基于結(jié)構(gòu)解析：天然產(chǎn)物虛擬篩選技術(shù)革新與分子機(jī)理深度洞察一、引言1.1研究背景與意義天然產(chǎn)物作為藥物研發(fā)的重要源泉，在醫(yī)藥領(lǐng)域中一直占據(jù)著舉足輕重的地位。從遠(yuǎn)古時(shí)期人類利用天然草藥治病，到現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中眾多臨床藥物直接或間接來(lái)源于天然產(chǎn)物，其在治療疾病、保障人類健康方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約40%的臨床藥物直接或間接來(lái)源于天然產(chǎn)物，例如青蒿素、紫杉醇、嗎啡等，這些藥物不僅拯救了無(wú)數(shù)生命，也為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。天然產(chǎn)物是生物體在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有結(jié)構(gòu)多樣性和獨(dú)特的生物活性。其結(jié)構(gòu)多樣性使得天然產(chǎn)物能夠與各種生物大分子相互作用，從而展現(xiàn)出廣泛的生物活性，如抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗炎等。這種結(jié)構(gòu)與活性的多樣性為藥物研發(fā)提供了豐富的先導(dǎo)化合物，是創(chuàng)新藥物發(fā)現(xiàn)的寶貴資源。然而，天然產(chǎn)物資源的開(kāi)發(fā)和利用面臨諸多挑戰(zhàn)。一方面，天然產(chǎn)物的來(lái)源有限，許多珍稀物種的獲取受到保護(hù)限制，且從天然資源中提取有效成分的過(guò)程往往復(fù)雜且成本高昂；另一方面，天然產(chǎn)物庫(kù)的篩選工作難度大，傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)篩選方法效率低、成本高，難以滿足大規(guī)模篩選的需求。因此，如何高效地從天然產(chǎn)物中挖掘具有藥用價(jià)值的成分，成為藥物研發(fā)領(lǐng)域亟待解決的問(wèn)題?；诮Y(jié)構(gòu)的虛擬篩選技術(shù)為解決上述問(wèn)題提供了新的途徑。該技術(shù)借助計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)方法，通過(guò)構(gòu)建分子模型和藥效團(tuán)分析，能夠快速、高效地從大規(guī)模天然產(chǎn)物庫(kù)中篩選出具有潛在生物活性的化合物。與傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)篩選方法相比，虛擬篩選具有成本低、速度快、可大規(guī)模篩選等優(yōu)勢(shì)，能夠在短時(shí)間內(nèi)對(duì)大量化合物進(jìn)行初步評(píng)估，大大提高了篩選效率，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究提供了有價(jià)值的線索。深入探究天然產(chǎn)物的分子機(jī)理對(duì)于藥物研發(fā)同樣至關(guān)重要。了解天然產(chǎn)物與生物大分子之間的相互作用機(jī)制，不僅可以揭示其藥效發(fā)揮的本質(zhì)，為藥物設(shè)計(jì)和優(yōu)化提供理論依據(jù)，還能幫助我們發(fā)現(xiàn)新的藥物作用靶點(diǎn)，拓展藥物研發(fā)的思路和方向。例如，通過(guò)研究天然產(chǎn)物與靶蛋白的結(jié)合模式、作用力類型以及對(duì)蛋白功能的影響等，我們可以有針對(duì)性地對(duì)先導(dǎo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾和優(yōu)化，提高其活性和選擇性，降低毒副作用，從而加速新藥的研發(fā)進(jìn)程。綜上所述，基于結(jié)構(gòu)的天然產(chǎn)物虛擬篩選和分子機(jī)理研究具有重要的科學(xué)意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。通過(guò)本研究，有望開(kāi)發(fā)出高效的虛擬篩選方法，挖掘出更多具有藥用潛力的天然產(chǎn)物化合物，并深入闡明其分子作用機(jī)制，為創(chuàng)新藥物的研發(fā)提供理論支持和技術(shù)支撐，推動(dòng)藥物研發(fā)領(lǐng)域的發(fā)展，造福人類健康。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在天然產(chǎn)物虛擬篩選方法的研究方面，國(guó)外起步較早，發(fā)展較為成熟。美國(guó)斯克利普斯研究所（ScrippsResearchInstitute）的研究團(tuán)隊(duì)在虛擬篩選技術(shù)上取得了諸多突破。他們提出通過(guò)計(jì)算輔助合成規(guī)劃（CASP）和虛擬篩選技術(shù)輔助設(shè)計(jì)合成路線，構(gòu)建虛擬庫(kù)并通過(guò)反應(yīng)性篩選優(yōu)化合成路線，成功實(shí)現(xiàn)了二十五種天然存在的吡啶惡烷的合成，有效避免了傳統(tǒng)合成方法中繁瑣的試錯(cuò)過(guò)程，提高了合成效率。在虛擬篩選算法和軟件方面，國(guó)外也處于領(lǐng)先地位，如DOCK、AutoDock等軟件被廣泛應(yīng)用于分子對(duì)接和虛擬篩選研究，這些軟件不斷更新升級(jí)，在評(píng)分函數(shù)、對(duì)接精度和計(jì)算速度等方面持續(xù)優(yōu)化，為虛擬篩選提供了強(qiáng)大的技術(shù)支持。國(guó)內(nèi)近年來(lái)在天然產(chǎn)物虛擬篩選領(lǐng)域也取得了顯著進(jìn)展。浙江大學(xué)藥學(xué)院徐騰飛團(tuán)隊(duì)提出了創(chuàng)新的天然產(chǎn)物鑒定方法，結(jié)合虛擬篩選、化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等多種先進(jìn)技術(shù)，提出了虛擬篩選-相互作用-表型（NP-VIP）研究策略。該策略以丹參提取物（SME）對(duì)缺血性中風(fēng)（IS）的治療研究為例，通過(guò)虛擬篩選獲得SME中生物活性化合物的綜合靶標(biāo)信息，再結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，顯著提高了靶點(diǎn)鑒定的準(zhǔn)確性與效率，為天然產(chǎn)物研究開(kāi)創(chuàng)了新的思路和方法。在天然產(chǎn)物分子機(jī)理探究方面，國(guó)外研究注重多學(xué)科交叉融合。例如，美國(guó)的一些研究團(tuán)隊(duì)利用X射線晶體學(xué)、核磁共振（NMR）等結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)，結(jié)合分子動(dòng)力學(xué)模擬、量子力學(xué)計(jì)算等理論方法，深入研究天然產(chǎn)物與生物大分子的相互作用機(jī)制。通過(guò)解析天然產(chǎn)物與靶蛋白的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)，能夠直觀地了解它們之間的結(jié)合模式和相互作用細(xì)節(jié)，為藥物設(shè)計(jì)提供精準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)信息。同時(shí)，分子動(dòng)力學(xué)模擬可以動(dòng)態(tài)地研究天然產(chǎn)物與靶蛋白在溶液環(huán)境中的相互作用過(guò)程，揭示其結(jié)合和解離的動(dòng)態(tài)過(guò)程以及對(duì)蛋白構(gòu)象和功能的影響。