廣東省地方標(biāo)準(zhǔn)《飼料中致病微生物基因篩查規(guī)程》編制說明（送審稿）承擔(dān)單位：廣東省科學(xué)院微生物研究所（廣東省微生物分析檢測中心）二○二五年九月目錄一、工作概況。包括任務(wù)來源（立項文件），協(xié)作單位、任務(wù)分工等 3（一）任務(wù)來源 3（二）任務(wù)分工 3二、立項的必要性 3三、標(biāo)準(zhǔn)編制原則、主要內(nèi)容及其確定依據(jù) 5（一）標(biāo)準(zhǔn)編制原則 5（二）主要內(nèi)容確定的依據(jù) 5（三）主要內(nèi)容 8四、與現(xiàn)行法律法規(guī)、強制性標(biāo)準(zhǔn)等上位標(biāo)準(zhǔn)關(guān)系 9五、標(biāo)準(zhǔn)的先進性或特色性 9六、標(biāo)準(zhǔn)調(diào)研、研討、征求意見情況。重大分歧意見的處理經(jīng)過和依據(jù) 10七、技術(shù)指標(biāo)設(shè)置的科學(xué)性和可行性，量化指標(biāo)的確定依據(jù) 12八、與國際、國家、行業(yè)、其他省同類標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)內(nèi)容的對比情況 20九、涉及專利的有關(guān)說明 21十、專家審查會情況 21十一、實施推廣建議 21

《飼料中致病微生物基因篩查規(guī)程》編制說明一、工作概況。包括任務(wù)來源（立項文件）、任務(wù)分工等。（一）任務(wù)來源本文件制定任務(wù)（索引號：00694001X/2023-00365）由廣東省畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會（GD/TC09）歸口，由廣東省科學(xué)院微生物研究所（廣東省微生物分析檢測中心）獨立承擔(dān)并由羊宋貞主持《飼料中微生物致病基因篩查規(guī)程》的標(biāo)準(zhǔn)制定工作。（二）任務(wù)分工參與人員負責(zé)工作內(nèi)容羊宋貞承擔(dān)制定標(biāo)準(zhǔn)工作的統(tǒng)籌、文本和編制說明起草的修改章俊負責(zé)國內(nèi)外相關(guān)資料查詢，實驗工作、文本和編制說明初稿編制陸雪影承擔(dān)制定標(biāo)準(zhǔn)的搜集資料的整理鄭湘玲負責(zé)規(guī)程的實驗和驗證工作陳清瑩負責(zé)規(guī)程的實驗和驗證工作潘寶怡承擔(dān)制定標(biāo)準(zhǔn)的征求意見定向發(fā)出邀請王青柏承擔(dān)制定標(biāo)準(zhǔn)的報批王永紅負責(zé)規(guī)程的實驗和驗證工作陳憶晴承擔(dān)制定標(biāo)準(zhǔn)實驗樣品的收集榮向負責(zé)規(guī)程的實驗和驗證工作陳艷承擔(dān)制定標(biāo)準(zhǔn)實驗樣品的收集熊詩陽負責(zé)規(guī)程的定向意見稿征集及整理陳穎麟負責(zé)規(guī)程的定向意見稿征集及整理韓和悅負責(zé)規(guī)程的實驗和驗證工作朱紅惠承擔(dān)制定標(biāo)準(zhǔn)的指導(dǎo)二、立項的必要性。隨著人民生活水平的不斷提高，對身體健康和食品安全的關(guān)注日益增強。近年來，國家已將食品安全問題提升至戰(zhàn)略高度，多次在一號文件中明確提出實施食品安全戰(zhàn)略，全面加強食品質(zhì)量監(jiān)管。目前，我國在食品安全領(lǐng)域的監(jiān)督管理體系日趨完善，相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)也已基本健全，尤其是在微生物致病菌方面，已建立起涵蓋細菌、真菌和病毒等的定性與定量檢測標(biāo)準(zhǔn)體系，為食品安全提供了堅實的技術(shù)支撐。然而，作為“從農(nóng)場到餐桌”食品安全鏈條的起始環(huán)節(jié)，我國飼料生產(chǎn)加工領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)建設(shè)仍相對滯后。無論是國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)還是地方標(biāo)準(zhǔn)，特別是在致病菌檢測方面，相關(guān)規(guī)范仍較為匱乏。飼料中的致病微生物不僅可能通過食物鏈傳遞給人類，導(dǎo)致人畜共患疾病，還會直接影響動物健康，進而降低動物源性食品的質(zhì)量。