單分子免疫檢測技術在疾病診療中的應用與研究進展2025單分子免疫檢測技術是一種“數字化”的免疫檢測方法，通過將免疫復合物限制在極小的體積內（nl以下），實現信號的絕對計數。這種方法能夠高靈敏度地檢測低豐度生物標志物，其檢測下限可達fg/ml級，即1×10

-16

mol/L，比傳統(tǒng)免疫分析技術的精度提高了1000倍

［

1］

。因此，該技術被認為是未來免疫學發(fā)展的重要方向

［

2,3］

，為精準醫(yī)學的發(fā)展提供技術保障

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4］

。一、單分子免疫檢測技術概述1.單分子免疫檢測技術原理：單分子免疫檢測技術通過一定的信號檢測手段實現單個抗原分子的信號檢測。目前主流的單分子免疫檢測技術主要包含單分子酶催化信號放大，或直接單分子熒光成像。在具體實施層面，單分子免疫檢測技術的原理主要包括4個部分，即免疫復合體的形成、離散、識別和計數。免疫復合體的形成主要基于“三明治”式免疫反應結構，通過磁珠或多孔板作為載體，實現“抗體-抗原-抗體”免疫復合物結構。具體而言，捕獲抗體特異性結合靶蛋白的一個表位，同時使用結合靶蛋白另一表位的標記抗體，形成雙抗體夾心的免疫復合物；在反應過程中，根據標記物質的種類，可使用酶顯試示劑、適用于單分子熒光成像的熒光材料或其他能夠實現信號放大的分子或材料；通過液滴、微陣列等不同的離散技術，對單個信號分子進行識別，并以數字信號“0”和“1”進行標記，標記所有檢測單元

［

5］

；在計數過程中，通過計算“0”和“1”信號單元的比例或數量，將其轉化為數字信號，實現超高靈敏度定量分析

［

6］

。2.單分子免疫檢測技術的優(yōu)勢：傳統(tǒng)的免疫檢測技術，如酶聯免疫吸附法測定（enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）和普通化學發(fā)光法（chemiluminescentimmunoassay，CLIA），它們通常依賴光學和電化學檢測手段，其原理是通過捕獲信號強度并使用標準曲線換算，檢測免疫反應后試劑溶液的整體濃度信號。與傳統(tǒng)免疫檢測技術相比，單分子免疫檢測技術采用高靈敏度檢測元件，避免背景信號的干擾，可檢測到極低濃度的生物分子濃度（

表1

）。對于精準醫(yī)學診斷中的血液蛋白質定量檢測，單分子免疫分析是不可或缺的重要手段

［

7］

。該技術能夠在短時間內準確定量疾病發(fā)生和發(fā)展過程中產生的微量關鍵蛋白。單分子免疫檢測技術的優(yōu)勢在于提高免疫檢測靈敏度，從而發(fā)現血液樣本中的低豐度蛋白表達。例如，在淋巴瘤發(fā)展早期階段，血液中的腫瘤標志物濃度通常處于10

-16~10

-12

mol/L。而大多數臨床實驗室采用的傳統(tǒng)免疫測定技術難以滿足超低濃度標志物的檢測需求

［

8］

。為了實現早期診斷和治療監(jiān)測，需要一個高效、數據質量好、低成本且自動化的超靈敏蛋白質檢測系統(tǒng)。二、單分子免疫檢測技術的應用現狀1.單分子免疫檢測技術研究進展：目前，單分子免疫檢測模式主要分為兩類：原位檢測和隨機分配檢測

［

9］

。原位檢測是指在預設的固定區(qū)域內完成免疫復合物的形成和檢測，信號通過高靈敏度檢測設備讀取，如電傳感器、超高分辨率近場掃描顯微鏡和等離子納米孔等方法

［

10,11,12］

。然而，由于這些儀器依賴于高精密度光學系統(tǒng)實現單分子水平檢測，制造成本高昂。且由于信號易受干擾，對操作流程和環(huán)境要求較高，原位檢測尚難以廣泛應用于臨床