國(guó)內(nèi)在天然產(chǎn)物分子機(jī)理研究方面也有不少優(yōu)秀成果。中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所植物化學(xué)與西部植物資源持續(xù)利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的“創(chuàng)新藥與中藥現(xiàn)代研究”攻關(guān)團(tuán)隊(duì)，在對(duì)傳統(tǒng)中藥材丹參、土荊皮的研究中取得重要新進(jìn)展。從丹參主要成分中發(fā)現(xiàn)特異靶向關(guān)鍵免疫因子和免疫檢查點(diǎn)IDO1和TDO的新抑制劑，并闡明了其作用機(jī)制；利用化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)研究土荊皮甲酸PAA的潛在靶點(diǎn)，確認(rèn)PAA直接作用靶點(diǎn)之一是熱休克蛋白質(zhì)90（Hsp90），并深入研究了靶點(diǎn)Hsp90與PAA分子水平的相互作用，闡釋了土荊皮甲酸PAA作為新的Hsp90抑制劑通過(guò)caspase-8/caspase-3途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制。然而，目前國(guó)內(nèi)外在天然產(chǎn)物虛擬篩選和分子機(jī)理研究方面仍存在一些不足。在虛擬篩選方面，雖然各種方法和技術(shù)不斷涌現(xiàn)，但篩選的準(zhǔn)確性和可靠性仍有待提高。由于天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和多樣性，現(xiàn)有的分子對(duì)接評(píng)分函數(shù)和算法難以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)其與靶蛋白的結(jié)合親和力和活性，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果。此外，虛擬篩選過(guò)程中對(duì)配體和受體的柔性處理還不夠完善，難以充分考慮它們?cè)谙嗷プ饔眠^(guò)程中的構(gòu)象變化，影響了篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性。在分子機(jī)理研究方面，盡管多學(xué)科交叉為研究提供了有力手段，但對(duì)于一些復(fù)雜天然產(chǎn)物的作用機(jī)制仍缺乏深入全面的理解。天然產(chǎn)物往往具有多靶點(diǎn)、多途徑的作用特點(diǎn)，其與生物大分子之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，目前的研究方法還難以系統(tǒng)地解析這些復(fù)雜的相互作用關(guān)系。同時(shí)，在研究天然產(chǎn)物的體內(nèi)作用機(jī)制時(shí)，由于體內(nèi)環(huán)境的復(fù)雜性和動(dòng)態(tài)性，實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃蜋z測(cè)技術(shù)的局限性，使得準(zhǔn)確揭示其在體內(nèi)的作用過(guò)程和機(jī)制面臨較大挑戰(zhàn)。1.3研究?jī)?nèi)容與創(chuàng)新點(diǎn)本研究主要圍繞基于結(jié)構(gòu)的天然產(chǎn)物虛擬篩選和分子機(jī)理展開(kāi)，具體內(nèi)容涵蓋以下幾個(gè)方面：虛擬篩選方法的優(yōu)化與應(yīng)用：針對(duì)天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和多樣性，對(duì)現(xiàn)有的分子對(duì)接算法和評(píng)分函數(shù)進(jìn)行深入研究和優(yōu)化?？紤]配體和受體在相互作用過(guò)程中的柔性變化，引入更精確的柔性處理方法，如多構(gòu)象搜索和柔性殘基對(duì)接等，以提高虛擬篩選的準(zhǔn)確性和可靠性。利用優(yōu)化后的虛擬篩選方法，對(duì)大規(guī)模天然產(chǎn)物庫(kù)進(jìn)行篩選，建立高效的篩選流程和策略，從海量的天然產(chǎn)物中快速識(shí)別出具有潛在生物活性的化合物。天然產(chǎn)物與靶蛋白相互作用的分子機(jī)理研究：運(yùn)用X射線晶體學(xué)、核磁共振（NMR）等結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)，結(jié)合分子動(dòng)力學(xué)模擬、量子力學(xué)計(jì)算等理論方法，深入研究篩選出的天然產(chǎn)物與靶蛋白之間的相互作用機(jī)制。通過(guò)解析天然產(chǎn)物與靶蛋白的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)，明確它們之間的結(jié)合模式、作用力類型以及關(guān)鍵氨基酸殘基的作用。利用分子動(dòng)力學(xué)模擬動(dòng)態(tài)地研究天然產(chǎn)物與靶蛋白在溶液環(huán)境中的相互作用過(guò)程，分析結(jié)合和解離的動(dòng)態(tài)過(guò)程以及對(duì)蛋白構(gòu)象和功能的影響。多技術(shù)聯(lián)用揭示天然產(chǎn)物的體內(nèi)作用機(jī)制：結(jié)合化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等技術(shù)，系統(tǒng)研究天然產(chǎn)物在體內(nèi)的作用靶點(diǎn)和作用途徑。通過(guò)化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，鑒定天然產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的直接作用靶點(diǎn)，繪制天然產(chǎn)物-靶點(diǎn)相互作用圖譜；利用代謝組學(xué)技術(shù)，分析天然產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)的影響，揭示其作用的代謝通路和生物學(xué)過(guò)程。建立合適的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停鐒?dòng)物模型或細(xì)胞模型，驗(yàn)證虛擬篩選和分子機(jī)理研究的結(jié)果，進(jìn)一步深入探究天然產(chǎn)物在體內(nèi)的作用機(jī)制和藥效學(xué)特性。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：采用新算法提升虛擬篩選準(zhǔn)確性：在虛擬篩選過(guò)程中，創(chuàng)新性地引入機(jī)器學(xué)習(xí)算法和深度學(xué)習(xí)模型，對(duì)分子對(duì)接的評(píng)分函數(shù)進(jìn)行優(yōu)化和改進(jìn)。通過(guò)對(duì)大量已知活性化合物的學(xué)習(xí)和訓(xùn)練，使評(píng)分函數(shù)能夠更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)天然產(chǎn)物與靶蛋白的結(jié)合親和力和活性，降低假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，提高虛擬篩選的效率和可靠性。多技術(shù)聯(lián)用全面解析分子機(jī)理：綜合運(yùn)用多種先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和理論計(jì)算方法，從多個(gè)層面深入研究天然產(chǎn)物的分子機(jī)理。