受原料本身、生產(chǎn)加工、儲存運輸?shù)榷喹h(huán)節(jié)的污染影響，加之監(jiān)管技術(shù)指導(dǎo)文件的缺失，當(dāng)前飼料污染問題較為突出。研究表明，我國在動物源性和植物源性飼料中均檢出多種病原微生物，如沙門氏菌、志賀氏菌、肺炎克雷伯氏菌等，這些微生物對動物和人類均具有較強致病性。目前飼料產(chǎn)品的致病菌檢出率普遍較高，常達到百分之十幾甚至三四十，且檢測多集中于沙門氏菌等少數(shù)菌種，反映出飼料安全形勢的嚴峻性。若不能從飼料環(huán)節(jié)徹底解決致病菌污染問題，將難以從根本上提升肉類食品的質(zhì)量與安全水平。尤其在我國養(yǎng)殖業(yè)已全面實現(xiàn)規(guī)?；谋尘跋?，飼料的安全性直接影響整體養(yǎng)殖效益和公共衛(wèi)生安全。規(guī)?；B(yǎng)殖對飼料品質(zhì)提出了更高要求，一旦飼料中含有某些致病菌，極易導(dǎo)致動物群體性疾病暴發(fā)，造成重大經(jīng)濟損失。研究顯示，除沙門氏菌和致病性大腸桿菌外，布氏桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌及肺炎克雷伯氏桿菌等同樣可引發(fā)動物嚴重疾病，并存在顯著的人畜共患風(fēng)險。因此，加快建立健全飼料致病菌檢測標(biāo)準(zhǔn)體系，加強全鏈條監(jiān)管，是切實保障食品安全、推動養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的迫切需求。廣東省作為全國畜牧養(yǎng)殖大省和飼料工業(yè)重要基地，年產(chǎn)飼料超千萬噸，產(chǎn)業(yè)規(guī)模位居全國前列。隨著《廣東省食品安全條例》和《廣東省動物防疫條例》的深入實施，飼料質(zhì)量安全監(jiān)管已成為全省食品安全體系建設(shè)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前，我省飼料生產(chǎn)企業(yè)普遍采用國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進行質(zhì)量控制，但受限于飼料廠家成本因素考慮，國標(biāo)或行標(biāo)關(guān)于飼料中致病微生物的檢測標(biāo)準(zhǔn)嚴重缺乏，特別是分子檢測標(biāo)準(zhǔn)。本規(guī)程通過分子手段檢測飼料中致病菌，可以降低成本和時間，可以幫助飼料生產(chǎn)企業(yè)提高飼料品質(zhì)，可以幫助養(yǎng)殖業(yè)的健康穩(wěn)健發(fā)展，可以指導(dǎo)監(jiān)管部門行業(yè)監(jiān)管，包括對進出口貿(mào)易飼料的監(jiān)管，做到有標(biāo)可依，有據(jù)可查，促進畜牧業(yè)更加綠色健康的發(fā)展。三、標(biāo)準(zhǔn)編制原則、主要內(nèi)容及其確定依據(jù)。（一）標(biāo)準(zhǔn)編制原則本文件遵循市場相關(guān)性原則、協(xié)商一致性和普遍適用性原則，依據(jù)GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》、GB/T20001.6-2017《標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)則第6部分：規(guī)程標(biāo)準(zhǔn)》的規(guī)定進行制定。（二）主要內(nèi)容確定的依據(jù)本文件的主要技術(shù)內(nèi)容及確定的依據(jù)如下。1.國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)情況目前關(guān)于飼料致病菌檢測有少量標(biāo)準(zhǔn)，國標(biāo)中有《GB/T13091-2018飼料中沙門氏菌的測定》（傳統(tǒng)方法）、《GB/T28642-2012飼料中沙門氏菌的快速檢測方法聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法》（普通PCR方法）、《GB/T26427-2010飼料中蠟樣芽孢桿菌的檢測》（傳統(tǒng)方法）、《GB/T26426-2010飼料中副溶血性弧菌的檢測》（傳統(tǒng)方法）、《GB/T26425-2010飼料中產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢測》（傳統(tǒng)方法），地方標(biāo)準(zhǔn)有《DB22/T2