［

13］

。隨機分配檢測模式是指在信號檢測時，將免疫復合物隨機分配到指定的檢測區(qū)域內，以提高局部濃度和檢測靈敏度

［

14］

。這些檢測區(qū)域的體積通?？刂圃诩{升級以下?；谖㈥嚵行酒?/p>

［

15］

和微液滴

［

16］

的單分子免疫檢測均屬于隨機分配方式。微陣列芯片通過在小型芯片上集成大量反應點實現高通量檢測，而微液滴技術則將樣本分隔成獨立的微小液滴進行單分子分析。隨機分配檢測模式更易于實現自動化和商業(yè)化應用。單分子陣列技術（singlemoleculearray，Simoa）是目前最具代表性的基于微陣列的單分子隨機分配方式，該技術使用磁珠收集免疫復合物，并根據泊松分布原理，即通過將免疫復合物以稀疏的方式隨機分配到大量反應孔中，從而使得一定概率下，每個反應孔中只包含不超過一個目標分子將其單獨包含在Simoa陣列中，被稱為“數字ELISA”。Simoa技術被視為單分子免疫檢測的“金標準”，對于特定靶標的檢測靈敏度可達到zmol/L（1×10

-21

mol/L），并可平行檢測多個指標

［

17,18］

。然而，由于分析儀需要光學元件和流體處理系統(tǒng)，儀器體積大，空間和環(huán)境要求較高，在臨床診療中有一定局限性，無法滿足床旁檢測（point-of-caretesting，POCT）的需求。同時，高昂的設備價格（25萬~40萬美金）和較高的單次測試成本（10~20美金）也限制了該技術的大規(guī)模推廣應用。另一種微液滴分配方式，形成fl級油包水微液滴，成本更低，能夠應用于POCT，但芯片制作工藝尚不成熟，需要進一步發(fā)展。2.基于單分子免疫檢測技術的檢驗方法學比較：單分子免疫檢測技術在檢驗醫(yī)學實驗室中有多種實施途徑，包括直接單分子成像

［

19］

、單分子掃描

［

20］

和數字化信號放大

［

21］

等（

表2

）。每種途徑都有其獨特的優(yōu)勢和局限性

［

22］

。綜上所述，單分子免疫檢測技術在臨床檢驗實驗室中能夠提供高靈敏度的檢測手段，特別在需要高精度和高靈敏度分析的應用中表現突出。然而，其較高的設備及耗材成本、操作流程復雜和穩(wěn)定性差等局限性需要在臨床應用中進行權衡。為了滿足臨床檢驗需求，單分子免疫檢測技術應在自動化、穩(wěn)定性、準確性、靈敏度和操作簡便性方面進行優(yōu)化，這將推動其在檢驗醫(yī)學中的廣泛應用和發(fā)展。3.國產單分子免疫分析儀器自動化檢測流程：目前，國內已有多家廠家成功研制單分子免疫自動化分析儀。檢測流程主要包括2個類型：（1）原位單分子熒光成像：首先，儀器自動從樣本中取樣，并將其與包被捕獲抗體的磁珠快速混合；第二步，經過孵育后，自動加入單分子信號標記的檢測抗體，進行進一步混合和孵育；第三步，利用磁吸附技術將混合物中的磁珠吸附到流通池表面，進行洗滌以去除雜質，確保檢測的純凈度和準確性；最后，儀器對單分子信號進行成像和分析，并利用標準曲線計算樣本中靶蛋白的濃度。（2）基于隨機分配的單分子酶催化信號放大：儀器將樣本加入到包被捕獲抗體的磁珠快速混合后，加入偶聯了生物素分子的檢測抗體，并進一步加入鏈霉親和素標記的半乳糖苷酶。將形成的磁珠復合物洗凈后使用熒光底物復溶，快速分散至微孔陣列芯片中，使用油相密封微孔。捕獲了目標分子的磁珠由于標記了對應的半乳糖苷酶，可以催化熒光底物產生熒光信號。最后，儀器對單分子信號進行成像和分析，并利用標準曲線計算樣本中靶蛋白的濃度。目前，國產單分子免疫自動化分析儀采用了更易于臨床使用的產品設計，每個樣本檢測時間為5~6min，可以實現低至100fg/ml的檢測下限，能夠檢測極低濃度的目標蛋白質，更適用于靶蛋白痕量檢測的微量分析和臨床應用。該儀器檢測通量能夠達到90測試/h，極大地提高了檢測效率，進入到商業(yè)化發(fā)展進程。三、單分子免疫檢測技術在疾病診斷與治療中的應用目前，單分子免疫檢測技術主要應用于癌癥、傳染病、神經退行性疾病等領域，并在疾病的早期診斷和預防中展示了其重要價值。以下是單分子免疫檢測技術在不同領域的具體應用。1.單分子免疫檢測技術在神經標志物檢驗中的應用：單分子免疫檢測技術在神經退行性疾病領域起步較早，多項研究證明該技術有利于阿爾茨海默?。ˋlzheimerdisease，AD）的早期診斷和預后評估，其靶標包括微管蛋白相關單位蛋白（tubulinassociatedunitprotein，Tau）