將結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)、分子動(dòng)力學(xué)模擬、化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等技術(shù)有機(jī)結(jié)合，不僅能夠揭示天然產(chǎn)物與靶蛋白之間的微觀相互作用機(jī)制，還能系統(tǒng)地解析其在體內(nèi)的作用靶點(diǎn)、作用途徑和代謝網(wǎng)絡(luò)，全面深入地理解天然產(chǎn)物的作用機(jī)制。構(gòu)建全新研究策略：提出“虛擬篩選-相互作用-表型（NP-VIP）”的創(chuàng)新研究策略，將虛擬篩選、化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等技術(shù)整合為一個(gè)有機(jī)整體。通過(guò)虛擬篩選獲得天然產(chǎn)物的潛在作用靶點(diǎn)，利用化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證和功能分析，再結(jié)合表型實(shí)驗(yàn)深入研究天然產(chǎn)物的生物學(xué)功能和藥理作用，顯著提高了靶點(diǎn)鑒定的準(zhǔn)確性與效率，為天然產(chǎn)物研究開(kāi)創(chuàng)了新的思路和方法。二、基于結(jié)構(gòu)的天然產(chǎn)物虛擬篩選方法2.1虛擬篩選技術(shù)概述虛擬篩選在藥物研發(fā)流程中占據(jù)著關(guān)鍵位置，發(fā)揮著不可或缺的作用，是藥物研發(fā)過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)，處于藥物發(fā)現(xiàn)階段的核心位置。傳統(tǒng)的藥物研發(fā)主要依賴實(shí)驗(yàn)篩選，從大量的化合物中尋找具有潛在生物活性的分子。然而，這種方法不僅耗費(fèi)大量的時(shí)間、人力和物力，而且篩選效率低下，難以滿足現(xiàn)代藥物研發(fā)對(duì)速度和成本的要求。虛擬篩選技術(shù)的出現(xiàn)，為藥物研發(fā)帶來(lái)了新的契機(jī)。它通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬的手段，在虛擬環(huán)境中對(duì)海量的化合物進(jìn)行篩選和評(píng)估，能夠快速地從眾多化合物中識(shí)別出具有潛在生物活性的分子，大大縮短了藥物研發(fā)的周期，降低了研發(fā)成本。在藥物研發(fā)流程中，虛擬篩選通常在早期階段進(jìn)行。在確定了藥物作用的靶標(biāo)后，研究人員首先利用虛擬篩選技術(shù)對(duì)大規(guī)模的化合物庫(kù)進(jìn)行篩選，從中挑選出與靶標(biāo)具有潛在結(jié)合能力的化合物。這些經(jīng)過(guò)虛擬篩選得到的化合物被稱為“苗頭化合物”（HitCompounds），它們具有進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)的潛力。與傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)篩選相比，虛擬篩選能夠在短時(shí)間內(nèi)處理大量的化合物，對(duì)化合物的活性進(jìn)行初步預(yù)測(cè)，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究提供有價(jià)值的線索和方向。常用的虛擬篩選技術(shù)類型主要包括基于分子對(duì)接的虛擬篩選、基于藥效團(tuán)的虛擬篩選、基于分子相似性的虛擬篩選以及基于定量構(gòu)效關(guān)系模型（QSAR）的篩選?；诜肿訉?duì)接的虛擬篩選是目前應(yīng)用最為廣泛的虛擬篩選技術(shù)之一。其基本原理是將配體分子放置在受體分子的活性位點(diǎn)處，通過(guò)不斷優(yōu)化配體的位置、構(gòu)象以及分子內(nèi)部可旋轉(zhuǎn)鍵的二面角等參數(shù)，尋找配體與受體之間的最佳結(jié)合模式。在這個(gè)過(guò)程中，需要考慮配體與受體之間的幾何互補(bǔ)性和能量互補(bǔ)性，以確保兩者能夠緊密結(jié)合。通過(guò)分子對(duì)接計(jì)算，可以得到配體與受體結(jié)合的親和力評(píng)分，根據(jù)評(píng)分的高低對(duì)化合物進(jìn)行排序，從而篩選出與受體結(jié)合能力較強(qiáng)的化合物。例如，在研究某抗癌藥物的研發(fā)過(guò)程中，利用分子對(duì)接技術(shù)將一系列潛在的配體分子與腫瘤相關(guān)的靶蛋白進(jìn)行對(duì)接，通過(guò)計(jì)算結(jié)合親和力，發(fā)現(xiàn)了幾種能夠與靶蛋白緊密結(jié)合的化合物，為后續(xù)的抗癌藥物開(kāi)發(fā)提供了重要的先導(dǎo)化合物。分子對(duì)接可以分為剛性對(duì)接、半柔性對(duì)接和柔性對(duì)接。剛性對(duì)接在對(duì)接過(guò)程中，研究體系（受體和配體）的構(gòu)象不發(fā)生變化，適合考察比較大的體系，如蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)間以及蛋白質(zhì)和核酸之間的對(duì)接。半柔性對(duì)接則允許配體的構(gòu)象在一定范圍內(nèi)變化，適合處理大分子和小分子間的對(duì)接，在對(duì)接過(guò)程中，小分子的構(gòu)象一般可以變化，但大分子是剛性的。柔性對(duì)接在對(duì)接過(guò)程中，研究體系的構(gòu)象基本上可以自由變化，一般用于精確考慮分子間的識(shí)別情況，但由于計(jì)算過(guò)程中體系的構(gòu)象可以變化，計(jì)算耗費(fèi)最大?；谒幮F(tuán)的虛擬篩選是根據(jù)藥物活性分子中對(duì)活性起著重要作用的“藥效特征元素”及其空間排列形式來(lái)進(jìn)行篩選的。這些“藥效特征元素”可以是某些具體的原子或原子團(tuán)，如氧原子、羥基、羰基等，也可以是抽象的化學(xué)功能結(jié)構(gòu)，如疏水基團(tuán)、氫鍵給體、氫鍵受體等。首先提取已知活性化合物的藥效團(tuán)模型，然后以此為模板在化合物庫(kù)中搜索具有相似藥效團(tuán)特征的化合物。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是速度快，能夠快速地從大量化合物中篩選出具有潛在活性的分子。例如，在開(kāi)發(fā)治療心血管疾病的藥物時(shí)，通過(guò)分析已知的心血管藥物的藥效團(tuán)特征，構(gòu)建了相應(yīng)的藥效團(tuán)模型，并利用該模型對(duì)化合物庫(kù)進(jìn)行篩選，成功地發(fā)現(xiàn)了一些具有潛在心血管活性的化合物?；诜肿酉嗨菩缘奶摂M篩選方法使用的前提是需要有確定活性的小分子，將此小分子視為模板，從化合物庫(kù)中過(guò)濾出與之相似的分子。通過(guò)提取分子指紋來(lái)比較相似性，提取分子指紋的算法有許多，包括拓?fù)渲讣y（TopologicalFingerprints）、MACCS指紋、原子對(duì)和拓?fù)渑まD(zhuǎn)指紋（AtomPairsandTopologicalTorsion）、摩根指紋（MorganFingerprints）等。這種方法能夠利用已知活性分子的結(jié)構(gòu)信息，快速找到結(jié)構(gòu)相似的化合物，這些化合物可能具有相似的生物活性。例如，已知某一種抗生素具有良好的抗菌活性，通過(guò)基于分子相似性的虛擬篩選，以該抗生素為模板，在化合物庫(kù)中找到了一些結(jié)構(gòu)相似的化合物，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)其中部分化合物也具有一定的抗菌活性?