692-2017飼料中金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌檢測雙重微滴數(shù)字PCR法》（微滴數(shù)字PCR方法）、《DB22/T2051-2014飼料中肉毒梭菌測定PCR方法》（普通PCR方法）、《DB22/T2688.1-2017飼料中三種致病菌檢測微滴數(shù)字PCR法第1部分：沙門氏菌》（微滴數(shù)字PCR方法）、《DB22/T2688.2-2017飼料中三種致病菌檢測微滴數(shù)字PCR法第2部分：單核細胞增生李斯特氏菌》（微滴數(shù)字PCR方法）、《DB22/T2688.3-2017飼料中三種致病菌檢測微滴數(shù)字PCR法第3部分：產(chǎn)氣莢膜梭菌》（微滴數(shù)字PCR方法）、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)有《SN/T2582-2010產(chǎn)黃曲霉毒素真菌PCR檢測方法》（普通PCR方法）、《SN/T4781-2017出口食品和飼料中產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌檢測方法實時熒光PCR法》（實時熒光定量PCR方法）、團體標(biāo)準(zhǔn)有《T/SDAQI044-2021飼料中產(chǎn)黃曲霉毒素真菌的檢測實時熒光PCR方法》（實時熒光定量PCR方法）、《TSDAQI043-2021飼料中沙門氏菌、副溶血性弧菌、志賀氏菌三重?zé)晒舛縋CR快速檢測方法》（實時熒光定量PCR方法）。2.國際標(biāo)準(zhǔn)情況《ISO/TS13136-2012Microbiologyoffoodandanimalfeed—Real-timepolymerasechainreaction(PCR)-basedmethodforthedetectionoffood-bornepathogens—HorizontalmethodforthedetectionofShigatoxin-producingEscherichiacoli(STEC)andthedeterminationofO157,O111,O26,O103andO145serogroups》（實時熒光定量PCR方法，致病性大腸桿菌）、《ISO/TS6579-2:2012Microbiologyoffoodandanimalfeed—Horizontalmethodforthedetection,enumerationandserotypingofSalmonella—Part2:Enumerationbyaminiaturizedmostprobablenumbertechnique》（傳統(tǒng)方法，沙門氏菌）、《AS5013.2-2007FoodmicrobiologyMethod2Microbiologyoffoodandanimalfeedingstuffs-HorizontalmethodfortheenumerationofBacilluscereus-Colony-counttechniqueat30℃(ISO79322004,MOD)》（傳統(tǒng)方法，蠟樣芽胞桿菌）、《ISO/TS21872-1-2007Microbiologyoffoodandanimalfeedingstuffs-HorizontalmethodforthedetectionofpotentiallyenteropathogenicVibriospp.-Part1:DetectionofVibrioparahaemolyticusandVibriocholerae》（傳統(tǒng)方法，副溶血弧菌和霍亂弧菌）、《ISO/TS21872-2-2007Microbiologyoffoodandanimalfeedingstuffs-HorizontalmethodforthedetectionofpotentiallyenteropathogenicVibriospp.-Part2:DetectionofspeciesotherthanVibrioparahaemolyticusandVibriocholerae》（傳統(tǒng)方法，弧菌）。3.綜述報告由于受到飼料原料的污染，以及生產(chǎn)加工、運輸?shù)确矫娴奈廴荆偌由媳O(jiān)管指導(dǎo)技術(shù)文件的缺失，飼料污染問題比較嚴重。