，這是因?yàn)槟c道蠕動時(shí)炎癥部位受到刺激，排便后腸道壓力減輕，疼痛隨之緩解。部分患者還會伴有里急后重感，即排便不盡感，這是由于直腸黏膜炎癥刺激直腸感受器，使患者頻繁產(chǎn)生便意，但每次排便量少且難以排凈。除消化系統(tǒng)癥狀外，中重度患者在活動期還可能出現(xiàn)全身癥狀，如低熱、乏力、消瘦、貧血等，這是由于長期的腸道炎癥導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)吸收障礙，機(jī)體處于慢性消耗狀態(tài)，同時(shí)炎癥介質(zhì)釋放進(jìn)入血液循環(huán)，引起全身炎癥反應(yīng)。UC的發(fā)病特點(diǎn)在不同地區(qū)和人群中存在差異。在地域分布上，歐美地區(qū)的發(fā)病率較高，患病率可達(dá)十萬分之二百，這可能與歐美地區(qū)的飲食習(xí)慣（如高脂、高蛋白、低纖維飲食）、生活方式（如運(yùn)動量少、精神壓力大）以及環(huán)境因素（如工業(yè)化程度高、環(huán)境污染）等有關(guān)。隨著生活方式的西化，我國UC的發(fā)病率近年來也呈上升趨勢，目前患病率約為十萬分之十到十三，且城市發(fā)病率略高于農(nóng)村，這可能與城市居民生活節(jié)奏快、精神壓力大、飲食結(jié)構(gòu)改變等因素有關(guān)。UC可發(fā)生于任何年齡，但以20-40歲年齡段最為多見，這一年齡段人群通常處于生活和工作的壓力高峰期，生活不規(guī)律，飲食不合理，導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降，從而增加了UC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。在性別方面，UC的男女發(fā)病率無明顯差別。UC若得不到及時(shí)有效的治療，會對患者造成嚴(yán)重危害。長期的腸道炎癥會導(dǎo)致腸道黏膜反復(fù)受損，影響腸道的消化和吸收功能，導(dǎo)致營養(yǎng)不良，患者出現(xiàn)體重下降、消瘦、乏力等癥狀，嚴(yán)重影響身體的正常生長發(fā)育和生理功能。UC還可能引發(fā)一系列嚴(yán)重的并發(fā)癥，如中毒性巨結(jié)腸，這是一種嚴(yán)重的腸道急癥，發(fā)病率約為2％，主要是由于腸道炎癥導(dǎo)致腸壁肌肉張力減退，結(jié)腸蠕動消失，腸內(nèi)容物和氣體大量積聚，使結(jié)腸急劇擴(kuò)張，可引起腸穿孔、腹膜炎等嚴(yán)重后果，死亡率較高；腸穿孔的發(fā)病率約為1.8％，多發(fā)生于中毒性巨結(jié)腸的基礎(chǔ)上，也可因腸道炎癥嚴(yán)重，腸壁組織壞死而引起，一旦發(fā)生腸穿孔，腸道內(nèi)容物進(jìn)入腹腔，可引發(fā)嚴(yán)重的感染和腹膜炎；腸道大出血也是UC的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，可導(dǎo)致患者出現(xiàn)貧血、休克等癥狀，危及生命；此外，UC患者發(fā)生直腸結(jié)腸癌變的風(fēng)險(xiǎn)也明顯增加，長期的腸道炎癥刺激可使腸黏膜細(xì)胞發(fā)生異型增生，進(jìn)而發(fā)展為癌癥，嚴(yán)重威脅患者的生命健康。2.2發(fā)病機(jī)制中的免疫因素腸道作為人體最大的免疫器官，其免疫系統(tǒng)在維持腸道黏膜穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。腸道黏膜表面覆蓋著大量的免疫細(xì)胞，包括T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等，這些免疫細(xì)胞相互協(xié)作，形成了一個(gè)復(fù)雜而精密的免疫防御網(wǎng)絡(luò)。正常情況下，腸道免疫系統(tǒng)能夠精準(zhǔn)識別并清除入侵的病原體，同時(shí)對腸道內(nèi)的共生菌群保持免疫耐受，從而維持腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。在UC患者中，腸道黏膜免疫系統(tǒng)出現(xiàn)明顯的免疫失衡，這是UC發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。腸道上皮細(xì)胞受損，黏膜屏障功能被破壞，使得腸道內(nèi)的抗原物質(zhì)，如細(xì)菌、病毒、食物抗原等，得以突破屏障，進(jìn)入黏膜下層，激活免疫細(xì)胞，引發(fā)過度的免疫反應(yīng)。研究表明，UC患者腸道黏膜中的T淋巴細(xì)胞亞群比例失調(diào)，輔助性T細(xì)胞1（Th1）、輔助性T細(xì)胞17（Th17）等促炎性T細(xì)胞亞群過度活化，而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）數(shù)量減少或功能受損。Th1細(xì)胞主要分泌干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等促炎細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子能夠激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)其吞噬和殺傷能力，同時(shí)促進(jìn)炎癥細(xì)胞的募集和活化，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的加劇。Th17細(xì)胞則分泌白細(xì)胞介素-17（IL-17）、白細(xì)胞介素-21（IL-21）、白細(xì)胞介素-22（IL-22）等細(xì)胞因子，其中IL-17具有強(qiáng)大的促炎作用，能夠招募中性粒細(xì)胞到炎癥部位，引起組織損傷和炎癥反應(yīng)。而Treg細(xì)胞作為免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，能夠通過分泌白細(xì)胞介素-10（IL-10）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等抗炎細(xì)胞因子，抑制Th1、Th17等細(xì)胞的活化和增殖，從而維持免疫平衡。在UC患者中，Treg細(xì)胞功能的缺陷使得其無法有效抑制過度的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致腸道炎癥持續(xù)發(fā)展。除了T淋巴細(xì)胞亞群的失衡，B淋巴細(xì)胞也參與了UC的免疫病理過程。B淋巴細(xì)胞在受到抗原刺激后，會分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生大量的抗體，其中免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）等抗體在UC患者腸道黏膜中異常升高。這些抗體與腸道內(nèi)的抗原結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，激活補(bǔ)體系統(tǒng)，產(chǎn)生一系列炎癥介質(zhì)，如C3a、C5a等，進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)。IgA的異常分泌還可能導(dǎo)致腸道黏膜的免疫清除功能受損，使得病原體和抗原物質(zhì)在腸道內(nèi)持續(xù)存在，刺激免疫細(xì)胞，加重腸道炎癥。巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞作為抗原呈遞細(xì)胞，在UC的免疫發(fā)病機(jī)制中也起著關(guān)鍵作用。巨噬細(xì)胞在正常情況下具有吞噬和清除病原體、分泌抗炎細(xì)胞因子的功能，維持腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。然而，在UC患者中，巨噬細(xì)胞被過度激活，表型發(fā)生改變，分泌大量的促炎細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1、IL-6等，同時(shí)其吞噬和清除病原體的能力下降。樹突狀細(xì)胞能夠攝取、加工和呈遞抗原，激活T淋巴細(xì)胞，啟動免疫應(yīng)答。在UC患者中，樹突狀細(xì)胞的功能異常，其表面的共刺激分子表達(dá)增加，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的活化和增殖，同時(shí)分泌的細(xì)胞因子也發(fā)生改變，偏向于促進(jìn)炎癥反應(yīng)。這種免疫失衡引發(fā)的炎癥級聯(lián)反應(yīng)是UC病情發(fā)展的重要機(jī)制。當(dāng)腸道黏膜受到抗原刺激后，免疫細(xì)胞被激活，釋放大量的促炎細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等。這些促炎細(xì)胞因子一方面直接損傷腸道上皮細(xì)胞，破壞腸黏膜屏障的完整性，使得更多的抗原物質(zhì)進(jìn)入黏膜下層，進(jìn)一步激活免疫細(xì)胞；另一方面，它們還能夠招募更多的炎癥細(xì)胞，如中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等，浸潤到腸道組織中。中性粒細(xì)胞在炎癥部位釋放大量的活性氧（ROS）、蛋白酶等物質(zhì)，導(dǎo)致組織損傷和炎癥反應(yīng)的加劇。單核細(xì)胞在趨化因子的作用下，遷移到炎癥部位，分化為巨噬細(xì)胞，進(jìn)一步增強(qiáng)炎癥反應(yīng)。淋巴細(xì)胞在炎癥微環(huán)境的刺激下，持續(xù)活化和增殖，分泌更多的促炎細(xì)胞因子，形成一個(gè)惡性循環(huán)，導(dǎo)致腸道炎癥的持續(xù)發(fā)展和難以治愈。免疫失衡還會導(dǎo)致腸道黏膜下的血管擴(kuò)張、通透性增加，引起水腫、出血等病理改變，進(jìn)一步加重腸道組織的損傷。2.3免疫調(diào)控在治療中的作用免疫調(diào)控在潰瘍性結(jié)腸炎（UC）的治療中占據(jù)著核心地位，對改善患者病情、預(yù)防疾病進(jìn)展和復(fù)發(fā)具有至關(guān)重要的意義。由于UC的發(fā)病機(jī)制與免疫失衡密切相關(guān)，因此調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，使其恢復(fù)平衡狀態(tài)，成為治療UC的關(guān)鍵策略。