；诙繕?gòu)效關(guān)系模型（QSAR）的篩選是一種借助分子的理化性質(zhì)參數(shù)或結(jié)構(gòu)參數(shù)，以數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)手段定量研究有機(jī)小分子與生物大分子相互作用、有機(jī)小分子在生物體內(nèi)吸收、分布、代謝、排泄等生理相關(guān)性質(zhì)的方法。首先通過(guò)文獻(xiàn)搜集已報(bào)道有活性的分子，記錄下這些分子的結(jié)構(gòu)及活性數(shù)值（需要同一類活性數(shù)據(jù)，如同為IC50或同為抑制率）。從搜集到的分子結(jié)構(gòu)中計(jì)算或預(yù)測(cè)它們的物理化學(xué)性質(zhì)，如脂水分配系數(shù)（logP）、拓?fù)浔砻娣e（TSA）、分子量等，將這些計(jì)算出的信息和活性值一同作為模型的“訓(xùn)練數(shù)據(jù)”。建立起QSAR模型后，就可以利用該模型對(duì)化合物庫(kù)中的其他化合物進(jìn)行活性預(yù)測(cè)，篩選出具有潛在活性的化合物。例如，在研究一系列抗糖尿病藥物的構(gòu)效關(guān)系時(shí)，通過(guò)建立QSAR模型，對(duì)大量的化合物進(jìn)行活性預(yù)測(cè)，成功地發(fā)現(xiàn)了一些具有潛在抗糖尿病活性的化合物，為進(jìn)一步的藥物研發(fā)提供了重要的參考。2.2分子對(duì)接技術(shù)原理與應(yīng)用2.2.1分子對(duì)接的基本原理分子對(duì)接是一種基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)方法，旨在模擬配體與受體之間的相互作用，尋找它們之間的最佳結(jié)合模式。其核心思想是將配體分子放置在受體分子的活性位點(diǎn)處，通過(guò)不斷優(yōu)化配體的位置、取向、構(gòu)象以及分子內(nèi)部可旋轉(zhuǎn)鍵的二面角等參數(shù)，以實(shí)現(xiàn)配體與受體在幾何形狀和能量上的互補(bǔ)，從而找到兩者之間的最佳結(jié)合構(gòu)象。在分子對(duì)接過(guò)程中，需要考慮多個(gè)關(guān)鍵因素。首先是幾何互補(bǔ)性，即配體分子的形狀和大小應(yīng)與受體分子的活性位點(diǎn)相匹配，能夠緊密地嵌入活性位點(diǎn)中。例如，受體活性位點(diǎn)若呈口袋狀，配體分子應(yīng)具有相應(yīng)的形狀，能夠恰好填充該口袋，使得兩者之間的空間契合度達(dá)到最佳。其次是能量互補(bǔ)性，配體與受體結(jié)合時(shí)應(yīng)盡可能降低體系的能量，形成穩(wěn)定的復(fù)合物。這涉及到多種分子間作用力，如氫鍵、范德華力、靜電相互作用和疏水相互作用等。氫鍵是一種重要的分子間作用力，它發(fā)生在電負(fù)性較大的原子（如氧、氮等）與氫原子之間，具有方向性和飽和性。配體分子中的氫鍵供體（如羥基、氨基等）應(yīng)能夠與受體分子中的氫鍵受體（如羰基、羧基等）在合適的位置和方向上形成氫鍵，從而增強(qiáng)兩者之間的結(jié)合力。范德華力是分子間普遍存在的一種弱相互作用力，它包括色散力、誘導(dǎo)力和取向力。雖然范德華力的作用強(qiáng)度相對(duì)較弱，但在配體與受體的結(jié)合過(guò)程中，眾多范德華力的協(xié)同作用也能對(duì)結(jié)合穩(wěn)定性產(chǎn)生重要影響。靜電相互作用是由于分子中電荷分布不均勻而產(chǎn)生的，帶相反電荷的基團(tuán)之間會(huì)發(fā)生靜電吸引，有助于配體與受體的結(jié)合。疏水相互作用則是指非極性分子或基團(tuán)在水溶液中傾向于聚集在一起，以減少與水分子的接觸面積，從而降低體系的能量。在分子對(duì)接中，配體的疏水部分應(yīng)與受體活性位點(diǎn)的疏水區(qū)域相互匹配，形成疏水相互作用，這對(duì)于維持配體-受體復(fù)合物的穩(wěn)定性也起著重要作用。分子對(duì)接的過(guò)程通常包括以下幾個(gè)關(guān)鍵步驟。首先是受體和配體的準(zhǔn)備，需要獲取受體分子的三維結(jié)構(gòu)，這可以通過(guò)X射線晶體學(xué)、核磁共振（NMR）或冷凍電鏡等實(shí)驗(yàn)技術(shù)測(cè)定，也可以通過(guò)同源建模等方法預(yù)測(cè)。對(duì)于配體分子，需要構(gòu)建其三維結(jié)構(gòu)模型，并進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理，如添加氫原子、計(jì)算電荷、優(yōu)化構(gòu)象等。接下來(lái)是確定對(duì)接位點(diǎn)，即明確受體分子中與配體結(jié)合的活性位點(diǎn)。如果已知受體與配體的結(jié)合模式，可以直接指定結(jié)合位點(diǎn)；若結(jié)合模式未知，則可以通過(guò)一些方法預(yù)測(cè)活性位點(diǎn)，如基于受體結(jié)構(gòu)的特征分析、分子動(dòng)力學(xué)模擬等。在確定對(duì)接位點(diǎn)后，進(jìn)行構(gòu)象搜索，采用各種算法對(duì)配體分子在受體活性位點(diǎn)處的位置、取向和構(gòu)象進(jìn)行搜索，尋找可能的結(jié)合模式。常見(jiàn)的構(gòu)象搜索算法包括蒙特卡羅模擬、遺傳算法、分子動(dòng)力學(xué)模擬等。蒙特卡羅模擬是一種基于概率統(tǒng)計(jì)的方法，通過(guò)隨機(jī)改變配體分子的構(gòu)象，并根據(jù)一定的能量判據(jù)接受或拒絕新的構(gòu)象，逐步搜索到能量較低的構(gòu)象。遺傳算法則模擬生物進(jìn)化過(guò)程中的遺傳和變異機(jī)制，對(duì)配體分子的構(gòu)象進(jìn)行優(yōu)化。分子動(dòng)力學(xué)模擬則是在一定的力場(chǎng)下，對(duì)配體-受體復(fù)合物進(jìn)行動(dòng)力學(xué)模擬，通過(guò)模擬分子的運(yùn)動(dòng)軌跡，尋找穩(wěn)定的結(jié)合構(gòu)象。最后是對(duì)搜索得到的結(jié)合構(gòu)象進(jìn)行打分，使用打分函數(shù)評(píng)估配體與受體結(jié)合的親和力，根據(jù)打分結(jié)果對(duì)結(jié)合構(gòu)象進(jìn)行排序，選擇打分較高的構(gòu)象作為最佳結(jié)合模式。打分函數(shù)是分子對(duì)接中的關(guān)鍵要素，它根據(jù)配體與受體之間的相互作用能、幾何匹配程度等因素，對(duì)結(jié)合構(gòu)象進(jìn)行量化評(píng)價(jià)。常見(jiàn)的打分函數(shù)包括經(jīng)驗(yàn)性打分函數(shù)、基于力場(chǎng)的打分函數(shù)和基于知識(shí)的打分函數(shù)等。經(jīng)驗(yàn)性打分函數(shù)通過(guò)對(duì)大量已知活性化合物的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，建立結(jié)合親和力與分子結(jié)構(gòu)參數(shù)之間的經(jīng)驗(yàn)關(guān)系；基于力場(chǎng)的打分函數(shù)則根據(jù)分子力學(xué)原理，計(jì)算配體與受體之間的相互作用能；基于知識(shí)的打分函數(shù)則是從大量已知的配體-受體復(fù)合物結(jié)構(gòu)中提取知識(shí)，構(gòu)建打分模型。2.2.2分子對(duì)接在天然產(chǎn)物篩選中的應(yīng)用實(shí)例分子對(duì)接技術(shù)在天然產(chǎn)物篩選中具有廣泛的應(yīng)用，通過(guò)虛擬篩選能夠從海量的天然產(chǎn)物庫(kù)中快速識(shí)別出具有潛在生物活性的化合物，為新藥研發(fā)提供重要的先導(dǎo)化合物。