［

23］

、β淀粉樣蛋白（amyloidbeta，Aβ）

［

24］

、神經絲輕鏈蛋白（neurofilamentlightchain，NfL）

［

25］

、膠質纖維酸性蛋白（glialfibrillaryacidicprotein，GAFP）

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26］

等。由于血腦屏障的限制，腦源性神經標志物在血液中濃度較低，增加了檢測難度；同時，血液成分復雜，容易對檢測造成干擾，因此，臨床檢測中多使用標志物豐度較高的腦脊液樣本

［

27］

。然而，腦脊液樣本需通過腰椎穿刺術獲取，采樣難度大且對患者存在一定損傷風險，并可能導致診斷延誤。為此，臨床上一直在探索以血液替代腦脊液進行檢測的方法，以期在保持極低物質濃度檢測的前提下確保檢測的準確性

［

28］

。這也為單分子免疫檢測技術帶來了新的機遇和挑戰(zhàn)。Tao等

［

29］

利用單分子免疫檢測技術發(fā)現了18種血清蛋白在不同AD階段表現異常，開發(fā)了8個血清標志物，為血液檢測在AD早期臨床篩查和分期中的應用奠定了基礎。Zhang等

［

30］

通過檢測靶向磷酸化Tau蛋白（p-tau217）的單克隆抗體，評估血漿p-tau217的水平與AD患者腦萎縮和認知障礙之間的相關性，揭示了p-tau217在AD疾病進展中神經變性過程發(fā)揮的關鍵作用，并開發(fā)了相應的免疫治療策略。除神經退行性疾病外，單分子免疫檢測技術還廣泛應用于其他神經科學疾病的研究和診斷，包括帕金森病

［

31］

、多發(fā)性硬化癥

［

32］

、視神經脊髓炎

［

33］

以及神經罕見病等。有研究證明NfL在評估運動神經元受損疾病的嚴重程度中具有潛在作用

［

34］

。2.單分子免疫檢測技術在心臟標志物檢驗中的應用：在心臟標志物檢驗中，高敏心肌肌鈣蛋白（high-sensitivitycardiactroponin，hs-cTn）作為急性心肌梗死（acutemyocardiacinfarction，AMI）的“金標準”標志物尤為重要，其檢測下限和變化值對于早期診斷至關重要。Wang等

［

35］

開發(fā)了一種無須洗滌的方法，能在10min內使用一步數字免疫法檢測cTnI。此外，血漿中cTnT的單分子免疫檢測技術也已被研發(fā)，Jing等

［

36］

利用這一技術對臨床血漿樣本進行了驗證，顯示出cTnT濃度和變化值與臨床結果高度一致。3.單分子免疫檢測技術在免疫炎癥標志物檢驗中的作用：干燥綜合征（Sjogren′ssyndrome，SS）是一種自身免疫性疾病，而Ⅰ型干擾素（interferon，IFN）是其免疫調節(jié)蛋白。在SS患者中，IFN-α和IFN-β通過細胞內激酶和轉錄因子介導的信號通路，激活一系列干擾素刺激基因，這些基因過表達可以增強免疫細胞的活性，導致對自身組織的攻擊增加

［

37］

。Huijser等

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38］

使用單分子免疫檢測技術對IFN-α2亞型進行精準定量，發(fā)現原發(fā)性SS患者的IFN-α2血漿水平遠高于正常人，且相比于ELISA方法，重復性更好。單分子免疫檢測技術可以在小鼠模型的腦裂解液中檢測極微量的白細胞介素-1β（interleukin-1beta，IL-1β）和腫瘤壞死因子α（tumornecrosisfactor-alpha，TNF-α）以研究白質損傷罕見?。╝dult-onsetleukoencephalopathywithaxonalspheroidsandpigmentedglia，ALSP）的致病機制及米諾環(huán)素的治療效果