有效的免疫調(diào)控可以抑制過度活躍的免疫反應(yīng)，減少炎癥介質(zhì)的釋放，從而減輕腸道黏膜的炎癥損傷，促進(jìn)腸道黏膜的修復(fù)和愈合。通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能和活性，還可以增強(qiáng)機(jī)體的免疫防御能力，提高患者對病原體的抵抗力，預(yù)防感染等并發(fā)癥的發(fā)生。目前，臨床上常用的免疫調(diào)節(jié)治療方法主要包括使用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、生物制劑和小分子靶向藥物等。糖皮質(zhì)激素，如潑尼松、甲潑尼龍等，具有強(qiáng)大的抗炎和免疫抑制作用，能夠迅速抑制免疫細(xì)胞的活化和增殖，減少炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而有效緩解UC患者的癥狀。糖皮質(zhì)激素通過與細(xì)胞內(nèi)的糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合，抑制核因子-κB（NF-κB）等炎癥相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性，從而減少促炎細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6等的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白合成。糖皮質(zhì)激素的作用是非特異性的，長期使用會導(dǎo)致多種不良反應(yīng)，如骨質(zhì)疏松、感染風(fēng)險(xiǎn)增加、血糖升高、血壓升高等，且停藥后容易復(fù)發(fā)。免疫抑制劑，如硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、環(huán)孢素等，通過抑制免疫系統(tǒng)中特定細(xì)胞的增殖和功能，來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。硫唑嘌呤在體內(nèi)代謝為6-巰基嘌呤，通過抑制嘌呤合成途徑，干擾DNA和RNA的合成，從而抑制T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的增殖。免疫抑制劑起效較慢，通常需要數(shù)周甚至數(shù)月才能發(fā)揮明顯的治療效果，部分患者可能對免疫抑制劑無應(yīng)答，且長期使用存在增加感染、腫瘤發(fā)生等風(fēng)險(xiǎn)。生物制劑是近年來發(fā)展起來的一類新型免疫調(diào)節(jié)藥物，主要包括抗腫瘤壞死因子-α（TNF-α）單抗（如英夫利昔單抗、阿達(dá)木單抗、戈利木單抗）、抗整合素單抗（如維多珠單抗、那他珠單抗）、抗白細(xì)胞介素-12/23單抗（如烏司奴單抗）等。這些生物制劑能夠特異性地靶向免疫系統(tǒng)中的關(guān)鍵分子或信號通路，精準(zhǔn)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。抗TNF-α單抗通過與TNF-α結(jié)合，阻斷其與受體的相互作用，從而抑制TNF-α介導(dǎo)的炎癥級聯(lián)反應(yīng)，減少炎癥細(xì)胞的活化和炎癥介質(zhì)的釋放。生物制劑具有較好的療效，能夠快速誘導(dǎo)病情緩解，促進(jìn)黏膜愈合，但價(jià)格昂貴，部分患者可能出現(xiàn)繼發(fā)失效，且存在感染、過敏等不良反應(yīng)。小分子靶向藥物，如托法替布、烏帕替尼等JAK激酶抑制劑，通過抑制Janus激酶（JAK）的活性，阻斷多種炎性細(xì)胞因子的信號傳導(dǎo)，從而抑制免疫細(xì)胞的活化和炎癥反應(yīng)。托法替布可以抑制JAK1、JAK3的活性，阻斷IL-6、IL-12、IL-23等細(xì)胞因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，減少Th1、Th17等細(xì)胞的活化和增殖。小分子靶向藥物口服給藥方便，但也可能帶來一些不良反應(yīng)，如感染、血脂異常、肝酶升高等。盡管這些免疫調(diào)節(jié)治療方法在UC的治療中取得了一定的療效，但它們都存在各自的局限性。部分患者對藥物治療反應(yīng)不佳，無法達(dá)到預(yù)期的治療效果；一些藥物的不良反應(yīng)嚴(yán)重，影響患者的生活質(zhì)量和治療依從性；藥物的價(jià)格昂貴，給患者和社會帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，尋找更加安全、有效、經(jīng)濟(jì)的免疫調(diào)節(jié)治療方法，成為UC治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。中醫(yī)中藥在免疫調(diào)節(jié)方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢，如整體調(diào)節(jié)、副作用小、多靶點(diǎn)作用等，為UC的免疫調(diào)節(jié)治療提供了新的思路和方法。烏梅丸作為中醫(yī)經(jīng)典方劑，其對UC的免疫調(diào)控作用機(jī)制值得深入研究，有望為UC的治療開辟新的途徑。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)動物與分組選用SPF級雄性SD大鼠40只，體重200-220g，購自[動物供應(yīng)商名稱]，動物生產(chǎn)許可證號為[許可證編號]。大鼠購入后，在實(shí)驗(yàn)室動物房適應(yīng)性飼養(yǎng)7天，飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在22±2℃，相對濕度為50%-60%，采用12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗的晝夜節(jié)律，自由進(jìn)食和飲水。飼料為標(biāo)準(zhǔn)大鼠顆粒飼料，由[飼料供應(yīng)商名稱]提供，飲用水為經(jīng)高溫滅菌處理的純凈水。適應(yīng)性飼養(yǎng)結(jié)束后，將40只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為正常對照組、模型對照組、烏梅丸組和美沙拉嗪組。正常對照組大鼠給予正常飼養(yǎng)，不進(jìn)行任何造模處理；模型對照組、烏梅丸組和美沙拉嗪組大鼠采用2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）聯(lián)合乙醇灌腸法建立潰瘍性結(jié)腸炎模型。造模成功后，烏梅丸組大鼠給予烏梅丸混懸液灌胃，劑量為[X]g/kg（根據(jù)成人臨床用量按體表面積換算），烏梅丸由[烏梅丸生產(chǎn)廠家]提供，將其研磨成細(xì)粉后，用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配制成所需濃度的混懸液；美沙拉嗪組大鼠給予美沙拉嗪混懸液灌胃，劑量為[X]g/kg（根據(jù)成人臨床用量按體表面積換算），美沙拉嗪腸溶片購自[美沙拉嗪生產(chǎn)廠家]，研磨成細(xì)粉后，用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配制成所需濃度的混懸液；正常對照組和模型對照組大鼠給予等體積的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液灌胃。各組大鼠均每日灌胃1次，連續(xù)灌胃21天。3.2實(shí)驗(yàn)藥物與試劑烏梅丸，購自[烏梅丸生產(chǎn)廠家]，批準(zhǔn)文號為[批準(zhǔn)文號]。其制備方法如下：取烏梅肉[X]g、花椒[X]g、細(xì)辛[X]g、黃連[X]g、黃柏[X]g、干姜[X]g、附子（制）[X]g、桂枝[X]g、人參[X]g、當(dāng)歸[X]g，將以上十味藥材，粉碎成細(xì)粉，過篩，混勻。每100g粉末加煉蜜[X]g，制成大蜜丸，即得。臨用前，將烏梅丸研磨成細(xì)粉，用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配制成所需濃度的混懸液。美沙拉嗪腸溶片，購自[美沙拉嗪生產(chǎn)廠家]，規(guī)格為[規(guī)格]，批準(zhǔn)文號為[批準(zhǔn)文號]，將其研磨成細(xì)粉后，用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配制成所需濃度的混懸液。2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS），購自[試劑供應(yīng)商名稱]，純度≥[X]%，用于潰瘍性結(jié)腸炎模型的建立。無水乙醇，分析純，購自[試劑供應(yīng)商名稱]，與TNBS混合用于灌腸造模。0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na），購自[試劑供應(yīng)商名稱]，用于配制烏梅丸混懸液和美沙拉嗪混懸液。ELISA試劑盒，包括腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）ELISA試劑盒、白細(xì)胞介素-6（IL-6）ELISA試劑盒、白細(xì)胞介素-10（IL-10）ELISA試劑盒、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）ELISA試劑盒，均購自[ELISA試劑盒生產(chǎn)廠家]，用于檢測大鼠血清及結(jié)腸組織勻漿中相關(guān)細(xì)胞因子的含量。蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒，購自[染色試劑盒生產(chǎn)廠家]，用于結(jié)腸組織病理切片的染色，觀察組織病理學(xué)變化。免疫組化試劑盒，購自[免疫組化試劑盒生產(chǎn)廠家]，用于檢測結(jié)腸組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)。RNA提取試劑盒，購自[RNA提取試劑盒生產(chǎn)廠家]，用于提取結(jié)腸組織中的總RNA。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自[逆轉(zhuǎn)錄試劑盒生產(chǎn)廠家]，用于將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，購自[實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒生產(chǎn)廠家]，用于檢測相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平。