以下將詳細(xì)介紹兩個(gè)具體的應(yīng)用實(shí)例，以展示分子對(duì)接在天然產(chǎn)物篩選中的實(shí)際操作與成果。浙江大學(xué)藥學(xué)院徐騰飛團(tuán)隊(duì)在研究丹參提取物（SME）治療缺血性中風(fēng)（IS）的作用機(jī)制時(shí)，采用分子對(duì)接技術(shù)進(jìn)行了深入研究。首先，對(duì)SME進(jìn)行全面的化學(xué)分析，運(yùn)用正交液相分離方法，先通過(guò)正相硅膠柱色譜按極性將SME分離成10個(gè)餾分，再利用反相C18柱色譜進(jìn)一步分離這些餾分，隨后用UPLC-MS/MS對(duì)每個(gè)餾分進(jìn)行組分鑒定。通過(guò)文獻(xiàn)綜述和串聯(lián)質(zhì)譜解釋進(jìn)一步分析SME的化學(xué)特征，利用GNPS分子網(wǎng)絡(luò)算法證明鑒定化合物之間的片段相似性，并使用Cytoscape軟件將結(jié)果可視化，最終在SME中發(fā)現(xiàn)了10個(gè)主要簇，共鑒定出151種化合物。接著，驗(yàn)證SME對(duì)缺血性中風(fēng)的體外和體內(nèi)療效。體外實(shí)驗(yàn)在PC12細(xì)胞中使用氧-葡萄糖剝奪/復(fù)氧（OGD/R）模型，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用大鼠永久性大腦中動(dòng)脈閉塞（pMCAO）模型。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SME對(duì)缺氧缺血性損傷發(fā)揮線粒體保護(hù)作用，從而提供神經(jīng)保護(hù)；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SME預(yù)處理減少大鼠腦中的缺血損傷，減輕了組織壞死，維持了細(xì)胞完整性，并減少神經(jīng)元凋亡。然后，進(jìn)行丹參提取物（SME）的虛擬篩選和靶標(biāo)預(yù)測(cè)。采用藥物開(kāi)發(fā)的ChemicalChecker（CC）平臺(tái)，通過(guò)將CC基于深度學(xué)習(xí)的多維相似性分析應(yīng)用于SME化合物，發(fā)現(xiàn)了SME中的兩種關(guān)鍵化合物丹酚酸C和丹酚酸B之間的結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)相似性，以及它們?cè)谂c其他相關(guān)分子結(jié)合后的共同靶標(biāo)。通過(guò)整合基于結(jié)構(gòu)相似性篩選和多維生物相似性分析得到的靶點(diǎn)信息，共鑒定出126個(gè)SME化合物的281個(gè)潛在靶蛋白。此外，使用“缺血性中風(fēng)”作為關(guān)鍵詞，將已確定的潛在靶點(diǎn)與DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行交叉分析，確定了29個(gè)可能涉及SME對(duì)抗IS的作用機(jī)制的共同靶標(biāo)。為了進(jìn)一步評(píng)估SME化合物與29種靶蛋白之間的結(jié)合相互作用，進(jìn)行批量分子對(duì)接。通過(guò)分子對(duì)接，深入了解SME中化合物與靶蛋白的結(jié)合模式和親和力，為后續(xù)研究SME治療缺血性中風(fēng)的分子機(jī)制提供了重要依據(jù)。通過(guò)對(duì)這些結(jié)合模式的分析，發(fā)現(xiàn)SME中的化合物可能通過(guò)與靶蛋白上的特定氨基酸殘基形成氫鍵、疏水相互作用等方式，穩(wěn)定地結(jié)合在靶蛋白的活性位點(diǎn)，從而調(diào)節(jié)靶蛋白的功能，發(fā)揮治療缺血性中風(fēng)的作用。例如，丹酚酸B可能與某一關(guān)鍵靶蛋白的活性位點(diǎn)處的幾個(gè)氨基酸殘基形成多個(gè)氫鍵，同時(shí)其疏水部分與周圍的疏水氨基酸殘基相互作用，使得丹酚酸B能夠緊密地結(jié)合在靶蛋白上，影響靶蛋白的構(gòu)象和活性，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)缺血性中風(fēng)相關(guān)的信號(hào)通路。另一個(gè)例子是對(duì)旋覆花內(nèi)酯的研究，旋覆花內(nèi)酯是一種從旋覆花中提取的天然產(chǎn)物，具有多種生物活性。研究人員運(yùn)用分子對(duì)接技術(shù)篩選UbcH5c抑制劑，UbcH5c是一種與細(xì)胞周期調(diào)控、DNA修復(fù)等過(guò)程密切相關(guān)的蛋白質(zhì)，其異常表達(dá)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。在實(shí)驗(yàn)中，首先從天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取旋覆花內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)信息，并對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理，使其符合分子對(duì)接的要求。同時(shí)，獲取UbcH5c的三維結(jié)構(gòu)，若該結(jié)構(gòu)未通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)定得到，可采用同源建模等方法構(gòu)建其結(jié)構(gòu)模型。然后，利用分子對(duì)接軟件將旋覆花內(nèi)酯與UbcH5c進(jìn)行對(duì)接，通過(guò)構(gòu)象搜索算法尋找旋覆花內(nèi)酯與UbcH5c的最佳結(jié)合模式。在對(duì)接過(guò)程中，考慮旋覆花內(nèi)酯與UbcH5c之間的幾何互補(bǔ)性和能量互補(bǔ)性，通過(guò)不斷優(yōu)化旋覆花內(nèi)酯的位置、取向和構(gòu)象，使其與UbcH5c的活性位點(diǎn)能夠緊密結(jié)合。對(duì)接完成后，使用打分函數(shù)對(duì)旋覆花內(nèi)酯與UbcH5c的結(jié)合構(gòu)象進(jìn)行打分，根據(jù)打分結(jié)果篩選出與UbcH5c結(jié)合親和力較高的旋覆花內(nèi)酯構(gòu)象。通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)篩選得到的旋覆花內(nèi)酯與UbcH5c具有較強(qiáng)的結(jié)合能力，能夠抑制UbcH5c的活性。進(jìn)一步的研究表明，旋覆花內(nèi)酯與UbcH5c結(jié)合后，可能通過(guò)改變UbcH5c的構(gòu)象，影響其與底物的結(jié)合能力，從而抑制UbcH5c參與的相關(guān)生物學(xué)過(guò)程。這一研究結(jié)果為開(kāi)發(fā)基于旋覆花內(nèi)酯的新型UbcH5c抑制劑提供了理論基礎(chǔ)，也展示了分子對(duì)接技術(shù)在從天然產(chǎn)物中篩選特定靶點(diǎn)抑制劑方面的有效性。2.3藥效團(tuán)模型構(gòu)建與篩選2.3.1藥效團(tuán)模型的構(gòu)建方法藥效團(tuán)模型構(gòu)建方法主要分為基于已知活性分子和基于受體結(jié)構(gòu)這兩類，它們?cè)谒幬镅邪l(fā)中都發(fā)揮著重要作用，各自具有獨(dú)特的流程和特點(diǎn)?；谝阎钚苑肿訕?gòu)建藥效團(tuán)模型時(shí)，首先需要收集一系列具有相同生物活性且結(jié)構(gòu)多樣化的小分子化合物，這些化合物被稱為訓(xùn)練集。例如在研發(fā)抗癌藥物時(shí)，收集多種已被證實(shí)具有抗癌活性，但結(jié)構(gòu)各異的小分子。