ICS11.220

B41

DB34

安徽省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB34/T3660—2020

鴨肝炎病毒1型和3型雙重RT-PCR

檢測方法

DuplexRT-PCRassayfordetectionofduckhepatitisvirustype1andtype3

文稿版次選擇

2020-08-03發(fā)布2020-09-03實(shí)施

安徽省市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB34/T3660—2020

前言

本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。

本標(biāo)準(zhǔn)由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所提出。

本標(biāo)準(zhǔn)由安徽省農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所、安徽省動物疫病預(yù)防與控制中心、太湖縣小

池鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)農(nóng)村綜合服務(wù)中心、合肥野生動物園、銅陵市動物疫病預(yù)防與控制中心、銅陵市義安區(qū)畜牧獸

醫(yī)局。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：潘孝成、占松鶴、沈?qū)W懷、何學(xué)豐、郭長進(jìn)、范萍萍、尹磊、趙瑞宏、戴銀、

何為俊、吳娟、胡曉苗、侯宏艷、周學(xué)利、張丹俊、周迎春、王軍。

I

DB34/T3660—2020

鴨肝炎病毒1型和3型雙重RT-PCR檢測方法

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了鴨肝炎病毒1型（DHV-1）和鴨肝炎病毒3型（DHV-3）雙重RT-PCR檢測方法的技術(shù)要求。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于鴨病變肝組織、接種疑似病料的鴨胚尿囊液或細(xì)胞培養(yǎng)物中DHV-1型和DHV-3型核酸的

檢測。

2縮略語

下列縮略語適用于本文件。

DHV：鴨肝炎病毒(duckhepatitisvirus）

RT-PCR：反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reversetranscription-polymerasechainreaction）

RNA：核糖核酸（ribonucleicacid）

DNA：脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）

DEPC：焦炭酸二乙酯（diethylpyrocarbonate）

Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）

dNTP：脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）

M-MLV：莫洛尼氏鼠白血病病毒（moloneymurineleukemiavirus）

PBS：磷酸緩沖液（phosphatebuffersolution）

TAE：Tris-乙酸電泳緩沖液（trisacetate-EDTAbuffer）

EB：溴化乙錠（ethidiumbromide）

3主要儀器

3.1PCR擴(kuò)增儀。

3.2臺式低溫高速離心機(jī)（最大離心力12000g以上）。

3.3電泳儀。

3.4凝膠成像系統(tǒng)。

3.5冰箱（-20℃；-80℃）。

3.6微波爐。

3.7分析天平（感量0.01g）。

3.8水浴鍋。

3.9微量移液器（2.5μL；10μL；200μL；1000μL）。

4試劑

4.1RNA抽提試劑：Trizol或其他商品化RNA提取試劑。

4.2氯仿、異丙醇、無水乙醇，均為分析純。

1

DB34/T3660—2020

4.3M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶。

4.4RNA酶抑制劑。

4.5DEPC處理的滅菌水。

4.6TaqDNA聚合酶。

4.7dNTP。

4.8DNA分子標(biāo)準(zhǔn)（DNAMarker）。

4.9RT-PCR反應(yīng)試劑。

4.10EB（10μg/μL）或核酸染料。

4.11磷酸鹽緩沖液（PBS，0.01mol/L，pH7.2），見附錄A中的A.1。

4.1250×TAE電泳緩沖液，見附錄A中的A.2。

4.131％瓊脂糖凝膠，見附錄A中的A.3。

4.14引物：DHV-1擴(kuò)增上游引物，5’-GGTGATTCTAACCAGTTGGGG-3’，下游引物，

5’-TTCAATTTCCAGATTGAGTTCAAA-3’；DHV-3擴(kuò)增上游引物，5’-GATGTAGTTATGGTGCTTAGACGC-3’，下游

引物，5’-ACGAACCAGCCATTGACG-3’，引物濃度均為10pmol/μL。

4.15陽性對照樣品：DHV-1和DHV-3鴨胚接種尿囊液毒；陰性對照樣品：正常鴨胚尿囊液。

5樣品的采集及處理

5.1采樣工具

15mL離心管、1.5mL離心管、剪刀、鑷子和研缽，經(jīng)121（±2）℃，15min高壓滅菌并烘干。

5.2采樣與處理

5.2.1鴨病變肝組織

采取病死或剖殺鴨的肝組織1g左右，按1:5倍體積加入0.01mol/LpH7.2PBS，研磨凍融3

次，裝入15mL滅菌離心管中，8000g離心10min，取上清液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，-80℃保存?zhèn)?/p>