目前，飼料中國標(biāo)《GB13078-2017飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》僅對沙門氏菌做出不得檢出規(guī)定，然而飼料中其它致病菌問題也很嚴重，國內(nèi)有研究表明，某地飼料中金黃色葡萄球菌檢出率高達45%，飼料添加劑中蠟樣芽胞桿菌的檢出率高達48.94%，其它致病菌也有檢出，而飼料中致病菌研究主要集中在沙門氏菌中，對其它致病菌關(guān)注不多，然而動物致病的報道眾多，2011年，吉林省曾發(fā)生一起因飼料中污染鮑曼不動桿菌造成3000余只雛雞死亡，10萬余只雛雞患病事件，金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌、溶血性鏈球菌、致病性大腸埃希氏菌、布氏桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、肺炎克雷伯氏桿菌等多種微生物人畜共患病報道眾多。國際上對飼料致病菌的檢測和監(jiān)管大都同食品等同，而我國則為分開制定，食品檢測標(biāo)準(zhǔn)較為健全，傳統(tǒng)方法及分子檢測方法都有，飼料則嚴重缺乏，飼料中致病菌普通PCR檢測標(biāo)準(zhǔn)僅《GB/T28642-2012》、《DB22/T2051-2014》、《SN/T2582-2010》，僅能夠檢測沙門氏菌、黃曲霉、肉毒梭菌。加上傳統(tǒng)檢測方法，也遠遠不能滿足要求，對于其它致病菌檢測方法，例如實時熒光定量方法、微滴數(shù)字PCR方法等，儀器設(shè)備昂貴，不具有普適性原則。普通PCR檢測方法可以提高檢測致病菌效率，對于無相應(yīng)致病菌的樣品可以快速得出結(jié)論，傳統(tǒng)方法需要分離培養(yǎng)再將疑似菌株進行確證，耗時久。本規(guī)程參考食品標(biāo)準(zhǔn)《SN/T1869-2007食品中多種致病菌快速檢測方法PCR法》、《SN/T2641-2010食品中常見致病菌檢測PCR-DHPLC法》中的致病菌PCR擴增檢測方法，對金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、溶血性鏈球菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、肺炎克雷伯氏桿菌、霍亂弧菌、創(chuàng)傷弧菌、副溶血性弧菌、單增李斯特氏菌、空腸彎曲桿菌、腸出血性大腸埃希氏菌O157:H7等人畜共患病的致病菌進行規(guī)定。標(biāo)準(zhǔn)《SN/T1869-2007》和《SN/T2641-2010》中有相應(yīng)的致病菌基因引物及擴增程序。細菌致病菌檢測一般要進行增菌，不管是傳統(tǒng)檢測方法還是分子檢測標(biāo)準(zhǔn)均需進行增菌，食品檢測標(biāo)準(zhǔn)有的規(guī)定一次增菌，例如，《GB4789.10-2016》金黃色葡萄球菌、《GB4789.14-2014》蠟樣芽孢桿菌，有的進行二次增菌，例如《SN/T1022-2010》，飼料中《GB/T28642-2012》沙門氏菌進行二次增菌，《DB22/T2051-2014》肉毒梭菌進行一次增菌。飼料中致病菌檢測增菌次數(shù)主要還是參考食品國標(biāo)中傳統(tǒng)檢測方法。標(biāo)準(zhǔn)中DNA提取方法眾多，有傳統(tǒng)的酚氯仿異戊醇法，如《SN/T2641-2010》，有DNA提取試劑盒法，如《DB22/T2051-2014》，有采用煮沸法，也就是將菌加入無菌ddH2O中煮沸離心取上清，如《GB4789.44-2020》，有采用Chelex100樹脂提取法，如《SN/T1870-2007》。傳統(tǒng)的酚氯仿異戊醇法和DNA提取試劑盒提取的DNA質(zhì)量較高，但操作比較麻煩，用時較長，采用ddH2O煮沸法操作簡便，提取有些革蘭氏陽性菌DNA會比較困難，例如金黃色葡萄球菌，不能滿足PCR擴增需要，另外也不適合雜質(zhì)較多的檢品，雜質(zhì)會影響PCR擴增，而Chelex100樹脂提取法則對多價金屬離子具有非常高的親和力，其在低離子強度、堿性溫浴的作用下能夠裂解細胞膜，改變與DNA結(jié)合蛋白的性質(zhì)，而且能夠阻止DNA降解，同時提高擴增效率，同時Chelex100提取法操作也比較簡單，而且經(jīng)濟。Chelex100提取法大部分文獻顯示用5%濃度的Chelex100，煮沸時間為10min，但標(biāo)準(zhǔn)《SN/T1870-2007》采用濃度為0.1%的Chelex100，煮沸時間為5min。