接著，對(duì)訓(xùn)練集中的分子進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析和構(gòu)象搜索，通過(guò)量子力學(xué)計(jì)算、分子力學(xué)優(yōu)化等方法，獲得分子的穩(wěn)定構(gòu)象。這一步至關(guān)重要，因?yàn)榉肿拥臉?gòu)象會(huì)影響其與受體的結(jié)合方式和活性。然后，利用分子疊合技術(shù)，將這些活性分子的構(gòu)象進(jìn)行重疊，找出它們?cè)诳臻g結(jié)構(gòu)上的共同特征，這些共同特征即為藥效特征元素，如氫鍵給體、氫鍵受體、疏水基團(tuán)等。最后，根據(jù)這些藥效特征元素及其空間排列關(guān)系，構(gòu)建出藥效團(tuán)模型。這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于不依賴受體結(jié)構(gòu)信息，適用于受體結(jié)構(gòu)未知的情況。例如在早期對(duì)某些疾病機(jī)制了解有限，無(wú)法獲取受體結(jié)構(gòu)時(shí)，基于已知活性分子構(gòu)建藥效團(tuán)模型就成為了重要的研究手段。它能夠從已有的活性分子中挖掘出關(guān)鍵的藥效信息，為后續(xù)的藥物研發(fā)提供方向。然而，該方法也存在一定局限性，由于其基于有限的已知活性分子，可能無(wú)法涵蓋所有潛在的活性結(jié)構(gòu)特征，導(dǎo)致構(gòu)建的藥效團(tuán)模型具有一定的片面性?；谑荏w結(jié)構(gòu)構(gòu)建藥效團(tuán)模型的流程則有所不同。首先要獲取受體的三維結(jié)構(gòu)，這可以通過(guò)X射線晶體學(xué)、核磁共振（NMR）或冷凍電鏡等實(shí)驗(yàn)技術(shù)直接測(cè)定，也可以采用同源建模等方法進(jìn)行預(yù)測(cè)。例如，當(dāng)研究某一蛋白質(zhì)受體時(shí)，若已有其晶體結(jié)構(gòu)，可直接使用；若沒(méi)有，則可通過(guò)同源建模，以與之序列相似且結(jié)構(gòu)已知的蛋白質(zhì)為模板，構(gòu)建其三維結(jié)構(gòu)模型。得到受體結(jié)構(gòu)后，分析受體活性位點(diǎn)的特征，確定其中與配體相互作用的關(guān)鍵氨基酸殘基以及它們所形成的作用區(qū)域。比如，某些氨基酸殘基可能形成氫鍵供體或受體，或者形成疏水口袋等。根據(jù)這些相互作用特征，定義出藥效團(tuán)模型中的藥效特征元素。例如，如果活性位點(diǎn)中有一個(gè)帶正電荷的氨基酸殘基，可能對(duì)應(yīng)一個(gè)氫鍵受體或靜電相互作用位點(diǎn)。最后，將這些藥效特征元素按照它們?cè)诨钚晕稽c(diǎn)中的空間位置關(guān)系，構(gòu)建成藥效團(tuán)模型。這種方法的優(yōu)勢(shì)在于能夠充分利用受體的結(jié)構(gòu)信息，構(gòu)建出的藥效團(tuán)模型與受體的結(jié)合模式更加契合，篩選結(jié)果更具針對(duì)性和可靠性。但它的缺點(diǎn)是對(duì)受體結(jié)構(gòu)的依賴性強(qiáng)，若受體結(jié)構(gòu)獲取困難或不準(zhǔn)確，將會(huì)影響藥效團(tuán)模型的質(zhì)量。例如，對(duì)于一些難以結(jié)晶的蛋白質(zhì)受體，獲取其高分辨率的晶體結(jié)構(gòu)就存在很大挑戰(zhàn)，從而限制了基于受體結(jié)構(gòu)構(gòu)建藥效團(tuán)模型的應(yīng)用。2.3.2利用藥效團(tuán)模型篩選天然產(chǎn)物在構(gòu)建好藥效團(tuán)模型后，便可以運(yùn)用其在天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行篩選，以尋找具有潛在生物活性的天然產(chǎn)物。具體篩選過(guò)程如下：首先，對(duì)天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行預(yù)處理，確保數(shù)據(jù)庫(kù)中天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)信息準(zhǔn)確、完整，并且格式符合篩選軟件的要求。這可能包括去除冗余結(jié)構(gòu)、標(biāo)準(zhǔn)化命名、添加氫原子、計(jì)算電荷等操作。例如，一些天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)中可能存在重復(fù)的結(jié)構(gòu)記錄，通過(guò)去除冗余可以減少篩選的計(jì)算量；標(biāo)準(zhǔn)化命名可以避免因不同命名方式導(dǎo)致的識(shí)別錯(cuò)誤。然后，將構(gòu)建好的藥效團(tuán)模型導(dǎo)入篩選軟件，設(shè)置篩選參數(shù)。篩選參數(shù)的設(shè)置對(duì)于篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性和效率至關(guān)重要。常見(jiàn)的篩選參數(shù)包括藥效團(tuán)特征的匹配程度、空間距離限制、能量約束等。藥效團(tuán)特征的匹配程度決定了天然產(chǎn)物與藥效團(tuán)模型中各個(gè)藥效特征元素的契合程度，例如，要求天然產(chǎn)物必須包含藥效團(tuán)模型中的所有氫鍵給體和受體，或者至少滿足一定比例的藥效特征匹配。空間距離限制則規(guī)定了天然產(chǎn)物中不同藥效特征元素之間的空間距離范圍，以確保其空間排列與藥效團(tuán)模型一致。能量約束可以用于排除那些與藥效團(tuán)模型結(jié)合時(shí)能量過(guò)高、穩(wěn)定性較差的天然產(chǎn)物。在設(shè)置好篩選參數(shù)后，篩選軟件會(huì)根據(jù)藥效團(tuán)模型對(duì)天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)中的化合物進(jìn)行逐一匹配和評(píng)估。對(duì)于每個(gè)天然產(chǎn)物，軟件會(huì)計(jì)算其與藥效團(tuán)模型的相似度或匹配得分。相似度或匹配得分的計(jì)算通?；谝欢ǖ乃惴?，綜合考慮天然產(chǎn)物與藥效團(tuán)模型在藥效特征元素的類型、數(shù)量、空間位置等方面的匹配情況。例如，采用基于幾何距離和特征匹配的算法，計(jì)算天然產(chǎn)物中各個(gè)藥效特征元素與藥效團(tuán)模型對(duì)應(yīng)元素之間的距離，并根據(jù)距離的遠(yuǎn)近和特征的匹配程度給予相應(yīng)的得分。篩選完成后，會(huì)得到一個(gè)按照相似度或匹配得分排序的天然產(chǎn)物列表。通常會(huì)選取得分較高的天然產(chǎn)物作為潛在的活性化合物進(jìn)行進(jìn)一步研究。然而，篩選結(jié)果中可能存在假陽(yáng)性和假陰性的情況。假陽(yáng)性是指那些雖然在篩選中得分較高，但實(shí)際上并沒(méi)有真正生物活性的天然產(chǎn)物；假陰性則是指具有生物活性，但由于篩選方法的局限性而未被篩選出來(lái)的天然產(chǎn)物。為了降低假陽(yáng)性和假陰性的影響，需要對(duì)篩選結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證和分析。驗(yàn)證篩選結(jié)果的方法通常包括實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和進(jìn)一步的計(jì)算分析。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證是最直接的方法，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)或體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，對(duì)篩選出的天然產(chǎn)物進(jìn)行生物活性測(cè)試。