一、引言外泌體作為細胞分泌的納米級囊泡，攜帶來源細胞的蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等生物分子，在細胞間通訊、疾病診斷與治療等領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大潛力。精準的外泌體實驗方案是開展相關(guān)研究的核心基礎(chǔ)，其分離純度、鑒定準確性及功能驗證的可靠性直接影響研究結(jié)論的科學(xué)性。本文結(jié)合前沿研究技術(shù)與實踐經(jīng)驗，系統(tǒng)闡述外泌體實驗的全流程操作要點，為科研工作者提供可參考的實驗范式。二、樣本收集與預(yù)處理（一）細胞培養(yǎng)上清樣本1.細胞培養(yǎng)：選取對數(shù)生長期的目的細胞（如腫瘤細胞、干細胞等），采用無外泌體血清（或無血清培養(yǎng)基）培養(yǎng)48~72小時，避免血清中外泌體的干擾。若使用含血清培養(yǎng)基，需提前通過超速離心（100,000×g，16小時，4℃）去除血清外泌體，經(jīng)0.22μm濾膜過濾后備用。2.上清收集：收集細胞培養(yǎng)上清時，先以300×g離心10分鐘（4℃）去除懸浮細胞，再以2,000×g離心10分鐘（4℃）去除細胞碎片，最后經(jīng)0.22μm濾膜過濾，獲得澄清的待分離上清，置于冰上或-80℃暫存（短期保存建議4℃，避免反復(fù)凍融）。（二）體液樣本（血清、尿液、腦脊液等）1.血清樣本：采集全血后室溫靜置30分鐘待凝固，3,000×g離心15分鐘（4℃）分離血清，再經(jīng)0.22μm濾膜過濾，去除纖維蛋白及細胞殘渣。若需長期保存，可分裝后-80℃凍存，避免反復(fù)凍融導(dǎo)致外泌體降解。2.尿液樣本：留取中段尿，4℃條件下3,000×g離心15分鐘去除細胞及沉淀，上清經(jīng)0.22μm濾膜過濾后，可直接用于分離或-80℃凍存。需注意尿液中蛋白濃度低，分離時可適當擴大樣本量。三、外泌體分離純化方法（一）超速離心法（經(jīng)典金標準）原理：利用外泌體與其他囊泡、蛋白復(fù)合物的密度及沉降系數(shù)差異，通過梯度離心實現(xiàn)分離。操作步驟：1.取預(yù)處理后的樣本（細胞上清或體液），置于超速離心管中，4℃條件下依次進行：10,000×g離心30分鐘，去除大囊泡及蛋白聚集體；100,000×g離心70分鐘（或120,000×g離心90分鐘），使外泌體沉降；棄上清，用預(yù)冷的PBS（或無血清培養(yǎng)基）重懸沉淀，再次以100,000×g離心70分鐘，洗滌外泌體以去除殘留蛋白。2.最終沉淀用適量PBS重懸，即為粗提外泌體，可立即用于后續(xù)實驗或-80℃凍存。注意事項：離心管需嚴格平衡，避免超速離心機失衡；全程保持4℃，防止外泌體膜結(jié)構(gòu)破壞；重復(fù)離心可提高純度，但會損失部分產(chǎn)量。（二）密度梯度離心法（提高純度）原理：通過蔗糖或碘克沙醇等密度梯度介質(zhì)，使不同密度的囊泡在離心場中分層，外泌體（密度1.13~1.19g/mL）可與高密度蛋白復(fù)合物、低密度微囊泡分離。操作步驟：1.制備密度梯度：將蔗糖溶液（如0.25、0.8、1.25M）或碘克沙醇溶液（如5%、20%、40%）依次鋪于超速離心管中，形成連續(xù)或不連續(xù)梯度；2.樣本鋪于梯度上層，100,000×g離心16~20小時（4℃）；3.用注射器從管底分層吸取不同密度組分，通過WB或NTA鑒定外泌體所在層，收集后用PBS透析或稀釋，去除梯度介質(zhì)。優(yōu)勢：純度高于超速離心法，適用于外泌體功能研究或蛋白組學(xué)分析。（三）免疫親和捕獲法（特異性分離）原理：利用外泌體表面標志物（如CD63、CD9、EpCAM等）的抗體，通過免疫磁珠或免疫親和柱特異性捕獲外泌體。操作步驟（以磁珠法為例）：1.將包被抗體的磁珠（如抗CD63磁珠）與預(yù)處理樣本4℃孵育2~4小時，輕柔振蕩；2.用磁力架分離磁珠-外泌體復(fù)合物，棄上清；3.用含蛋白酶抑制劑的PBS洗滌磁珠3次，去除未結(jié)合雜質(zhì)；4.加入洗脫液（如甘氨酸-HCl，pH2.5）洗脫外泌體，立即用Tris-HCl中和pH。優(yōu)勢：可富集特定來源或功能的外泌體，適用于微量樣本或標志物研究。（四）試劑盒法（簡便高效）原理：基于聚合物沉淀（如PEG）或柱層析原理，通過試劑與外泌體的相互作用實現(xiàn)快速分離。