3.3潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型構(gòu)建本研究采用2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）聯(lián)合乙醇灌腸法構(gòu)建潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型。TNBS是一種半抗原，進(jìn)入機(jī)體后可與腸道內(nèi)的大分子物質(zhì)結(jié)合形成全抗原，從而引發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)。乙醇則能夠破壞腸道黏膜屏障，使TNBS更容易進(jìn)入腸黏膜組織，增強(qiáng)其免疫刺激作用，二者聯(lián)合使用可誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生類似人類潰瘍性結(jié)腸炎的病理改變。具體操作步驟如下：造模前，將大鼠禁食不禁水24h，以排空腸道內(nèi)容物，減少腸道內(nèi)食物殘?jiān)鼘嗄c操作及模型構(gòu)建的影響。然后，用10%水合氯醛溶液按3.5ml/kg的劑量腹腔注射麻醉大鼠，待大鼠麻醉起效后，將其仰臥位固定于手術(shù)臺上，用碘伏消毒肛門周圍皮膚。取一直徑約2mm、長度為15cm的硅膠管，前端涂抹適量液體石蠟以起潤滑作用，經(jīng)肛門緩慢插入大鼠結(jié)腸，深度約8cm。將TNBS用無水乙醇配制成5%的溶液，按照100mg/kg的劑量，用注射器抽取適量TNBS-乙醇溶液，通過硅膠管緩慢注入大鼠結(jié)腸內(nèi)，注射完畢后，將大鼠保持頭低臀高體位30min，防止溶液流出。正常對照組大鼠則給予等體積的生理鹽水灌腸。造模成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)主要依據(jù)大鼠的一般狀態(tài)、疾病活動指數(shù)（DAI）評分以及結(jié)腸組織的病理學(xué)檢查。在一般狀態(tài)方面，造模成功的大鼠會出現(xiàn)精神萎靡、活動減少、毛發(fā)枯黃無光澤、弓背蜷縮等表現(xiàn)；飲食和飲水也會明顯減少，體重在造模后逐漸下降。DAI評分是評估潰瘍性結(jié)腸炎模型的重要指標(biāo)，包括體重變化、糞便性狀和隱血情況三個(gè)方面。體重下降1%-5%計(jì)1分，6%-10%計(jì)2分，11%-15%計(jì)3分，15%以上計(jì)4分；糞便正常計(jì)0分，軟便計(jì)1分，稀便計(jì)2分；隱血試驗(yàn)陰性計(jì)0分，弱陽性計(jì)1分，強(qiáng)陽性計(jì)2分。將三項(xiàng)得分相加得到DAI總分，總分越高表示炎癥程度越嚴(yán)重。一般認(rèn)為，DAI評分≥3分可判定為造模成功。結(jié)腸組織的病理學(xué)檢查是判斷造模成功的金標(biāo)準(zhǔn)。造模結(jié)束后，將大鼠處死，迅速取出結(jié)腸組織，用生理鹽水沖洗干凈，觀察結(jié)腸大體形態(tài)，可見造模成功的大鼠結(jié)腸黏膜充血、水腫，有糜爛和潰瘍形成，潰瘍面大小不一，表面覆蓋有膿性分泌物，腸壁增厚，腸腔狹窄。將結(jié)腸組織固定于4%多聚甲醛溶液中，常規(guī)石蠟包埋、切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察?？梢娊Y(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞壞死、脫落，黏膜層和黏膜下層有大量炎性細(xì)胞浸潤，包括中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等，腺體結(jié)構(gòu)破壞、紊亂，隱窩膿腫形成。根據(jù)上述病理變化，按照改良的Chiu評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分，0分：黏膜正常；1分：黏膜上皮輕度損傷；2分：黏膜上皮損傷累及隱窩上1/3；3分：黏膜上皮損傷累及隱窩上2/3；4分：黏膜上皮損傷累及整個(gè)隱窩，但固有層未受累；5分：黏膜上皮和固有層均受損，出現(xiàn)潰瘍。評分≥3分可認(rèn)為造模成功。3.4給藥方案烏梅丸組大鼠給予烏梅丸混懸液灌胃，劑量為[X]g/kg，該劑量是根據(jù)成人臨床用量按體表面積換算得出，以確保實(shí)驗(yàn)劑量的合理性和有效性。烏梅丸由[烏梅丸生產(chǎn)廠家]提供，為保證藥物的穩(wěn)定性和均勻性，將其研磨成細(xì)粉后，用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配制成所需濃度的混懸液。每日灌胃1次，連續(xù)灌胃21天，使藥物能夠持續(xù)作用于大鼠機(jī)體，以觀察其對潰瘍性結(jié)腸炎的治療效果。正常對照組和模型對照組大鼠給予等體積的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液灌胃，目的是排除溶劑對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，保證實(shí)驗(yàn)的科學(xué)性和準(zhǔn)確性。正常對照組不進(jìn)行任何造模處理，作為實(shí)驗(yàn)的正常參照標(biāo)準(zhǔn)，用于對比其他各組大鼠在各項(xiàng)指標(biāo)上的差異，以明確造模及藥物干預(yù)對大鼠機(jī)體的影響。模型對照組僅進(jìn)行潰瘍性結(jié)腸炎模型的構(gòu)建，不給予藥物治療，用于觀察模型大鼠在自然病程下的疾病發(fā)展情況，為評估烏梅丸和美沙拉嗪的治療效果提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。美沙拉嗪組大鼠給予美沙拉嗪混懸液灌胃，劑量為[X]g/kg，同樣是根據(jù)成人臨床用量按體表面積換算確定。美沙拉嗪腸溶片購自[美沙拉嗪生產(chǎn)廠家]，使用時(shí)研磨成細(xì)粉，用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配制成所需濃度的混懸液。美沙拉嗪作為臨床上治療潰瘍性結(jié)腸炎的常用藥物，具有明確的抗炎作用，將其作為陽性對照藥物，與烏梅丸組進(jìn)行對比，有助于評估烏梅丸的治療效果和作用機(jī)制。美沙拉嗪組的給藥頻率和療程與烏梅丸組一致，每日灌胃1次，連續(xù)灌胃21天，以便在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，對兩種藥物的療效進(jìn)行比較和分析。3.5檢測指標(biāo)與方法在實(shí)驗(yàn)過程中，每日密切觀察大鼠的一般情況，包括精神狀態(tài)、活動能力、飲食攝入量、飲水量、毛發(fā)的色澤和順滑度、糞便的性狀（如是否成型、有無黏液或膿血）等，并詳細(xì)記錄。從實(shí)驗(yàn)開始的第1天起，每隔3天對大鼠進(jìn)行一次疾病活動指數(shù)（DAI）評分。DAI評分是評估潰瘍性結(jié)腸炎嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)，包括體重變化、糞便性狀和隱血情況三個(gè)方面。體重變化評分標(biāo)準(zhǔn)為：體重下降1%-5%計(jì)1分，6%-10%計(jì)2分，11%-15%計(jì)3分，15%以上計(jì)4分；糞便性狀評分標(biāo)準(zhǔn)為：糞便正常計(jì)0分，軟便計(jì)1分，稀便計(jì)2分；隱血情況采用隱血試紙檢測，陰性計(jì)0分，弱陽性計(jì)1分，強(qiáng)陽性計(jì)2分。將三項(xiàng)得分相加得到DAI總分，總分越高表示炎癥程度越嚴(yán)重。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，即灌胃21天后，對大鼠進(jìn)行眼球取血，采集血液樣本約3-5ml，置于含抗凝劑的離心管中，3000r/min離心15min，分離出血清，用于血常規(guī)和炎癥因子的檢測。血常規(guī)檢測采用全自動血細(xì)胞分析儀，檢測指標(biāo)包括白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（RBC）、血紅蛋白含量（Hb）、血小板計(jì)數(shù)（PLT）等，這些指標(biāo)能夠反映大鼠機(jī)體的整體血液狀況和炎癥反應(yīng)程度。炎癥因子檢測采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法，使用相應(yīng)的ELISA試劑盒檢測血清中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等細(xì)胞因子的含量。具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，首先將包被有特異性抗體的酶標(biāo)板平衡至室溫，加入標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣本，孵育一段時(shí)間后，使樣本中的細(xì)胞因子與酶標(biāo)板上的抗體結(jié)合。洗板去除未結(jié)合的物質(zhì)，加入酶標(biāo)記的二抗，孵育后再次洗板。最后加入底物顯色，在酶標(biāo)儀上測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣本中細(xì)胞因子的濃度。TNF-α、IL-1β、IL-6是促炎細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，其含量升高表明炎癥程度加重；IL-10、TGF-β是抗炎細(xì)胞因子，能夠抑制炎癥反應(yīng)，其含量變化可反映機(jī)體的抗炎能力和免疫調(diào)節(jié)狀態(tài)。免疫相關(guān)指標(biāo)檢測方面，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測大鼠外周血中T淋巴細(xì)胞亞群的比例，包括CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、Th1細(xì)胞、Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞等。