DBS220132013食品安全地方標準植物源性食品中α玉米赤霉烯醇和赤霉烯酮的測定液相色譜質(zhì)譜質(zhì)譜法1范圍本標準規(guī)定了植物源性食品中α玉米赤霉烯醇和赤霉烯酮殘留量的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。本標準適用于谷物、豆類、堅果、蔬菜、水果等植物源性食品中α玉米赤霉烯醇和赤霉烯酮含量的測定。本標準的方法定量限：α玉米赤霉烯醇為5μg/kg，赤霉烯酮為10μg/kg。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T27404實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測3原理試樣中的α玉米赤霉烯醇和赤霉烯酮經(jīng)乙腈水溶液提取，通過免疫親和柱凈化，以液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定，外標法定量。4試劑和材料除非另有說明，本標準所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級水。4.1試劑4.1.1乙腈（CH?CN）：色譜純4.1.2甲醇（CH?OH）：色譜純4.1.3甲酸（HCOOH）：色譜純4.1.4氯化鈉（NaCl）4.1.5無水硫酸鈉（Na?SO?）：650℃灼燒4h，冷卻后置于干燥器中備用4.2標準品4.2.1α玉米赤霉烯醇標準品：純度≥98%4.2.2赤霉烯酮標準品：純度≥98%4.3標準溶液配制4.3.1標準儲備溶液：分別準確稱取α玉米赤霉烯醇和赤霉烯酮標準品各10.0mg，用乙腈溶解并定容至100mL，配制成100μg/mL的標準儲備溶液，于18℃避光保存，有效期6個月。4.3.2混合標準中間溶液：分別吸取α玉米赤霉烯醇和赤霉烯酮標準儲備溶液各1.0mL，用乙腈定容至100mL，配制成1μg/mL的混合標準中間溶液，于4℃避光保存，有效期1個月。4.3.3系列標準工作溶液：用乙腈水（1:9，v/v）溶液將混合標準中間溶液逐級稀釋，配制成α玉米赤霉烯醇濃度為1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL，赤霉烯酮濃度為2ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的系列標準工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。4.4材料4.4.1免疫親和柱：對α玉米赤霉烯醇和赤霉烯酮具有特異性吸附能力，柱容量≥200ng4.4.2微孔濾膜：0.22μm，有機系4.4.3一次性注射器：10mL5儀器和設(shè)備5.1液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀：配電噴霧離子源（ESI）5.2分析天平：感量0.0001g和0.01g5.3均質(zhì)器：轉(zhuǎn)速≥10000r/min5.4離心機：轉(zhuǎn)速≥4000r/min5.5氮吹儀5.6渦旋混合器5.7超聲波清洗器5.8固相萃取裝置5.9pH計：精度±0.015.10移液器：10μL、100μL、1000μL、5000μL6試樣制備與保存6.1試樣制備6.1.1谷物和豆類：取代表性樣品約500g，用粉碎機粉碎，全部通過20目篩，混勻后裝入潔凈容器中，密封備用。6.1.2堅果：取代表性樣品約500g，去殼后用粉碎機粉碎，全部通過20目篩，混勻后裝入潔凈容器中，密封備用。6.1.3蔬菜和水果：取代表性樣品約1000g，可食部分用組織搗碎機搗碎，混勻后裝入潔凈容器中，密封備用。6.2試樣保存7分析步驟7.1提取7.1.1稱取5.0g（精確至0.01g）試樣于50mL聚丙烯離心管中，加入20mL乙腈水（84:16，v/v）提取溶液。7.1.2加入4g氯化鈉，蓋上蓋子，渦旋混合1min，然后以10000r/min均質(zhì)提取2min。7.1.3以4000r/min離心5min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一潔凈離心管中。7.1.4殘渣中加入10mL乙腈水（84:16，v/v）提取溶液，重復(fù)提取一次，合并上清液。7.1.5合并后的提取液中加入5g無水硫酸鈉，渦旋混合1min，以4000r/min離心5min，取上清液待凈化。7.2凈化7.2.1將免疫親和柱連接到固相萃取裝置上，依次用5mL甲醇和5mL水活化免疫親和柱，流速控制在12mL/min。