操作步驟（以PEG沉淀法為例）：1.樣本與沉淀試劑（如PEG8000溶液）按比例混合，4℃孵育過夜；2.10,000×g離心1小時（4℃），棄上清；3.沉淀用PBS重懸，經(jīng)0.22μm濾膜過濾，去除聚合物殘留。優(yōu)勢：操作簡單、耗時短，適合高通量樣本，但純度略低于超速離心法，需結(jié)合后續(xù)鑒定優(yōu)化。四、外泌體鑒定（一）形態(tài)學(xué)鑒定：透射電子顯微鏡（TEM）1.樣本制備：取10μL外泌體重懸液，滴加至碳支持膜銅網(wǎng)上，靜置5分鐘；2.用濾紙吸去多余液體，滴加2%磷鎢酸（pH6.8）負染5分鐘，濾紙吸去染液后自然干燥；3.透射電鏡下觀察，外泌體典型形態(tài)為“茶托狀”或“杯狀”囊泡，直徑30~150nm。（二）粒徑與濃度分析：納米顆粒跟蹤分析（NTA）1.儀器準備：預(yù)熱NTA儀器，校準激光及攝像頭；2.樣本處理：將外泌體重懸液用PBS稀釋至合適濃度（通常10^8~10^9particles/mL），避免顆粒重疊；3.檢測與分析：注入樣本，設(shè)置檢測參數(shù)（如溫度25℃、檢測時間60秒），儀器自動分析顆粒的粒徑分布、濃度及流體力學(xué)半徑。（三）蛋白標志物檢測：WesternBlot（WB）1.蛋白提?。和饷隗w樣本加入RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30分鐘，12,000×g離心15分鐘（4℃），取上清；2.電泳與轉(zhuǎn)膜：按常規(guī)WB流程，分離膠濃度10%~12%，轉(zhuǎn)膜采用濕轉(zhuǎn)或半干轉(zhuǎn)；3.抗體孵育：一抗選擇外泌體標志物（如CD63、CD9、TSG101）及陰性對照（如Calnexin，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白，外泌體中應(yīng)為陰性），4℃孵育過夜；4.顯影：二抗室溫孵育1小時，ECL或化學(xué)發(fā)光底物顯影，觀察條帶。五、外泌體功能驗證實驗（一）細胞攝取實驗1.外泌體標記：用PKH67（綠色熒光）或DiI（紅色熒光）標記外泌體：將外泌體與染料在無血清培養(yǎng)基中37℃孵育30分鐘，用PBS洗滌2次（100,000×g離心70分鐘）去除游離染料；2.共孵育：將標記的外泌體與受體細胞（如腫瘤細胞、內(nèi)皮細胞）共孵育（濃度1×10^9particles/mL，時間2~24小時）；3.觀察與檢測：熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡觀察細胞內(nèi)熒光信號，或流式細胞術(shù)定量分析攝取效率。（二）功能調(diào)控實驗（以促增殖為例）1.細胞分組：設(shè)置對照組（無外泌體）、外泌體處理組（不同濃度或來源的外泌體）；2.處理與檢測：外泌體與細胞共培養(yǎng)24~72小時，采用CCK-8、EdU或MTT法檢測細胞增殖活性，或通過WesternBlot檢測增殖相關(guān)蛋白（如PCNA、Ki-67）的表達。（三）體內(nèi)功能驗證（可選）通過尾靜脈注射或瘤內(nèi)注射標記的外泌體，觀察其在體內(nèi)的分布、靶組織攝取及對疾病進程（如腫瘤生長、組織修復(fù)）的影響，需結(jié)合動物模型設(shè)計實驗。六、注意事項與常見問題解決（一）樣本質(zhì)量控制新鮮樣本優(yōu)先：體液樣本采集后應(yīng)立即處理，避免室溫放置過久導(dǎo)致外泌體降解；無菌操作：全程使用無酶、無熱源耗材，防止微生物污染；避免反復(fù)凍融：外泌體凍存后應(yīng)一次性使用，若需分裝，建議小體積（如100μL）保存。（二）分離效率優(yōu)化超速離心參數(shù)調(diào)整：根據(jù)樣本類型（如細胞上清或血清）優(yōu)化離心轉(zhuǎn)速和時間，可通過預(yù)實驗確定最佳條件；聯(lián)合分離法：如“超速離心+免疫親和”，兼顧純度與特異性；外泌體產(chǎn)量評估：通過NTA或BCA蛋白定量，對比不同方法的產(chǎn)量差異。（三）鑒定結(jié)果異常分析TEM無典型形態(tài)：可能是負染過度或樣本濃度過低，需調(diào)整染色時間或增加樣本量；NTA粒徑分布異常：可能是樣本聚集或污染，需優(yōu)化稀釋倍數(shù)或重新分離；WB無標志物條帶：可能是上樣量不足或抗體效價低