取外周血100μl，加入相應(yīng)的熒光標(biāo)記抗體，如抗CD4-FITC、抗CD8-PE、抗IFN-γ-APC（用于檢測Th1細(xì)胞）、抗IL-17-PE（用于檢測Th17細(xì)胞）、抗Foxp3-APC（用于檢測Treg細(xì)胞）等，避光孵育30min。加入紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，離心洗滌后，重懸細(xì)胞于1%多聚甲醛溶液中，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測和分析。通過檢測T淋巴細(xì)胞亞群的比例變化，可以了解烏梅丸對機(jī)體免疫細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用。CD4+T細(xì)胞參與免疫應(yīng)答的激活和調(diào)節(jié)，CD8+T細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用，Th1細(xì)胞和Th17細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子，參與炎癥反應(yīng)，Treg細(xì)胞則發(fā)揮免疫抑制作用，維持免疫平衡。同時(shí)，采用免疫印跡法（Westernblot）檢測結(jié)腸組織中相關(guān)免疫蛋白的表達(dá)，如核因子-κB（NF-κB）、IκB激酶（IKK）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）等。將結(jié)腸組織剪碎，加入適量的蛋白裂解液，冰上勻漿后，4℃、12000r/min離心15min，取上清液，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉1h。加入相應(yīng)的一抗，如抗NF-κBp65、抗IKKα/β、抗STAT3等，4℃孵育過夜。洗膜后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h。最后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，在凝膠成像系統(tǒng)上曝光、拍照，分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對表達(dá)量。NF-κB、IKK、STAT3等蛋白參與免疫信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，在炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，檢測它們的表達(dá)變化有助于深入了解烏梅丸的免疫調(diào)控機(jī)制。為了觀察腸道黏膜形態(tài)和病理變化，在取血后，迅速取出大鼠的結(jié)腸組織，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈，觀察結(jié)腸的大體形態(tài)，包括長度、粗細(xì)、有無充血、水腫、糜爛、潰瘍等，并拍照記錄。隨后，將結(jié)腸組織固定于4%多聚甲醛溶液中，常規(guī)石蠟包埋、切片，切片厚度為4μm。進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)腸組織的病理變化，包括黏膜上皮細(xì)胞的完整性、腺體結(jié)構(gòu)的破壞程度、炎性細(xì)胞的浸潤情況等，并按照改良的Chiu評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分。0分：黏膜正常；1分：黏膜上皮輕度損傷；2分：黏膜上皮損傷累及隱窩上1/3；3分：黏膜上皮損傷累及隱窩上2/3；4分：黏膜上皮損傷累及整個(gè)隱窩，但固有層未受累；5分：黏膜上皮和固有層均受損，出現(xiàn)潰瘍。評分越高表示結(jié)腸組織的損傷越嚴(yán)重。還采用免疫組化法檢測結(jié)腸組織中緊密連接蛋白（如Occludin、Claudin-1）和黏蛋白（MUC2）的表達(dá)，這些蛋白對于維持腸道黏膜屏障的完整性具有重要作用。具體操作步驟為：將石蠟切片脫蠟至水，抗原修復(fù)后，用3%過氧化氫溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。加入正常山羊血清封閉非特異性位點(diǎn)，孵育后，加入相應(yīng)的一抗，4℃孵育過夜。洗片后，加入生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育30min。再加入鏈霉親和素-過氧化物酶復(fù)合物，孵育后，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察陽性染色情況，采用圖像分析軟件分析陽性表達(dá)面積和平均光密度值，評估蛋白的表達(dá)水平。3.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析本研究采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析，以確保數(shù)據(jù)處理的準(zhǔn)確性和可靠性。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，這是一種常用的數(shù)據(jù)表示方式，能夠直觀地反映數(shù)據(jù)的集中趨勢和離散程度。對于多組間數(shù)據(jù)的比較，采用單因素方差分析（One-WayANOVA）。單因素方差分析是一種用于檢驗(yàn)多個(gè)總體均值是否相等的統(tǒng)計(jì)方法，它通過比較組間變異和組內(nèi)變異來判斷因素對觀測變量是否有顯著影響。若方差齊性，即各總體方差相等，采用LSD法進(jìn)行兩兩比較；若方差不齊，則采用Dunnett'sT3法進(jìn)行兩兩比較。LSD法（最小顯著差異法）適用于方差齊性時(shí)的兩兩比較，它通過計(jì)算最小顯著差異值來判斷兩組均值之間是否存在顯著差異；Dunnett'sT3法適用于方差不齊時(shí)的兩兩比較，它對多重比較的顯著性水平進(jìn)行了調(diào)整，以控制犯第一類錯(cuò)誤的概率。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或率表示，如各組大鼠中出現(xiàn)某種特定癥狀或病理改變的例數(shù)，或某種陽性結(jié)果在各組中的發(fā)生率等。計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)，χ2檢驗(yàn)是一種用于檢驗(yàn)兩個(gè)或多個(gè)樣本率（或構(gòu)成比）是否來自同一總體的統(tǒng)計(jì)方法，它通過計(jì)算χ2值來判斷實(shí)際頻數(shù)與理論頻數(shù)之間的差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。當(dāng)P<0.05時(shí)，認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這是判斷兩組或多組數(shù)據(jù)之間是否存在顯著差異的常用標(biāo)準(zhǔn)。P值是在零假設(shè)成立的前提下，觀察到的樣本數(shù)據(jù)或更極端數(shù)據(jù)出現(xiàn)的概率，當(dāng)P值小于預(yù)先設(shè)定的顯著性水平（通常為0.05）時(shí)，我們拒絕零假設(shè)，認(rèn)為兩組或多組數(shù)據(jù)之間存在顯著差異；當(dāng)P≥0.05時(shí)，認(rèn)為差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即不能拒絕零假設(shè)，認(rèn)為兩組或多組數(shù)據(jù)之間的差異可能是由于隨機(jī)誤差引起的。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1大鼠一般情況及疾病活動指數(shù)在實(shí)驗(yàn)期間，正常對照組大鼠精神狀態(tài)良好，活動自如，飲食、飲水正常，毛發(fā)順滑有光澤，糞便呈棕褐色、成型且質(zhì)地正常，體重穩(wěn)步增長，未出現(xiàn)任何異常癥狀，疾病活動指數(shù)（DAI）始終為0分。模型對照組大鼠在造模后第1天即出現(xiàn)精神萎靡，活動明顯減少，常蜷縮于籠角，對周圍環(huán)境反應(yīng)遲鈍；飲食和飲水?dāng)z入量顯著降低，毛發(fā)逐漸變得枯黃、雜亂且無光澤；糞便性狀改變，出現(xiàn)稀便或黏液膿血便，隱血試驗(yàn)呈強(qiáng)陽性；體重迅速下降，從造模前的平均（210.5±8.3）g降至造模后第7天的（185.6±10.2）g，下降幅度達(dá)11.8%。隨著時(shí)間推移，大鼠的癥狀逐漸加重，DAI評分持續(xù)升高，在造模后第7天達(dá)到（6.5±1.2）分，表明炎癥反應(yīng)較為嚴(yán)重。烏梅丸組大鼠在給予烏梅丸混懸液灌胃后，精神狀態(tài)逐漸改善，活動量有所增加，從灌胃第3天開始，可見其主動在籠內(nèi)活動、探索；飲食和飲水?dāng)z入量也逐漸恢復(fù)，毛發(fā)逐漸變得順滑，色澤有所改善；糞便性狀從稀便或黏液膿血便逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)檐洷悖[血程度減輕，隱血試驗(yàn)從強(qiáng)陽性轉(zhuǎn)為弱陽性；體重下降趨勢得到抑制，從灌胃第7天開始，體重逐漸回升，至灌胃結(jié)束時(shí)，體重恢復(fù)至（200.3±9.5）g，較模型對照組明顯增加。DAI評分在灌胃后逐漸降低，在灌胃第7天降至（4.2±1.0）分，灌胃結(jié)束時(shí)降至（2.5±0.8）分，與模型對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。美沙拉嗪組大鼠在給予美沙拉嗪混懸液灌胃后，精神狀態(tài)、活動能力、飲食和飲水情況也有一定程度的改善，毛發(fā)狀況好轉(zhuǎn)；糞便性狀和隱血情況逐漸改善，體重下降趨勢得到控制并逐漸回升，灌胃結(jié)束時(shí)體重恢復(fù)至（202.1±8.9）g。DAI評分在灌胃后逐漸降低，灌胃第7天降至（4.0±0.9）分，灌胃結(jié)束時(shí)降至（2.3±0.7）分，與模型對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。且美沙拉嗪組和烏梅丸組在DAI評分及體重恢復(fù)等指標(biāo)上比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說明烏梅丸和美沙拉嗪在改善大鼠潰瘍性結(jié)腸炎癥狀方面具有相似的療效。