用。

5.2.2鴨胚尿囊液和細(xì)胞培養(yǎng)物

鴨胚尿囊液、細(xì)胞培養(yǎng)物凍融3次，轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

6RT-PCR檢測

6.1RNA提取

6.1.1用Trizol或其他商品化RNA提取試劑提取待測樣品、陽性對照和陰性對照樣品的RNA。

6.1.2200μL的樣品和800μLTrizol置于一個1.5mL離心管，反復(fù)顛倒混勻，室溫靜置5min。

6.1.312000g4℃離心5min，吸取上清液移入新的離心管中，加入200μL氯仿，劇烈振蕩15s，

室溫靜置5min。

6.1.412000g4℃離心15min，吸取上清液移入新的離心管中（注意不要吸出中間層），加入等體

積異丙醇，上下顛倒混勻，室溫靜置10min。

6.1.512000g4℃離心10min，小心棄去上清液，加入75％乙醇1mL（DEPC水配制）。

6.1.612000g4℃離心5min，棄去乙醇，室溫干燥2～5min，加入適量DEPC水，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2

DB34/T3660—2020

6.2反轉(zhuǎn)錄（cDNA合成）

6.2.1在PCR反應(yīng)管中依次加入：OligodTPrimerorRandomPrimers1μL，dNTPs(10mmol/L)1μL，

檢測樣品RNA3μL，DEPC水6μL。

6.2.2水浴鍋或PCR儀中，65℃作用5min，冰上急冷2min。

6.2.3在上述反應(yīng)管中再依次加入：

——5×RTBuffer4μL，RNaseInhibitor（40U/μL）0.5μL，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶（200U/μL）1μL，

DEPC水3.5μL。

6.2.4PCR儀中，42℃作用60min，再70℃作用15min，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

6.3PCR反應(yīng)

6.3.1PCR反應(yīng)體系

10×PCRBuffer2.5μL，DHV-1和DHV-3上游引物各1μL，DHV-1和DHV-3下游引物各1μL，

dNTPs(2.5mmol/L)2μL，TaqDNA聚合酶0.25μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5μL，滅菌去離子水11.25μL，

總反應(yīng)體系25μL。

6.3.2PCR反應(yīng)條件

94℃5min；94℃1min，52℃50s，72℃1min，35個循環(huán)；72℃10min。

6.4電泳檢測

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5μL與2μL上樣緩沖液混合，點(diǎn)樣于1％瓊脂糖凝膠板加樣孔中，瓊脂糖凝

膠板一側(cè)點(diǎn)樣孔加入DNAMarkerIII，緩沖液為1×TAE，以5V/cm電壓電泳30min左右。電泳后，

置于凝膠成像系統(tǒng)下觀察，根據(jù)DNA分子質(zhì)量大?。―NAmarker）判斷RT-PCR擴(kuò)展產(chǎn)物大小。

7結(jié)果判定

7.1當(dāng)陽性對照在預(yù)期大小的位置720bp和642bp出現(xiàn)特異性條帶，陰性對照均未出現(xiàn)預(yù)期大小

目的條帶時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立。

7.2被檢樣品在720bp位置出現(xiàn)特異性條帶為DHV-1核酸陽性，被檢樣品在642bp位置出現(xiàn)特異

性條帶為DHV-3核酸陽性。如圖1所示。

3

DB34/T3660—2020

圖中：

M——DL2000Marker；

1——陽性對照樣品；

2——DHV-1陽性樣品；

3——DHV-3陽性樣品；

4——陰性對照樣品。

圖1PCR擴(kuò)增電泳圖

4

DB34/T3660—2020

AA

附錄A

（規(guī)范性附錄）

試劑配制

A.10.01mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液（PBS）的配制

A.1.10.2mol/L磷酸氫二鈉溶液：稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）71.6g，先加適量滅菌去離子

水溶解，最后定容至1000mL，混勻。

A.1.20.2mol/L磷酸二氫鈉溶液：稱取磷酸二氫鈉（NaH2PO4·H2O）27.6g，先加適量滅菌去離子水

溶解，最后定容至1000mL，混勻。

A.1.3量取0.2moL/L磷酸氫二鈉溶液36mL，0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液14mL，稱取氯化鈉8.

5g，加滅菌去離子水800mL，調(diào)pH值至7.2，最后定容至1000mL，4℃保存。

A.2電泳緩沖液（50倍）

A.2.10.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉（EDTA）溶液（pH8.0）

二水乙二銨四乙酸二鈉（分析純）18.61g

滅菌雙蒸水80mL

氫氧化鈉（分析純）