7.2.2將7.1.5中的提取液以12mL/min的流速通過免疫親和柱。7.2.3用5mL水淋洗免疫親和柱，棄去淋洗液。7.2.4用3mL甲醇洗脫，收集洗脫液于10mL玻璃試管中。7.2.5將洗脫液在40℃水浴中用氮氣吹至近干，用1.0mL乙腈水（1:9，v/v）溶液溶解殘渣，渦旋混合30s，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定。7.3測定a)色譜柱：C18柱，100mm×2.1mm，1.7μm或性能相當者；b)流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；c)梯度洗脫程序：0min，10%B；05min，10%90%B；57min，90%B；77.5min，90%10%B；7.510min，10%B；d)流速：0.3mL/min；e)柱溫：40℃；f)進樣量：5μL。a)離子源：電噴霧離子源（ESI）；b)掃描方式：負離子掃描；c)檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；d)毛細管電壓：3.0kV；e)源溫度：150℃；f)脫溶劑氣溫度：500℃；g)脫溶劑氣流速：800L/h；h)錐孔氣流速：50L/h；i)碰撞氣：氬氣；j)定性離子對、定量離子對、錐孔電壓和碰撞能量見表1。表1α玉米赤霉烯醇和赤霉烯酮的質(zhì)譜參數(shù)|化合物名稱|母離子(m/z)|子離子(m/z)|錐孔電壓(V)|碰撞能量(eV)||||||||α玉米赤霉烯醇|319.1|275.1，160.0|30|20，35||赤霉烯酮|317.1|131.0，175.0|35|25，30|7.4定性測定按照上述條件測定試樣和標準工作溶液，如果試樣中色譜峰的保留時間與標準工作溶液中相應(yīng)色譜峰的保留時間一致，偏差在±2.5%以內(nèi)；且試樣中定性離子對的相對豐度與濃度相當?shù)臉藴使ぷ魅芤褐卸ㄐ噪x子對的相對豐度一致，相對豐度偏差不超過表2規(guī)定的范圍，則可判定為試樣中存在該組分。表2定性確證時相對離子豐度的最大允許偏差|相對離子豐度（%）|>50|>2050|>1020|≤10||||||||允許偏差（%）|±20|±25|±30|±50|7.5定量測定7.5.1標準曲線繪制將系列標準工作溶液分別按7.3所述條件進行測定，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。α玉米赤霉烯醇和赤霉烯酮的標準曲線相關(guān)系數(shù)應(yīng)不低于0.995。7.5.2試樣測定將試樣提取液按7.3所述條件進行測定，根據(jù)標準曲線計算試樣中α玉米赤霉烯醇和赤霉烯酮的含量。8結(jié)果計算試樣中α玉米赤霉烯醇和赤霉烯酮的含量按式（1）計算：X=(C×V)/m式中：X——試樣中α玉米赤霉烯醇或赤霉烯酮的含量，單位為微克每千克（μg/kg）；C——從標準曲線上查得的提取液中α玉米赤霉烯醇或赤霉烯酮的濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；V——試樣提取液的最終定容體積，單位為毫升（mL）；m——試樣的質(zhì)量，單位為克（g）。計算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。9精密度9.1重復(fù)性在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的15%。9.2再現(xiàn)性在再現(xiàn)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的20%。10檢出限和定量限10.1檢出限本方法中α玉米赤霉烯醇的檢出限為2μg/kg，赤霉烯酮的檢出限為4μg/kg。10.2定量限本方法中α玉米赤霉烯醇的定量限為5μg/kg，赤霉烯酮的定量限為10μg/kg。11質(zhì)量控制11.1空白試驗每批樣品分析時應(yīng)同時進行空白試驗，空白試驗中不得檢出目標化合物。11.2加標回收每批樣品分析時應(yīng)同時進行加標回收試驗，加標水平應(yīng)覆蓋低、中、高三個濃度，回收率應(yīng)在70%120%之間。11.3標準曲線每批樣品分析時應(yīng)繪制標準曲線，標準曲線的相關(guān)系數(shù)應(yīng)不低于0.995。11.4質(zhì)控樣品每批樣品分析時應(yīng)同時分析質(zhì)控