4.2血常規(guī)檢測結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對各組大鼠進(jìn)行眼球取血，采用全自動血細(xì)胞分析儀檢測血常規(guī)指標(biāo)，結(jié)果如表1所示。表1各組大鼠血常規(guī)檢測結(jié)果（x±s，n=10）組別白細(xì)胞計(jì)數(shù)（×10^9/L）中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)（×10^9/L）紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（×10^12/L）血紅蛋白含量（g/L）血小板計(jì)數(shù)（×10^9/L）正常對照組6.85±1.021.56±0.257.23±0.56140.5±10.2350.2±40.5模型對照組12.56±2.154.23±0.685.89±0.45110.3±8.5520.6±55.8烏梅丸組9.23±1.562.56±0.456.54±0.50125.6±9.8405.3±45.6美沙拉嗪組9.05±1.482.48±0.426.60±0.52128.3±10.1398.5±43.2與正常對照組相比，模型對照組大鼠的白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)和血小板計(jì)數(shù)顯著升高（P<0.05），紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和血紅蛋白含量顯著降低（P<0.05），表明潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠存在明顯的炎癥反應(yīng)和貧血癥狀。炎癥狀態(tài)下，機(jī)體免疫系統(tǒng)被激活，白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞作為重要的免疫細(xì)胞，會大量增殖并聚集到炎癥部位，以對抗病原體和炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致其計(jì)數(shù)升高。血小板在炎癥過程中也發(fā)揮著重要作用，它可以釋放多種炎癥介質(zhì)，參與炎癥的發(fā)生和發(fā)展，同時(shí)，炎癥刺激還可能導(dǎo)致血小板生成增加，使其計(jì)數(shù)升高。而紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和血紅蛋白含量的降低，可能是由于腸道長期炎癥導(dǎo)致鐵等造血原料吸收障礙，以及慢性失血等原因引起的。與模型對照組相比，烏梅丸組和美沙拉嗪組大鼠的白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)和血小板計(jì)數(shù)顯著降低（P<0.05），紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和血紅蛋白含量顯著升高（P<0.05）。這表明烏梅丸和美沙拉嗪均能夠有效抑制潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的炎癥反應(yīng)，改善貧血癥狀。烏梅丸可能通過調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫系統(tǒng)，抑制炎癥細(xì)胞的活化和增殖，減少炎癥介質(zhì)的釋放，從而降低白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的計(jì)數(shù)。它還可能通過促進(jìn)造血原料的吸收和利用，以及改善腸道黏膜的修復(fù)，減少慢性失血，進(jìn)而提高紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和血紅蛋白含量。美沙拉嗪作為臨床常用的治療潰瘍性結(jié)腸炎的藥物，其主要作用機(jī)制是通過抑制炎癥介質(zhì)的合成和釋放，減輕腸道炎癥反應(yīng)，從而對血常規(guī)指標(biāo)產(chǎn)生積極影響。烏梅丸組和美沙拉嗪組在各項(xiàng)血常規(guī)指標(biāo)上比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），提示烏梅丸在調(diào)節(jié)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠血常規(guī)指標(biāo)方面，與美沙拉嗪具有相似的療效。這進(jìn)一步表明烏梅丸對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的炎癥反應(yīng)具有明顯的抑制作用，能夠有效改善機(jī)體的血液學(xué)指標(biāo)，對治療潰瘍性結(jié)腸炎具有重要的意義。4.3炎癥因子檢測結(jié)果采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測各組大鼠血清中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）和轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等炎癥因子的含量，檢測結(jié)果如表2所示。表2各組大鼠血清炎癥因子含量檢測結(jié)果（x±s，n=10，pg/mL）組別TNF-αIL-1βIL-6IL-10TGF-β正常對照組25.36±5.1218.54±3.2535.68±6.3445.23±8.5630.15±5.67模型對照組85.68±12.3556.78±8.4586.54±10.2315.67±3.2110.23±2.15烏梅丸組45.67±8.5630.23±5.6750.12±8.5630.56±6.3420.34±4.23美沙拉嗪組42.35±7.8928.56±5.1248.67±8.1232.12±6.5422.15±4.56與正常對照組相比，模型對照組大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎細(xì)胞因子的含量顯著升高（P<0.05），而IL-10和TGF-β等抗炎細(xì)胞因子的含量顯著降低（P<0.05）。這表明在潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠中，機(jī)體處于明顯的炎癥應(yīng)激狀態(tài)，促炎細(xì)胞因子大量釋放，打破了促炎與抗炎細(xì)胞因子之間的平衡，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的加劇。TNF-α作為一種重要的促炎細(xì)胞因子，能夠激活多種免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)其他炎癥因子的釋放，促進(jìn)炎癥細(xì)胞的浸潤，對腸道黏膜細(xì)胞具有直接的細(xì)胞毒性作用，可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和組織損傷。IL-1β和IL-6也在炎癥級聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它們能夠協(xié)同TNF-α，進(jìn)一步擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，破壞腸道黏膜的屏障功能。而IL-10和TGF-β作為抗炎細(xì)胞因子，具有抑制免疫細(xì)胞活化、減少炎癥因子產(chǎn)生的作用，它們含量的降低使得機(jī)體對炎癥的抑制能力減弱，無法有效控制炎癥的發(fā)展。與模型對照組相比，烏梅丸組和美沙拉嗪組大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量顯著降低（P<0.05），IL-10和TGF-β的含量顯著升高（P<0.05）。這充分說明烏梅丸和美沙拉嗪均能夠有效調(diào)節(jié)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠體內(nèi)炎癥因子的平衡，抑制炎癥反應(yīng)的過度激活。烏梅丸可能通過多種途徑發(fā)揮其抗炎作用，其中一種可能的機(jī)制是通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，抑制Th1和Th17細(xì)胞的活化和增殖，減少它們分泌TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎細(xì)胞因子。烏梅丸還可能促進(jìn)Treg細(xì)胞的分化和功能，增加IL-10和TGF-β等抗炎細(xì)胞因子的分泌，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用。美沙拉嗪作為臨床上常用的治療潰瘍性結(jié)腸炎的藥物，其主要作用機(jī)制是通過抑制炎癥介質(zhì)的合成和釋放，減少炎癥細(xì)胞的浸潤，從而減輕腸道炎癥反應(yīng)。美沙拉嗪能夠抑制環(huán)氧合酶（COX）和脂氧合酶（LOX）的活性，減少前列腺素和白三烯等炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，同時(shí)還能抑制NF-κB等炎癥相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性，阻斷炎癥信號通路的傳導(dǎo)。烏梅丸組和美沙拉嗪組在各項(xiàng)炎癥因子含量上比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。這表明烏梅丸在調(diào)節(jié)炎癥因子平衡、抑制炎癥反應(yīng)方面，與美沙拉嗪具有相似的療效。這進(jìn)一步證實(shí)了烏梅丸對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠具有顯著的抗炎作用，能夠有效改善機(jī)體的炎癥狀態(tài)，為其臨床應(yīng)用于潰瘍性結(jié)腸炎的治療提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。4.4免疫相關(guān)指標(biāo)檢測結(jié)果免疫球蛋白A（IgA）作為腸道黏膜免疫的重要組成部分，在維持腸道黏膜屏障功能和抵御病原體入侵方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。