［

39］

。4.單分子免疫檢測技術在感染性疾病檢驗中的作用：免疫檢測技術自動化水平高，交叉污染風險小，實驗環(huán)境要求低，檢測成本較低。但由于傳統(tǒng)免疫檢測技術靈敏度有限，難以實現病原體的精準檢測。受益于超高檢測靈敏度，單分子免疫檢測技術將有機會在感染性疾病的病原體檢測領域嶄露頭角。在感染性疾病領域，單分子免疫檢測技術主要用于病原體標志物及細胞因子的檢驗。例如，單分子免疫檢測技術可以直接定量檢測人體血液中的新型冠狀病毒核衣殼蛋白，作為核酸檢測的補充手段進行早期感染判斷

［

40,41］

。同樣由于單分子免疫檢測技術擁有低濃度水平檢測的靈敏度，研究表明在人類免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiencyvirus，HIV）感染后第14天即可在感染細胞上清液中檢測到HIVp24，而使用ELISA方法則需到第21天

［

42］

。這種提高的靈敏度和縮短的檢測時間為早期HIV檢測提供了一個強有力的工具，從而能夠更好地監(jiān)測病毒復制并可能進行早期干預。同時，在從抗逆轉錄病毒療法抑制的HIV感染者的外周血中利用單分子免疫檢測技術檢測HIVp24蛋白的定量可低至1fg，用于HIV治療過程中病情發(fā)展的監(jiān)測

［

43］

。肺結核潛伏期由于結核桿菌體外培養(yǎng)困難和痰細菌檢查漏檢率高，很難獲得確鑿的潛伏期感染證據。Ben等

［

44］

利用單分子免疫檢測技術檢測IFN的分型蛋白，有效區(qū)分潛伏感染者，幫助制定更有效的結核病控制策略。通過檢測血漿載脂蛋白E（apolipoproteinE，ApoE）蛋白濃度，單分子免疫檢測技術還可評估新型冠狀病毒感染率和疾病嚴重程度之間的關系

［

45］

。5.單分子免疫檢測技術在腫瘤標志物中的應用：在癌癥領域，腫瘤的早期診斷、治療監(jiān)測、預后和復發(fā)風險評估一直是人類面臨的巨大挑戰(zhàn)。癌癥是一種非常復雜的疾病，根據惡性腫瘤的部位和細胞學形態(tài)又可以細分為許多亞型，目前臨床上使用的腫瘤標志物仍然面臨識別有限的問題。應用單分子免疫檢測技術檢測腫瘤標志物，如前列腺特異抗原（prostate-specificantigen，PSA）、堿性磷酸酶（alkalinephosphatase，ALP）及其同型酶，以及其他生物標志物的微小變化，可用于監(jiān)測和評估癌癥風險，識別良性和惡性腫瘤細胞，或評估患者對化療的敏感性。Jiang等

［

46］

利用單分子免疫檢測技術對比不同ALP分型所致的健康狀況差異。在提高靈敏度的前提下，通過檢測PSA在放療患者中的微小變化，Simoa技術能夠提前發(fā)現腫瘤復發(fā)

［

47］

。Keegan等

［

48］

使用Simoa技術測量了非小細胞肺癌（nonsmall-celllungcancer，NSCLC）患者在免疫治療前和治療期間的血漿細胞因子白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）水平。Simoa技術可以在單細胞水平上檢測蛋白質，這在提高臨床檢測效率和大規(guī)模篩查新靶點方面發(fā)揮了重要作用

［

49］

。6.新型標志物檢測方法的開發(fā)：Wang等

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50］

開發(fā)了一種檢測AD新型生物標志物突觸囊泡蛋白2A（synapticvesicleglycoprotein2A，SV2A）的試劑盒，評估了SV2A水平與AD患者疾病進展之間的相關性，血清SV2A是AD高效預警和早診的標志物。Shi等

［

51］

發(fā)現白血病抑制因子（leukaemiainhibitoryfactor，LIF）水平有助于判斷胰管腺癌的治療效果。單分子免疫檢測技術還應用于外泌體、循環(huán)腫瘤DNA和微小RNA檢測

［

52,53,54