例如，將篩選得到的天然產(chǎn)物用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、信號(hào)通路等的影響；或者進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，評(píng)估其在體內(nèi)的藥效和安全性。進(jìn)一步的計(jì)算分析則可以采用分子對(duì)接、分子動(dòng)力學(xué)模擬等方法。分子對(duì)接可以更精確地模擬天然產(chǎn)物與靶蛋白的結(jié)合模式和親和力，通過(guò)將篩選出的天然產(chǎn)物與靶蛋白進(jìn)行分子對(duì)接，分析它們之間的相互作用細(xì)節(jié)，進(jìn)一步驗(yàn)證其與靶標(biāo)的結(jié)合能力。分子動(dòng)力學(xué)模擬則可以研究天然產(chǎn)物與靶蛋白在動(dòng)態(tài)過(guò)程中的相互作用，觀察它們?cè)谌芤涵h(huán)境中的構(gòu)象變化、結(jié)合穩(wěn)定性等，為深入理解其作用機(jī)制提供依據(jù)。通過(guò)綜合運(yùn)用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和計(jì)算分析，可以更準(zhǔn)確地評(píng)估篩選結(jié)果，挖掘出真正具有藥用潛力的天然產(chǎn)物。2.4虛擬篩選方法的優(yōu)化與改進(jìn)2.4.1結(jié)合深度學(xué)習(xí)的虛擬篩選算法改進(jìn)深度學(xué)習(xí)作為人工智能領(lǐng)域的關(guān)鍵技術(shù)，在近年來(lái)取得了顯著進(jìn)展，并在諸多領(lǐng)域展現(xiàn)出強(qiáng)大的應(yīng)用潛力。將深度學(xué)習(xí)算法融入虛擬篩選，為提升篩選準(zhǔn)確性與效率開(kāi)辟了新的路徑。深度學(xué)習(xí)算法在虛擬篩選中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。它能夠自動(dòng)從大量數(shù)據(jù)中學(xué)習(xí)復(fù)雜的模式和特征，無(wú)需人工手動(dòng)提取特征，從而避免了人為因素的干擾和局限性。在處理天然產(chǎn)物與靶蛋白的相互作用數(shù)據(jù)時(shí)，深度學(xué)習(xí)模型可以通過(guò)對(duì)海量的分子結(jié)構(gòu)和活性數(shù)據(jù)進(jìn)行學(xué)習(xí)，自動(dòng)捕捉分子之間的潛在關(guān)系和規(guī)律，從而更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)天然產(chǎn)物與靶蛋白的結(jié)合親和力和活性。例如，卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（CNN）特別適合處理圖像數(shù)據(jù)，在虛擬篩選中可用于分析分子結(jié)構(gòu)圖，通過(guò)識(shí)別和提取分子中的原子和化學(xué)鍵的類型、位置等特征，預(yù)測(cè)分子的性質(zhì)和活性。循環(huán)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（RNN）則擅長(zhǎng)處理序列數(shù)據(jù)，對(duì)于化學(xué)分子序列的虛擬篩選任務(wù)，RNN能夠捕捉分子序列中的長(zhǎng)期依賴關(guān)系，進(jìn)而更精準(zhǔn)地預(yù)測(cè)分子的性質(zhì)。在實(shí)際應(yīng)用中，深度學(xué)習(xí)算法的改進(jìn)能夠顯著提升虛擬篩選的性能。以基于分子對(duì)接的虛擬篩選為例，傳統(tǒng)的分子對(duì)接評(píng)分函數(shù)往往存在準(zhǔn)確性不足的問(wèn)題，容易導(dǎo)致假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果。而結(jié)合深度學(xué)習(xí)的評(píng)分函數(shù)可以通過(guò)對(duì)大量已知活性化合物的學(xué)習(xí)和訓(xùn)練，優(yōu)化評(píng)分模型，使其能夠更準(zhǔn)確地評(píng)估配體與受體之間的結(jié)合親和力。谷歌旗下的DeepMind公司開(kāi)發(fā)的AlphaFold2在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)領(lǐng)域取得了重大突破，該模型基于深度學(xué)習(xí)算法，能夠從蛋白質(zhì)的氨基酸序列準(zhǔn)確預(yù)測(cè)其三維結(jié)構(gòu)。將類似的深度學(xué)習(xí)模型應(yīng)用于虛擬篩選中，能夠更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)天然產(chǎn)物與靶蛋白的結(jié)合構(gòu)象，從而提高篩選的準(zhǔn)確性。在預(yù)測(cè)化合物的活性時(shí)，基于深度學(xué)習(xí)的模型可以綜合考慮分子的多種特征，如電子結(jié)構(gòu)、空間構(gòu)象、氫鍵相互作用等，避免了傳統(tǒng)方法中僅考慮單一或少數(shù)特征的局限性。通過(guò)對(duì)大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的學(xué)習(xí)，深度學(xué)習(xí)模型能夠建立更復(fù)雜、更準(zhǔn)確的活性預(yù)測(cè)模型，有效提高了虛擬篩選的命中率。此外，深度學(xué)習(xí)算法還可以與其他虛擬篩選技術(shù)相結(jié)合，進(jìn)一步提升篩選效率。將深度學(xué)習(xí)與基于藥效團(tuán)的虛擬篩選相結(jié)合，利用深度學(xué)習(xí)模型對(duì)藥效團(tuán)模型進(jìn)行優(yōu)化和改進(jìn)。通過(guò)對(duì)大量活性分子的學(xué)習(xí)，深度學(xué)習(xí)模型可以自動(dòng)識(shí)別出藥效團(tuán)模型中最重要的特征元素，并對(duì)其空間排列進(jìn)行優(yōu)化，從而提高藥效團(tuán)模型的準(zhǔn)確性和可靠性。在篩選過(guò)程中，利用深度學(xué)習(xí)模型快速篩選出與藥效團(tuán)模型高度匹配的天然產(chǎn)物，大大減少了篩選的時(shí)間和計(jì)算成本。2.4.2多技術(shù)聯(lián)用增強(qiáng)虛擬篩選效果虛擬篩選與化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等技術(shù)聯(lián)用，為深入研究天然產(chǎn)物的作用機(jī)制和靶點(diǎn)鑒定提供了有力的策略。化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)是一門研究蛋白質(zhì)與小分子相互作用的學(xué)科，它能夠在蛋白質(zhì)組水平上系統(tǒng)地鑒定小分子的作用靶點(diǎn)。將虛擬篩選與化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)聯(lián)用，可以先通過(guò)虛擬篩選從天然產(chǎn)物庫(kù)中篩選出具有潛在活性的化合物，然后利用化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)這些化合物的作用靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證和鑒定。