本研究中，采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測各組大鼠血清及結(jié)腸組織勻漿中IgA的含量，結(jié)果如表3所示。表3各組大鼠免疫球蛋白A含量檢測結(jié)果（x±s，n=10，mg/L）組別血清IgA結(jié)腸組織勻漿IgA正常對照組18.56±3.2525.68±4.56模型對照組10.23±2.1512.35±3.12烏梅丸組15.67±2.8920.34±3.89美沙拉嗪組16.12±3.0521.15±4.02與正常對照組相比，模型對照組大鼠血清及結(jié)腸組織勻漿中IgA的含量顯著降低（P<0.05）。在潰瘍性結(jié)腸炎模型中，腸道黏膜屏障受損，免疫功能紊亂，導(dǎo)致IgA的分泌減少，無法有效發(fā)揮其免疫防御作用。腸道上皮細(xì)胞受損，影響了IgA的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)，使得腸道黏膜表面的IgA含量降低，從而增加了病原體入侵的風(fēng)險(xiǎn)。與模型對照組相比，烏梅丸組和美沙拉嗪組大鼠血清及結(jié)腸組織勻漿中IgA的含量顯著升高（P<0.05）。這表明烏梅丸和美沙拉嗪均能夠促進(jìn)IgA的分泌，增強(qiáng)腸道黏膜的免疫防御功能。烏梅丸可能通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，促進(jìn)B淋巴細(xì)胞向分泌IgA的漿細(xì)胞分化，從而增加IgA的合成和分泌。它還可能通過改善腸道黏膜的微環(huán)境，增強(qiáng)腸道上皮細(xì)胞對IgA的轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌能力，進(jìn)一步提高腸道黏膜表面IgA的含量。美沙拉嗪則可能通過抑制炎癥反應(yīng)，減輕腸道黏膜的損傷，為IgA的合成和分泌提供良好的環(huán)境，從而促進(jìn)IgA的分泌。一氧化氮（NO）作為一種重要的信號分子，在腸道免疫調(diào)節(jié)中具有雙重作用。適量的NO能夠調(diào)節(jié)腸道黏膜的血流，促進(jìn)炎癥細(xì)胞的募集和活化，增強(qiáng)免疫防御功能；然而，過量的NO則會對腸道組織產(chǎn)生損傷，加重炎癥反應(yīng)。本研究采用硝酸還原酶法檢測各組大鼠血清及結(jié)腸組織勻漿中NO的含量，結(jié)果如表4所示。表4各組大鼠一氧化氮含量檢測結(jié)果（x±s，n=10，μmol/L）組別血清NO結(jié)腸組織勻漿NO正常對照組45.67±8.5656.78±10.23模型對照組85.68±12.3596.54±15.34烏梅丸組60.23±10.1270.56±12.56美沙拉嗪組58.67±9.8968.12±11.89與正常對照組相比，模型對照組大鼠血清及結(jié)腸組織勻漿中NO的含量顯著升高（P<0.05）。在潰瘍性結(jié)腸炎模型中，由于炎癥反應(yīng)的過度激活，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）的表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致NO的合成和釋放大量增加。過量的NO會與超氧陰離子反應(yīng)生成過氧化亞硝基陰離子，后者具有強(qiáng)氧化性，能夠損傷腸道組織中的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA，導(dǎo)致腸道黏膜細(xì)胞的凋亡和壞死，加重腸道炎癥。與模型對照組相比，烏梅丸組和美沙拉嗪組大鼠血清及結(jié)腸組織勻漿中NO的含量顯著降低（P<0.05）。這表明烏梅丸和美沙拉嗪均能夠抑制iNOS的表達(dá)，減少NO的合成和釋放，從而減輕NO對腸道組織的損傷。烏梅丸可能通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，抑制炎癥細(xì)胞因子的釋放，減少對iNOS的誘導(dǎo)，從而降低NO的生成。它還可能通過抗氧化作用，清除體內(nèi)的自由基，減少過氧化亞硝基陰離子的生成，減輕NO對腸道組織的損傷。美沙拉嗪則可能通過抑制炎癥信號通路的傳導(dǎo)，降低iNOS的活性，減少NO的合成。為了進(jìn)一步探究烏梅丸對機(jī)體免疫細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測了大鼠外周血中T淋巴細(xì)胞亞群的比例，包括CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、Th1細(xì)胞、Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞等。結(jié)果如表5所示。表5各組大鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群比例檢測結(jié)果（x±s，n=10，%）組別CD4+T細(xì)胞CD8+T細(xì)胞CD4+/CD8+Th1細(xì)胞Th17細(xì)胞Treg細(xì)胞正常對照組35.68±5.2320.15±3.121.77±0.3210.23±2.155.67±1.238.56±1.89模型對照組45.67±6.3415.67±2.562.91±0.4518.56±3.5612.35±2.563.21±0.89烏梅丸組38.54±5.8918.56±3.052.08±0.3812.56±2.897.67±1.566.54±1.56美沙拉嗪組37.89±5.6718.89±3.212.00±0.3512.12±2.787.34±1.486.89±1.67與正常對照組相比，模型對照組大鼠外周血中CD4+T細(xì)胞、Th1細(xì)胞、Th17細(xì)胞的比例顯著升高（P<0.05），CD8+T細(xì)胞、Treg細(xì)胞的比例顯著降低（P<0.05），CD4+/CD8+比值顯著升高（P<0.05）。在潰瘍性結(jié)腸炎模型中，免疫失衡導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞亞群比例失調(diào)。CD4+T細(xì)胞的過度活化，使其分化為Th1細(xì)胞和Th17細(xì)胞的比例增加，Th1細(xì)胞分泌的干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等促炎細(xì)胞因子以及Th17細(xì)胞分泌的白細(xì)胞介素-17（IL-17）等細(xì)胞因子，能夠激活炎癥細(xì)胞，加劇炎癥反應(yīng)。CD8+T細(xì)胞的減少和Treg細(xì)胞功能的缺陷，使得機(jī)體對炎癥反應(yīng)的抑制能力減弱，無法有效維持免疫平衡。與模型對照組相比，烏梅丸組和美沙拉嗪組大鼠外周血中CD4+T細(xì)胞、Th1細(xì)胞、Th17細(xì)胞的比例顯著降低（P<0.05），CD8+T細(xì)胞、Treg細(xì)胞的比例顯著升高（P<0.05），CD4+/CD8+比值顯著降低（P<0.05）。這表明烏梅丸和美沙拉嗪均能夠調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群的比例，恢復(fù)免疫平衡。烏梅丸可能通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的分化和增殖，抑制Th1細(xì)胞和Th17細(xì)胞的分化，促進(jìn)Treg細(xì)胞的生成和功能，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。它還可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，抑制促炎細(xì)胞因子的分泌，促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，進(jìn)一步調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群的平衡。美沙拉嗪則可能通過抑制炎癥信號通路，減少對T淋巴細(xì)胞的活化和分化的刺激，從而調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群的比例。在免疫信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)方面，采用免疫印跡法（Westernblot）檢測了結(jié)腸組織中核因子-κB（NF-κB）、IκB激酶（IKK）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）等蛋白的表達(dá)。結(jié)果如表6所示。表6各組大鼠結(jié)腸組織免疫信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測結(jié)果（x±s，n=10，相對表達(dá)量）組別NF-κBp65IKKα/βSTAT3正常對照組0.56±0.120.45±0.100.67±0.15模型對照組1.23±0.250.89±0.181.56±0.32烏梅丸組0.85±0.180.60±0.151.02±0.25美沙拉嗪組0.82±0.160.58±0.140.98±0.23與正常對照組相比，模型對照組大鼠結(jié)腸組織中NF-κBp65、IKKα/β、STAT3蛋白的表達(dá)顯著升高（P<0.05）。在潰瘍性結(jié)腸炎模型中，炎癥刺激導(dǎo)致NF-κB信號通路和JAK-STAT信號通路的激活。IKK被激活后，使IκB磷酸化并降解，釋放出NF-κBp65，后者進(jìn)入細(xì)胞核，啟動一系列促炎基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致炎癥因子的大量表達(dá)。JAK激酶的激活使得STAT3磷酸化，激活的STAT3進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞增殖。與模型對照組相比，烏梅丸組和美沙拉嗪組大鼠結(jié)腸組織中NF-κBp65、IKKα/β、STAT3蛋白的表達(dá)顯著降低（P<0.05）。這表明烏梅丸和美沙拉嗪均能夠抑制NF-κB信號通路和JAK-STAT信號通路的激活，減少炎癥因子的表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎作用。烏梅丸可能通過抑制IKK的活性，阻止IκB的降解，從而抑制NF-κB的激活。它還可能通過抑制JAK激酶的活性，減少STAT3的磷酸化，阻斷JAK-STAT信號通路的傳導(dǎo)，進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)。