增菌后取菌液的量，飼料標(biāo)準(zhǔn)《GBT28642-2012飼料中沙門氏菌的快速檢測方法聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法》采用吸取1mL菌液采用ddH2O煮沸法提取DNA，食品標(biāo)準(zhǔn)《SN/T1870-2007》吸取1mL菌液采用0.1%的Chelex100提取DNA，試驗中發(fā)現(xiàn)，吸取1mL增菌液離心后發(fā)現(xiàn)沉淀物多，采用50μLDNA提取液遠遠不能懸浮沉淀物，提取的DNA濃度常常過高，不利于PCR擴增，因此，此規(guī)程中改為0.5mL增菌液離心后用0.1%的Chelex100提取DNA。對于陰性對照、空白對照和陽性對照的設(shè)定，一般PCR擴增檢測致病菌均會設(shè)置對照。飼料標(biāo)準(zhǔn)《GB/T28642-2012飼料中沙門氏菌的快速檢測方法聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法》規(guī)定用含有沙門氏菌株的樣品作為陽性對照，用不含沙門氏菌的樣品作為陰性對照，食品標(biāo)準(zhǔn)中大都設(shè)置有陰性對照、空白對照和陽性對照，例如《SN/T3639-2013》、《SN/T1869-2007》等，陰性對照、空白對照、陽性對照可以檢查擴增異常的原因分析，對結(jié)果準(zhǔn)確性有重要意義。對于PCR反應(yīng)體系和電泳檢測，為一般PCR擴增通用，描述可有微小差異，操作基本區(qū)別不大。考慮到飼料樣品中菌雜合度嚴重，另外飼料源性成分產(chǎn)生的DNA也有可能對PCR擴增有影響。食品和飼料相關(guān)致病標(biāo)準(zhǔn)均會規(guī)定對PCR擴增陽性樣品利用傳統(tǒng)方法進行確證，例如飼料標(biāo)準(zhǔn)《GB/T28642-2012》、《DB22/T2051-2014》，食品標(biāo)準(zhǔn)《SN/T1869-2007》、《SN/T2641-2010》、《SN/T1870-2007》等。考慮到PCR擴增陽性樣品分離的菌比較多，疑似陽性菌落如果較多，用傳統(tǒng)的方法確證比較麻煩，部分標(biāo)準(zhǔn)除了規(guī)定增菌液樣品DNA提取，還會規(guī)定可疑菌落DNA提取，例如標(biāo)準(zhǔn)《SN/T2641-2010》、《SN/T1870-2007》等?？梢删潢栃訮CR再進行傳統(tǒng)方法確證，則可大大提高致病菌檢測效率，可以說PCR擴增方法是傳統(tǒng)檢測標(biāo)準(zhǔn)的有效補充方法。（三）主要內(nèi)容人畜共患病的致病菌眾多，本規(guī)程對人畜共患病致病菌金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、副溶血性弧菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、肺炎克雷伯氏桿菌、霍亂弧菌、創(chuàng)傷弧菌、溶血性鏈球菌、單核細胞增生李斯特氏菌、空腸彎曲桿菌、腸出血性大腸埃希氏菌O157:H7進行檢測，其引物序列及擴增方式參考標(biāo)準(zhǔn)《SN/T1869-2007食品中多種致病菌快速檢測方法PCR法》和《SN/T2641-2010食品中常見致病菌檢測PCR-DHPLC法》，另外，規(guī)程中對增菌、DNA提取和PCR擴增疑似陽性樣品確證進行規(guī)定。最后，為了保證檢測的順利進行，防止樣品交叉污染以及保護人、環(huán)境生物安全，對采樣及生物安全措施進行規(guī)定。四、與現(xiàn)行法律法規(guī)、強制性標(biāo)準(zhǔn)等上位標(biāo)準(zhǔn)關(guān)系。本文件制定過程中嚴格遵守國家有關(guān)方針、政策、法律法規(guī)，嚴格執(zhí)行強制性國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，與相關(guān)的各種基礎(chǔ)標(biāo)準(zhǔn)相銜接，遵循政策性和協(xié)調(diào)性原則。本文件制定過程遵循《中華人民共和國標(biāo)準(zhǔn)化法》、《農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化管理辦法》等法律法規(guī)的要求，與強制性標(biāo)準(zhǔn)協(xié)調(diào)一致、沒有沖突。五、標(biāo)準(zhǔn)的先進性或特色性。本文件采用普通PCR技術(shù)對飼料中的致病菌進行檢測，相比傳統(tǒng)生化檢測方法，具有高效、低成本的優(yōu)勢。