2雞球蟲耐藥性檢測技術(shù)GB/T6682—2008分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法.4符號與縮略詞DNA：脫氧核糖核酸（DeoxyribonucleicacPCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymerasechainreactddH2O：雙蒸水（Distillation-distir/min：離心機每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)（Revolutionperppm：百萬分比濃度（PartspermilACI：抗球蟲指數(shù)（Anticoccidialindex）POAA：最適抗球蟲活性百分率（PercentageoptimumanticoccidialactivRLS：病變記分減少率（ReducedlesionscROP：相對卵囊產(chǎn)量（RelativeoocystproducOPG：克糞便卵囊數(shù)（Oocystcountper5待檢雞球蟲卵囊的制備5.1試劑與材料5.1.1試劑35.1.2材料糞便收集桶、玻璃棒、50目篩網(wǎng)、100目篩網(wǎng)、量筒、燒杯、血球計數(shù)板、微量移液器及配套吸頭5.1.4儀器高速離心機、低速大容量離心機、顯微鏡、恒溫水浴培養(yǎng)箱、PCR擴增儀、核酸電泳儀、核酸上層懸浮液，加入4倍體積水稀釋，離心5min，棄上清。所得沉淀以2.5%重鉻酸鉀溶液重懸，在25~28℃、150r/min條件下震蕩培養(yǎng)1～3天，顯微鏡（10×10倍）檢查卵囊孢子化情況，當(dāng)80%以上卵囊完成孢子化時，停止培養(yǎng)，將孢子化卵囊樣品置4℃冷藏保存，保存時間應(yīng)不5.3蟲種鑒定反應(yīng)模板。陰性對照為雞球蟲陰性糞便樣品DNA，陽性對照為雞球蟲卵囊DNA，空白對照為無菌ddH?O。5.3.2直接鏡檢取卵囊懸液樣品，在顯微鏡（10×10倍）下隨機檢查100個孢子化卵囊的形態(tài)特征。根據(jù)卵囊形態(tài)5.3.3動物接種測對象為混合球蟲卵囊，可直接用于耐藥性檢測，無需進一5.4.1裂殖子感染法4離心5min，棄上清。沉淀用PBS緩沖液（pH7.4）洗滌3次，每次離心條件同上，棄上清。洗滌后的沉無球蟲感染的健康雞。感染后第5天剖殺雞只：毒3000r/min離心5min，棄上清，沉淀再用PBS緩沖液（pH7.4）洗滌3次，最終以PBS孢子化卵囊樣品置于4℃冷藏保存，保存時間應(yīng)不超過6個5.4.2單卵囊分離法5.4.2.1稀釋法取單個孢子化卵囊。將吸管內(nèi)液體滴加于鋪有薄層瓊脂的載玻片上，顯微鏡下確認(rèn)僅含1個孢子化卵囊5.4.2.2顯微操作分離法日齡雛雞，雛雞隔離飼養(yǎng)。感染后第5天起每日檢查糞便，觀察卵囊排出情況并收集糞便卵囊，分離卵飽和氯化鈉溶液、抗球蟲藥物見附錄A，配5選取約2周齡、無球蟲感染的健康雞，隨機分為藥物組（感染給藥組）、陽性對照組（感染不對照組）和陰性對照組（不感染不給藥對照組），每組設(shè)2個重復(fù)，給藥后第2天，各藥物組及陽性對照組雞只經(jīng)口接種待測卵囊，劑量為5×103～1.5×105個孢子化經(jīng)口感染后第7天結(jié)束試驗，試驗期間持續(xù)觀察雞只的精神狀態(tài)、糞便變化及病死情況，并監(jiān)測飼料消耗量和體重增重情況。在感染后第5~7天收集各組雞只算。各參數(shù)計算方法：存活率按式（3）計算；相對增重率按式（4）計算；病變值（計算。卵囊值（0～40）根據(jù)試驗組卵囊產(chǎn)量占感染不給藥對照組卵囊產(chǎn)量的比例換算，方 (式4) 601ACI的判定標(biāo)準(zhǔn)：ACI≥180，敏感，記為—；160≤＋； RLS=(感染不用藥對照組平均病變記分?感染用藥組平均病變記分)÷相對卵囊產(chǎn)量（ROP）反映藥物對卵囊排出的抑制作用，按式（9）7綜合ACI、POAA、RLS、ROP四項指標(biāo)的結(jié)果判定藥物耐藥性———+——+++++/++++8A.12.5%重鉻酸鉀溶液轉(zhuǎn)移溶液至1000mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，混勻，即為2.5%重鉻酸鉀溶A.2飽和氯化鈉溶液稱取過量（500g）氯化鈉（NaCl）固體，置于2000mL燒杯中，加入1000mL蒸餾水1，在恒溫條件下（25℃)攪拌1使其充分溶解。當(dāng)溶液中有少量固體NaCl不再溶解時，說明溶液已達飽和。靜置使未溶解的固體沉淀。將上層清澈的飽和溶液取出或過濾，置于密閉瓶，即為飽和氯A.3PBS緩沖液（pH7.4）mL蒸餾水溶解。于25℃下測定并調(diào)節(jié)pH至7.40，用蒸餾水定容至1000mL，混勻。經(jīng)0.22μm濾膜過濾滅A.5.1用法用量C10H9ClN4O2SC19H18N6O6C17H9Cl3N4O21C18H14F3N3O4SC18H16N4O4C24H35NO5C8H7N3O5C7H7Cl2NO9C15H14Cl3N5C47H80O17.H3N5C42H70O11C43H72O11C14H20Cl2N4C36H62O11C34H53NaO8C16H17BrClN3O33A.5.2制法B.1雞球蟲蟲種鑒定的PCR引物和擴增產(chǎn)物片段表B1雞球蟲蟲種鑒定的PCR引物和擴增產(chǎn)AATTTAGTCCATCGCAACCCTACCAGCATGCGCTCACAACCCAATAAATAGCGCAAAATTAAGCAGATCAGTTTGAGCAAACCT），）；D.1雞球蟲純種卵囊感染的腸道病變記分見表D1；混合卵囊感染的腸道病變見分分分分分分分+2+3+4病變數(shù)量較多，盲腸內(nèi)容物明顯帶血，盲腸壁稍增厚，內(nèi)容物正分分分分分分+2+3分+4分從小腸中段漿膜面看有多量的出血點，也可見中段腸許多針尖狀出血點；腸內(nèi)容物含量少；充氣達小腸后段，小腸粗度明顯加大小腸因嚴(yán)重出血而呈暗紅色、褐色，大部分腸管氣脹明顯腸腔內(nèi)充滿血液和黏膜組織的碎片；從漿膜面看，在感染部位組織見到或紅色病灶，在死亡雞只病灶為白色和黑色可見寄生蟲性肉芽腫，腸管增粗一倍，長短縮短一倍。因毒害艾美耳球分分分分分分分+2+3+4小腸壁增厚，有帶血的卡他性滲出物，直腸段有橫向的紅小腸后段可出現(xiàn)廣泛的凝固性壞死；病變可擴展到小腸中小腸黏膜面的干性壞死膜可能使小腸出現(xiàn)皺痕及干酪樣盲分分分分