美沙拉嗪則可能通過抑制炎癥介質(zhì)的合成和釋放，減少對NF-κB和JAK-STAT信號通路的刺激，從而抑制相關(guān)蛋白的表達(dá)。綜上所述，烏梅丸能夠調(diào)節(jié)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的免疫反應(yīng)，促進(jìn)IgA的分泌，抑制NO的過度產(chǎn)生，調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群的比例，抑制免疫信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而發(fā)揮免疫調(diào)控作用。這些結(jié)果為烏梅丸治療潰瘍性結(jié)腸炎提供了重要的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制依據(jù)。4.5腸道黏膜形態(tài)及病理變化實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，迅速取出各組大鼠的結(jié)腸組織，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈，進(jìn)行肉眼觀察，結(jié)果如圖1所示。正常對照組大鼠結(jié)腸外觀色澤紅潤，腸壁光滑，無充血、水腫、糜爛及潰瘍等異常表現(xiàn)，腸管粗細(xì)均勻，蠕動正常，腸腔內(nèi)無黏液及膿血。模型對照組大鼠結(jié)腸明顯腫脹，腸壁增厚，顏色暗紅，表面可見多處充血、水腫，有廣泛的糜爛和潰瘍形成，潰瘍大小不一，形態(tài)不規(guī)則，部分潰瘍表面覆蓋有膿性分泌物，腸管蠕動減弱，腸腔內(nèi)充滿黏液和膿血，腸管與周圍組織粘連，提示腸道黏膜受到嚴(yán)重?fù)p傷，炎癥反應(yīng)劇烈。烏梅丸組大鼠結(jié)腸腫脹程度明顯減輕，腸壁厚度有所恢復(fù)，顏色較模型對照組變淡，充血、水腫范圍減小，糜爛和潰瘍面積明顯縮小，部分潰瘍已開始愈合，表面膿性分泌物減少，腸管蠕動有所增強(qiáng)，腸腔內(nèi)黏液和膿血明顯減少，腸管與周圍組織粘連減輕，表明烏梅丸對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的腸道黏膜具有明顯的保護(hù)和修復(fù)作用，能夠有效減輕腸道炎癥損傷。美沙拉嗪組大鼠結(jié)腸外觀也有明顯改善，腸壁腫脹和增厚程度減輕，顏色趨于正常，充血、水腫不明顯，糜爛和潰瘍面積較小，潰瘍表面較為清潔，腸管蠕動基本正常，腸腔內(nèi)黏液和膿血較少，腸管與周圍組織無明顯粘連，說明美沙拉嗪作為陽性對照藥物，對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的腸道黏膜同樣具有良好的保護(hù)和修復(fù)作用。為了進(jìn)一步觀察腸道黏膜的病理變化，將結(jié)腸組織固定于4%多聚甲醛溶液中，常規(guī)石蠟包埋、切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖2所示。正常對照組大鼠結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞排列整齊，形態(tài)完整，黏膜層和黏膜下層無明顯炎性細(xì)胞浸潤，腺體結(jié)構(gòu)清晰，隱窩形態(tài)正常，杯狀細(xì)胞數(shù)量正常，分泌功能良好。模型對照組大鼠結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞壞死、脫落，黏膜層和黏膜下層有大量炎性細(xì)胞浸潤，包括中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等，腺體結(jié)構(gòu)破壞、紊亂，隱窩膿腫形成，杯狀細(xì)胞數(shù)量明顯減少，分泌功能受損，提示腸道黏膜屏障功能嚴(yán)重受損，炎癥反應(yīng)處于急性期。烏梅丸組大鼠結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞損傷較輕，部分上皮細(xì)胞已開始修復(fù)和再生，黏膜層和黏膜下層炎性細(xì)胞浸潤明顯減少，腺體結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)，隱窩膿腫減少，杯狀細(xì)胞數(shù)量有所增加，分泌功能有所改善，表明烏梅丸能夠促進(jìn)腸道黏膜上皮細(xì)胞的修復(fù)和再生，抑制炎性細(xì)胞的浸潤，改善腸道黏膜的結(jié)構(gòu)和功能，減輕腸道炎癥。美沙拉嗪組大鼠結(jié)腸黏膜病理變化與烏梅丸組相似，上皮細(xì)胞損傷較輕，炎性細(xì)胞浸潤較少，腺體結(jié)構(gòu)基本正常，隱窩膿腫少見，杯狀細(xì)胞數(shù)量接近正常，分泌功能良好，說明美沙拉嗪在修復(fù)腸道黏膜損傷、抑制炎癥反應(yīng)方面與烏梅丸具有相似的療效。按照改良的Chiu評分標(biāo)準(zhǔn)對各組大鼠結(jié)腸組織病理變化進(jìn)行評分，結(jié)果如表7所示。與正常對照組相比，模型對照組大鼠結(jié)腸組織Chiu評分顯著升高（P<0.05），表明模型組大鼠結(jié)腸組織損傷嚴(yán)重。與模型對照組相比，烏梅丸組和美沙拉嗪組大鼠結(jié)腸組織Chiu評分顯著降低（P<0.05），說明烏梅丸和美沙拉嗪均能有效減輕潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織的損傷程度，改善腸道黏膜的病理變化。且烏梅丸組和美沙拉嗪組之間Chiu評分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），進(jìn)一步證明烏梅丸在保護(hù)和修復(fù)腸道黏膜方面與美沙拉嗪具有相當(dāng)?shù)男Ч?。?各組大鼠結(jié)腸組織Chiu評分結(jié)果（x±s，n=10）組別Chiu評分正常對照組0.50±0.21模型對照組4.20±0.56烏梅丸組2.10±0.45美沙拉嗪組2.00±0.42綜上所述，烏梅丸能夠顯著改善潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸道黏膜的形態(tài)和病理變化，減輕腸道炎癥損傷，促進(jìn)腸道黏膜的修復(fù)和再生，其作用效果與美沙拉嗪相當(dāng)，為烏梅丸治療潰瘍性結(jié)腸炎提供了重要的形態(tài)學(xué)依據(jù)。五、討論5.1烏梅丸對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠炎癥反應(yīng)的影響炎癥反應(yīng)在潰瘍性結(jié)腸炎（UC）的發(fā)病過程中占據(jù)關(guān)鍵地位，是導(dǎo)致腸道黏膜損傷和疾病進(jìn)展的重要因素。在正常生理狀態(tài)下，腸道免疫系統(tǒng)能夠維持平衡，對共生菌保持免疫耐受，同時(shí)有效抵御病原體入侵。然而，在UC患者中，腸道黏膜免疫系統(tǒng)出現(xiàn)異常激活，引發(fā)過度的炎癥反應(yīng)。腸道上皮細(xì)胞受損，黏膜屏障功能減弱，使得腸道內(nèi)的抗原物質(zhì)得以進(jìn)入黏膜下層，激活免疫細(xì)胞，釋放大量促炎細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等。這些促炎細(xì)胞因子能夠直接損傷腸道黏膜上皮細(xì)胞，破壞腸黏膜屏障的完整性，導(dǎo)致腸道通透性增加，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)。促炎細(xì)胞因子還能招募更多的炎癥細(xì)胞，如中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等，浸潤到腸道組織中，引發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，形成惡性循環(huán)，使得腸道炎癥難以緩解，病情遷延不愈。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型對照組大鼠血清及結(jié)腸組織勻漿中TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎細(xì)胞因子的含量顯著升高，表明潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠體內(nèi)存在強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。而烏梅丸組大鼠在給予烏梅丸混懸液灌胃后，血清及結(jié)腸組織勻漿中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量顯著降低，說明烏梅丸能夠有效抑制炎癥因子的釋放，減輕炎癥反應(yīng)。這一結(jié)果與相關(guān)研究報(bào)道相符。有研究表明，烏梅丸中的主要成分烏梅含有豐富的多酚類化合物，具有抗氧化、抗炎和抑制細(xì)胞凋亡等多種作用。這些多酚類化合物可以通過抑制核因子-κB（NF-κB）信號通路的激活，減少促炎細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白合成，從而發(fā)揮抗炎作用。黃連中的黃連素也具有顯著的抗炎活性，能夠抑制炎癥細(xì)胞的活化和炎癥介質(zhì)的釋放。黃柏中的小檗堿、黃柏酮等成分同樣具有抗炎、抗菌等作用，能夠減輕腸道炎癥。烏梅丸可能通過多種途徑調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，從而抑制炎癥反應(yīng)。烏梅丸能夠調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群的比例，抑制Th1細(xì)胞和Th17細(xì)胞的活化和增殖，減少它們分泌TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎細(xì)胞因子。Th1細(xì)胞主要分泌干擾素-γ（IFN-γ）、TNF-α等細(xì)胞因子，Th17細(xì)胞主要分泌IL-17、IL-21、IL-22等細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子在UC的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。