傳統(tǒng)培養(yǎng)法（如沙門氏菌檢測）通常需耗時4–7天，分離和鑒定步驟繁瑣、工作量大、成本較高；而本文件所采用的分子檢測方法快速靈敏，可在2天內(nèi)完成檢測，顯著提升了檢測效率，同時降低了成本，是對現(xiàn)有致病菌檢測方法的重要補充。本方法特異性強，可針對特定致病菌的靶基因（如金黃色葡萄球菌的femA基因）進行擴增，避免傳統(tǒng)微生物學(xué)方法（如培養(yǎng)法和生化鑒定）因培養(yǎng)基選擇性、操作人員經(jīng)驗等因素導(dǎo)致的偏差。傳統(tǒng)方法往往僅能鑒定至“屬”的水平（例如“沙門氏菌屬”），難以快速區(qū)分致病型與非致病型菌株。通過PCR擴增高度特異的基因序列，再結(jié)合傳統(tǒng)分析手段，可實現(xiàn)對目標(biāo)致病菌的準(zhǔn)確識別。本文件提供了11種致病菌的檢測方法，彌補了現(xiàn)有飼料中致病微生物檢測標(biāo)準(zhǔn)的不足。六、標(biāo)準(zhǔn)調(diào)研、研討、征求意見情況。重大分歧意見的處理經(jīng)過和依據(jù)。1.成立標(biāo)準(zhǔn)編制小組2023年5月15日由項目負責(zé)人組織召開第一次關(guān)于飼料中微生物致病基因篩查規(guī)程會議，成立規(guī)程制定小組并進行分工與計劃安排。2.全面調(diào)研、搜集樣品，編制文本草案2023年6月，起草組系統(tǒng)收集、分析了國內(nèi)外相關(guān)的法律法規(guī)、政策文件、技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)及學(xué)術(shù)文獻，查閱了大量與飼料和食品相關(guān)的致病菌檢測相關(guān)資料，表1列舉部分標(biāo)準(zhǔn)情況，并對飼料行業(yè)的現(xiàn)狀、發(fā)展趨勢及標(biāo)準(zhǔn)化需求進行了深入調(diào)研，為標(biāo)準(zhǔn)起草奠定了堅實的理論與實踐基礎(chǔ)。同時搜集了不同類型的飼料樣品11個，見表2。結(jié)合實際樣品情況，對這些資料進行整理，多次內(nèi)部討論，編制標(biāo)準(zhǔn)文本草案。表1國內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)情況標(biāo)準(zhǔn)號名稱SN/T1869-2007食品中多種致病菌快速檢測方法PCR法SN/T2641-2010食品中常見致病菌檢測PCR-DHPLC法SN/T1088-2010布氏桿菌檢疫技術(shù)規(guī)范GB4789.10-2016

食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗金黃色葡萄球菌檢驗GB4789.14-2014食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗蠟樣芽胞桿菌檢驗GB4789.7-2013

食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗副溶血性弧菌檢驗GB4789.8-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗SN/T1962-2007食品中克雷伯氏菌檢測方法SN/T1022-2010進出口食品中霍亂弧菌檢驗方法GB/T26426-2010飼料中副溶血性弧菌的檢測GB/T26427-2010飼料中蠟樣芽孢桿菌的檢測GB4789.44-2020食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗創(chuàng)傷弧菌檢驗GB4789.11-2014

食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗β型溶血性鏈球菌檢驗GB/T28642-2012

飼料中沙門氏菌的快速檢測方法聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法DB22/T2692-2017飼料中金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌檢測雙重微滴數(shù)字PCR法T/SDAQI044-2021飼料中產(chǎn)黃曲霉毒素真菌的檢測實時熒光PCR方法TSDAQI043-2021飼料中沙門氏菌、副溶血性弧菌、志賀氏菌三重?zé)晒舛縋CR快速檢測方法SN/T2582-2010產(chǎn)黃曲霉毒素真菌PCR檢測方法NY/T3691-2020糧油作物產(chǎn)品中黃曲霉鑒定技術(shù)規(guī)程NY/T2311-2013

黃曲霉菌株產(chǎn)毒力鑒定方法DB22/T2051-2014飼料中肉毒梭菌測定PCR方法DB41/T1589-2018飼料中單核細胞增生李斯特氏菌的檢測EMA-PCR法（廢止）DB41/T1586-2018飼料中志賀氏菌的檢測EMA-PCR法（廢止）DB41/T1590-2018飼料中阪崎腸桿菌的檢測EMA-PCR法（廢止）ISO/TS13136-2012Microbiologyoffoodandanimalfeed—Real-timepolymerasechainreaction(PCR)-basedmethodforthedetectionoffood-bornepathogens—HorizontalmethodforthedetectionofShigatoxin-producingEscherichiacoli(STEC)andthedeterminationofO157,O111,O26,O103andO145serogroupsISO/TS6579-2:2012Microbiologyoffoodandanimalfeed—Horizontalmethodforthedetection,enumerationandserotypingofSalmonella—Part2:Enumerationbyaminiaturizedmostprobablenumbertechnique表2準(zhǔn)備樣品編號產(chǎn)品名稱產(chǎn)品類型源性性狀用途1SPF級維持鼠料全價配合飼料植物源性顆粒鼠飼料2實驗動物配合飼料（C級）精料混合料植物源性顆粒兔飼料3實驗動物配合飼料（C級）濃縮飼料植物源性顆粒豚鼠飼料4饞不膩全價益生菌犬糧全價配合飼料動物源性顆粒狗飼料5胖小虎全價小型犬成犬糧全價配合飼料動物源性顆粒狗飼料6艾美康腸道護理全價無谷凍干貓糧雞肉口味全價配合飼料動物源性顆粒貓飼料7路斯L98低溫烘焙全價鮮肉貓糧全價配合飼料動物源性顆粒貓飼料8錦鯉育成飼料（中粒）全價配合飼料植物源性顆粒魚飼料9志道鯉38道白餌料全價配合飼料植物源性顆粒魚飼料10紫花苜蓿粉添加劑預(yù)混料植物源性粉末蚯蚓飼料11高檔海水魚苗微粒子配合飼料全價配合飼料植物源性顆粒魚飼料配合飼料可按基本類型分為添加劑預(yù)混料、濃縮飼料、全價配合飼料和精料混合料等4種類型。本次收集的樣品均為配合飼料。此外，不同用途的飼料一般成分差異較大，可以更加全面的驗證不同飼料對PCR擴增的影響，不同類型和不同性狀對增菌有影響，也可能對PCR擴增產(chǎn)生影響。由于驗證的致病基因較多，工作量較大，因此，本次只收集了11個有代表性的配合飼料樣品做驗證試驗。3.確定技術(shù)路線，進行驗證實驗2023年7月～2023年8月：進一步進行實驗，對草案進行完善并按照GB/T1.1-2020形成了標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿。4.定向征求意見2023年10月8日~2024年4月31日，本標(biāo)準(zhǔn)定向征求意見發(fā)函單位50個，回函單位33個，其中提出有修改意見的單位12個，共收到意見49條，采納34條，部分采納2條，不采納13條，對未采納意見進行了說明，詳情見《征求意見匯總處理表》。無重大分歧意見。5.實驗驗證2024年3月，由廣電計量檢測集團股份有限公司、廣州匯標(biāo)技術(shù)檢測中心及廣東博沃特生物科技有限公司對制定的檢測方法進行不同實驗室間方法驗證。6.依據(jù)反饋意見對標(biāo)準(zhǔn)進行完善2024年5月~8月：根據(jù)反饋意見，對定向征求意見進行修改，完善標(biāo)準(zhǔn)正文和編制說明，形成標(biāo)準(zhǔn)送審稿。7申請技術(shù)審查待補充相關(guān)內(nèi)容。8報批本標(biāo)準(zhǔn)編制過程中沒有重大意見分歧。七、技術(shù)指標(biāo)設(shè)置的科學(xué)性和可行性，量化指標(biāo)的確定依據(jù)。經(jīng)過對食品和飼料致病菌相關(guān)分子檢測標(biāo)準(zhǔn)分析并結(jié)合PCR擴增常見問題，主要對DNA提取試劑、引物特異性等幾個方面進行驗證。最后對飼料樣品進行檢測驗證。1.DNA提取試劑以金黃色葡萄球菌GDMCC1.481、蠟樣芽胞桿菌GDMCC1.3589和創(chuàng)傷弧菌GDMCC1.2459，進行驗證，分別將樣品加標(biāo)（活化好的菌加20μL，下同）到樣品1（見樣品表2）中按照傳統(tǒng)方法（標(biāo)準(zhǔn)中有相應(yīng)說明）進行增菌培養(yǎng)，取增菌液0.5mL，DNA提取采用5%chelex100和0.1%chelex100提取DNA，煮沸時間分別為10min，和5min，PCR擴增結(jié)果顯示0.1%chelex100和5%chelex100結(jié)果無明顯差別，煮沸時間為5min和10min結(jié)果也無明顯差異。