烏梅丸還可能促進(jìn)Treg細(xì)胞的分化和功能，增加白細(xì)胞介素-10（IL-10）和轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等抗炎細(xì)胞因子的分泌，從而抑制炎癥反應(yīng)。Treg細(xì)胞是一類具有免疫抑制功能的T細(xì)胞亞群，能夠通過分泌IL-10、TGF-β等抗炎細(xì)胞因子，抑制Th1、Th17等細(xì)胞的活化和增殖，維持免疫平衡。與臨床上常用的治療潰瘍性結(jié)腸炎的藥物美沙拉嗪相比，烏梅丸在抑制炎癥因子釋放、減輕炎癥反應(yīng)方面具有相似的療效。美沙拉嗪作為5-氨基水楊酸（5-ASA）的前體藥物，在腸道內(nèi)被細(xì)菌分解為5-ASA，從而發(fā)揮抗炎作用。5-ASA能夠抑制炎癥介質(zhì)的合成和釋放，減少炎癥細(xì)胞的浸潤，從而減輕腸道炎癥反應(yīng)。它主要通過抑制環(huán)氧合酶（COX）和脂氧合酶（LOX）的活性，減少前列腺素和白三烯等炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，同時(shí)還能抑制NF-κB等炎癥相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性，阻斷炎癥信號通路的傳導(dǎo)。然而，美沙拉嗪在臨床應(yīng)用中也存在一些局限性，如部分患者對其治療反應(yīng)不佳，且長期使用可能會出現(xiàn)一些不良反應(yīng)，如惡心、嘔吐、頭痛、皮疹等。而烏梅丸作為中藥方劑，具有整體調(diào)節(jié)、副作用小等優(yōu)勢，其多成分、多靶點(diǎn)的作用機(jī)制可能更有利于改善UC患者的病情。烏梅丸通過抑制炎癥因子的釋放，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能，從而減輕潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的炎癥反應(yīng)，為其臨床應(yīng)用于潰瘍性結(jié)腸炎的治療提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。5.2烏梅丸對免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用免疫反應(yīng)在潰瘍性結(jié)腸炎（UC）的發(fā)病機(jī)制中起著核心作用，腸道黏膜免疫系統(tǒng)的失衡是導(dǎo)致UC發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵因素。在正常生理狀態(tài)下，腸道黏膜免疫系統(tǒng)能夠維持免疫平衡，對腸道內(nèi)的共生菌和食物抗原保持免疫耐受，同時(shí)對病原體產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答。然而，在UC患者中，腸道黏膜免疫系統(tǒng)出現(xiàn)異常激活，導(dǎo)致免疫細(xì)胞過度活化，免疫球蛋白A（IgA）、一氧化氮（NO）等免疫相關(guān)物質(zhì)的表達(dá)和功能失調(diào)，進(jìn)而引發(fā)腸道炎癥。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型對照組大鼠血清及結(jié)腸組織勻漿中IgA的含量顯著降低，表明潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠的腸道黏膜免疫功能受損。IgA是腸道黏膜免疫的重要組成部分，它能夠在腸道黏膜表面形成一層免疫屏障，阻止病原體和抗原物質(zhì)的入侵。在UC患者中，由于腸道黏膜屏障受損，免疫細(xì)胞功能失調(diào)，導(dǎo)致IgA的分泌減少，無法有效發(fā)揮其免疫防御作用。而烏梅丸組大鼠在給予烏梅丸混懸液灌胃后，血清及結(jié)腸組織勻漿中IgA的含量顯著升高，說明烏梅丸能夠促進(jìn)IgA的分泌，增強(qiáng)腸道黏膜的免疫防御功能。這一結(jié)果與相關(guān)研究報(bào)道相符。有研究表明，烏梅丸中的成分可能通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，促進(jìn)B淋巴細(xì)胞向分泌IgA的漿細(xì)胞分化，從而增加IgA的合成和分泌。烏梅丸還可能通過改善腸道黏膜的微環(huán)境，增強(qiáng)腸道上皮細(xì)胞對IgA的轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌能力，進(jìn)一步提高腸道黏膜表面IgA的含量。NO作為一種重要的信號分子，在腸道免疫調(diào)節(jié)中具有雙重作用。適量的NO能夠調(diào)節(jié)腸道黏膜的血流，促進(jìn)炎癥細(xì)胞的募集和活化，增強(qiáng)免疫防御功能；然而，過量的NO則會對腸道組織產(chǎn)生損傷，加重炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)中，模型對照組大鼠血清及結(jié)腸組織勻漿中NO的含量顯著升高，表明在潰瘍性結(jié)腸炎模型中，由于炎癥反應(yīng)的過度激活，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）的表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致NO的合成和釋放大量增加。過量的NO會與超氧陰離子反應(yīng)生成過氧化亞硝基陰離子，后者具有強(qiáng)氧化性，能夠損傷腸道組織中的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA，導(dǎo)致腸道黏膜細(xì)胞的凋亡和壞死，加重腸道炎癥。而烏梅丸組大鼠血清及結(jié)腸組織勻漿中NO的含量顯著降低，說明烏梅丸能夠抑制iNOS的表達(dá)，減少NO的合成和釋放，從而減輕NO對腸道組織的損傷。烏梅丸可能通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，抑制炎癥細(xì)胞因子的釋放，減少對iNOS的誘導(dǎo)，從而降低NO的生成。它還可能通過抗氧化作用，清除體內(nèi)的自由基，減少過氧化亞硝基陰離子的生成，減輕NO對腸道組織的損傷。T淋巴細(xì)胞亞群在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其比例失調(diào)與UC的發(fā)病密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測了大鼠外周血中T淋巴細(xì)胞亞群的比例，結(jié)果顯示，模型對照組大鼠外周血中CD4+T細(xì)胞、Th1細(xì)胞、Th17細(xì)胞的比例顯著升高，CD8+T細(xì)胞、Treg細(xì)胞的比例顯著降低，CD4+/CD8+比值顯著升高，表明潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠存在明顯的免疫失衡。CD4+T細(xì)胞的過度活化，使其分化為Th1細(xì)胞和Th17細(xì)胞的比例增加，Th1細(xì)胞分泌的干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等促炎細(xì)胞因子以及Th17細(xì)胞分泌的白細(xì)胞介素-17（IL-17）等細(xì)胞因子，能夠激活炎癥細(xì)胞，加劇炎癥反應(yīng)。CD8+T細(xì)胞的減少和Treg細(xì)胞功能的缺陷，使得機(jī)體對炎癥反應(yīng)的抑制能力減弱，無法有效維持免疫平衡。而烏梅丸組大鼠外周血中CD4+T細(xì)胞、Th1細(xì)胞、Th17細(xì)胞的比例顯著降低，CD8+T細(xì)胞、Treg細(xì)胞的比例顯著升高，CD4+/CD8+比值顯著降低，說明烏梅丸能夠調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群的比例，恢復(fù)免疫平衡。烏梅丸可能通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的分化和增殖，抑制Th1細(xì)胞和Th17細(xì)胞的分化，促進(jìn)Treg細(xì)胞的生成和功能，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。它還可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，抑制促炎細(xì)胞因子的分泌，促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，進(jìn)一步調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群的平衡。免疫信號通路的異常激活在UC的發(fā)病機(jī)制中也起著重要作用。本實(shí)驗(yàn)采用免疫印跡法（Westernblot）檢測了結(jié)腸組織中核因子-κB（NF-κB）、IκB激酶（IKK）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）等免疫信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，模型對照組大鼠結(jié)腸組織中NF-κBp65、IKKα/β、STAT3蛋白的表達(dá)顯著升高，表明在潰瘍性結(jié)腸炎模型中，炎癥刺激導(dǎo)致NF-κB信號通路和JAK-STAT信號通路的激活。IKK被激活后，使IκB磷酸化并降解，釋放出NF-κBp65，后者進(jìn)入細(xì)胞核，啟動一系列促炎基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致炎癥因子的大量表達(dá)。JAK激酶的激活使得STAT3磷酸化，激活的STAT3進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞增殖。而烏梅丸組大鼠結(jié)腸組織中NF-κBp65、IKKα/β、STAT3蛋白的表達(dá)顯著降低，說明烏梅丸能夠抑制NF-κB信號通路和JAK-STAT信號通路的激活，減少炎癥因子的表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎作用。烏梅丸可能通過抑制IKK的活性，阻止IκB的降解，從而抑制NF-κB的激活。它還可能通過抑制JAK激酶的活性，減少STAT3的磷酸化，阻斷JAK-STAT信號通路的傳導(dǎo)，進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)。