PCR擴增結(jié)果見圖1。其中金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌為革蘭氏陽性菌，根據(jù)DNA提取經(jīng)驗，以金黃色葡萄球菌DNA提取最為困難，chelex100可以提取金黃色葡萄球菌DNA滿足PCR擴增需要。采用chelex100樹脂法提取純菌的DNA用于PCR擴增，大量的實驗經(jīng)驗表明樹脂濃度高一些，PCR擴增成功率更高，故采用5%chelex100煮沸5min，作為飼料致病基因DNA提取首選方法，規(guī)程中也允許采用DNA提取試劑盒方法提取DNA。圖1樣品1不同DNA提取方法的電泳圖，注：“金”表示金黃色葡萄球菌，“創(chuàng)”表示創(chuàng)傷弧菌，“蠟”表示蠟樣芽胞桿菌1.0.1%chelex100煮沸5min2.0.1%chelex100煮沸10min3.5%chelex100煮沸5min4.5%chelex100煮沸10minM為marker，條帶大小由上至下依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp（下文所用marker均同）2.引物驗證由于引物來源于食品標(biāo)準(zhǔn)《SN/T1869-2007食品中多種致病菌快速檢測方法PCR法》和《SN/T2641-2010食品中常見致病菌檢測PCR-DHPLC法》，故引物不需要用不同致病菌驗證引物的特異性。但由于飼料樣品成分復(fù)雜，飼料成分對致病菌PCR擴增，是否影響致病菌特異性條帶識別，本次選用金黃色葡萄球菌GDMCC1.481、蠟樣芽胞桿菌GDMCC1.3589、創(chuàng)傷弧菌GDMCC1.2459、溶血性鏈球菌GDMCC1.245、腸出血性大腸埃希氏菌GDMCC1.1869、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌GDMCC1.940、肺炎克雷伯氏桿菌GDMCC1.1222、霍亂弧菌GDMCC1.2719、副溶血性弧菌GDMCC1.306、單增李斯特氏菌GDMCC1.2408、空腸彎曲桿菌GDMCC1.4508等11個致病菌通過對11個不同種類的飼料樣品進行致病菌污染，11個致病菌均能夠擴增出明亮的特異性條帶，然而部分樣品有非特性條帶產(chǎn)生，PCR擴增結(jié)果見圖2。對非特異性條帶樣品提高退火溫度，非特異性條帶還是存在，說明擴增的條帶產(chǎn)生的原因是由于飼料成分的影響，但個別非特異性條帶不影響結(jié)果判定。通過引物加標(biāo)驗證，來源于食品標(biāo)準(zhǔn)《SN/T1869-2007食品中多種致病菌快速檢測方法PCR法》和《SN/T2641-2010食品中常見致病菌檢測PCR-DHPLC法》的引物可以適用于飼料樣品的檢測。圖2致病菌在11個飼料樣品中PCR擴增電泳圖（加標(biāo)）注：“1-11”表示11個樣品，編號見樣品表2，“N”表示陰性對照，“P”表示陽性對照，“M”為marker，條帶大小同圖1，“金”表示金黃色葡萄球菌，“蠟”蠟樣芽孢桿菌，“創(chuàng)”表示創(chuàng)傷弧菌，“溶”表示溶血性鏈球菌，“肺”表示肺炎克雷伯氏桿菌，“腸”表示腸出血性大腸埃希氏菌，“副”表示副溶血性弧菌，“霍”表示霍亂弧菌，“小”表示小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌，“空”表示空腸彎曲桿菌，“單”表示單增李斯特氏菌，下同。3.非加標(biāo)飼料樣品檢測驗證首先，采用金黃色葡萄球菌引物驗證11個非加標(biāo)飼料樣品，增菌后樣品DNA未經(jīng)無菌ddH2O水洗，直接采用chelex100提取DNA，該方法源于食品標(biāo)準(zhǔn)《SN/T1870-2007》，擴增結(jié)果如圖3（金1）所示，大量樣品在100bp左右擴增有條帶，但條帶大小小于132bp（金黃色葡萄球菌目標(biāo)條帶），例如樣品1、3、4、5、6、8、10、11，擴增分析金黃色葡萄球菌比較有迷惑性，條帶很淡，部分樣品還是單一條帶，條帶產(chǎn)生原因很可能為飼料一些成分的存在促進產(chǎn)生引物二聚體，基于此分析，取5、6、10、11無菌ddH2O水洗后再提取DNA，擴增顯示該位置條帶近乎消失，無菌d