通過(guò)生物素標(biāo)記的天然產(chǎn)物類似物，與細(xì)胞裂解液孵育，然后利用鏈霉親和素磁珠富集與天然產(chǎn)物結(jié)合的蛋白質(zhì)，再通過(guò)質(zhì)譜分析鑒定這些蛋白質(zhì)，從而確定天然產(chǎn)物的作用靶點(diǎn)。這種聯(lián)用策略能夠充分發(fā)揮虛擬篩選的高效性和化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)的精準(zhǔn)性，提高靶點(diǎn)鑒定的準(zhǔn)確性和可靠性。在研究某天然產(chǎn)物的抗癌活性時(shí)，通過(guò)虛擬篩選初步確定了該天然產(chǎn)物的潛在作用靶點(diǎn)，然后利用化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)這些靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，成功鑒定出該天然產(chǎn)物的直接作用靶點(diǎn)，為進(jìn)一步研究其抗癌機(jī)制提供了關(guān)鍵線索。代謝組學(xué)則是研究生物體代謝產(chǎn)物變化規(guī)律的學(xué)科，它能夠反映生物體在生理或病理狀態(tài)下的代謝狀態(tài)和功能變化。將虛擬篩選與代謝組學(xué)聯(lián)用，可以從代謝層面深入研究天然產(chǎn)物的作用機(jī)制。通過(guò)分析天然產(chǎn)物處理前后細(xì)胞或生物體內(nèi)代謝物的變化，能夠揭示天然產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)的影響，發(fā)現(xiàn)其作用的代謝通路和生物學(xué)過(guò)程。利用核磁共振（NMR）或質(zhì)譜（MS）等技術(shù)對(duì)代謝物進(jìn)行檢測(cè)和分析，結(jié)合生物信息學(xué)方法對(duì)代謝組數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，從而挖掘出與天然產(chǎn)物作用相關(guān)的代謝標(biāo)志物和代謝通路。在研究某天然產(chǎn)物對(duì)糖尿病的治療作用時(shí)，通過(guò)虛擬篩選篩選出具有潛在降糖活性的天然產(chǎn)物，然后利用代謝組學(xué)技術(shù)分析該天然產(chǎn)物對(duì)糖尿病模型動(dòng)物體內(nèi)代謝物的影響，發(fā)現(xiàn)它能夠調(diào)節(jié)多條與糖代謝和脂質(zhì)代謝相關(guān)的代謝通路，從而發(fā)揮降糖作用。虛擬篩選與化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等技術(shù)的聯(lián)用，在靶點(diǎn)鑒定、作用機(jī)制研究等方面具有顯著的促進(jìn)作用。通過(guò)多技術(shù)聯(lián)用，可以從不同層面、不同角度對(duì)天然產(chǎn)物進(jìn)行全面深入的研究，彌補(bǔ)單一技術(shù)的不足，形成優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)。在靶點(diǎn)鑒定方面，虛擬篩選提供了潛在的作用靶點(diǎn)信息，化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)則通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證確定直接作用靶點(diǎn)，兩者結(jié)合大大提高了靶點(diǎn)鑒定的準(zhǔn)確性。在作用機(jī)制研究方面，代謝組學(xué)從代謝層面揭示天然產(chǎn)物對(duì)生物體內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò)的影響，與虛擬篩選和化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)提供的信息相互印證，能夠更全面、深入地闡明天然產(chǎn)物的作用機(jī)制。這種多技術(shù)聯(lián)用的策略為天然產(chǎn)物的研究和藥物研發(fā)提供了更強(qiáng)大的技術(shù)手段，有助于加速新藥的發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)進(jìn)程。三、天然產(chǎn)物分子機(jī)理研究方法3.1分子動(dòng)力學(xué)模擬3.1.1分子動(dòng)力學(xué)模擬的原理與流程分子動(dòng)力學(xué)模擬是一種基于牛頓力學(xué)的計(jì)算方法，旨在通過(guò)計(jì)算分子體系中原子間的相互作用力，模擬分子的動(dòng)態(tài)行為，進(jìn)而深入探究分子體系的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能。其基本原理是將分子體系中的原子視為質(zhì)點(diǎn)，根據(jù)牛頓第二定律F=ma（其中F為原子所受的力，m為原子的質(zhì)量，a為原子的加速度），計(jì)算原子在力場(chǎng)作用下的運(yùn)動(dòng)軌跡。在模擬過(guò)程中，需要定義原子間的相互作用勢(shì)能函數(shù)，常用的勢(shì)能函數(shù)包括Lennard-Jones勢(shì)、Coulomb勢(shì)等。Lennard-Jones勢(shì)主要描述非極性分子間的范德華相互作用，其表達(dá)式為U(r)=4\epsilon[(\frac{\sigma}{r})^{12}-(\frac{\sigma}{r})^6]，其中r為兩個(gè)原子之間的距離，\epsilon是勢(shì)阱深度，\sigma是與原子直徑相關(guān)的參數(shù)。Coulomb勢(shì)則用于描述帶電粒子間的靜電相互作用，表達(dá)式為U(r)=\frac{q_1q_2}{4\pi\epsilon_0r}，其中q_1和q_2分別為兩個(gè)帶電粒子的電荷量，\epsilon_0是真空介電常數(shù)。分子動(dòng)力學(xué)模擬的具體流程通常包含以下幾個(gè)關(guān)鍵步驟：構(gòu)建初始結(jié)構(gòu)：確定模擬體系的原子數(shù)目、種類和初始空間位置，構(gòu)建出體系的初始結(jié)構(gòu)。這可以基于實(shí)驗(yàn)測(cè)定的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，如通過(guò)X射線晶體學(xué)、核磁共振（NMR）等技術(shù)獲得的分子結(jié)構(gòu)；也可以通過(guò)理論方法構(gòu)建，如利用分子力學(xué)優(yōu)化或同源建模等方法生成初始結(jié)構(gòu)。在研究蛋白質(zhì)與天然產(chǎn)物的相互作用時(shí)，首先需要獲取蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，如果已有實(shí)驗(yàn)測(cè)定的晶體結(jié)構(gòu)，則可直接使用；若沒(méi)有，則可通過(guò)同源建模，以序列相似且結(jié)構(gòu)已知的蛋白質(zhì)為模板，構(gòu)建目標(biāo)蛋白質(zhì)的初始結(jié)構(gòu)。同時(shí)，根據(jù)天然產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)信息，構(gòu)建其初始分子模型，并將其放置在蛋白質(zhì)的活性位點(diǎn)附近，形成初始的蛋白質(zhì)-天然產(chǎn)物復(fù)合物結(jié)構(gòu)。選擇力場(chǎng)和參數(shù)：根據(jù)模擬體系的性質(zhì)，選擇合適的力場(chǎng)。力場(chǎng)是描述原子間相互作用的參數(shù)集合，它包含了各種勢(shì)能函數(shù)及其參數(shù)，不同的力場(chǎng)適用于不同類型的分子體系。常見(jiàn)的力場(chǎng)有AMBER、CHARMM、GROMOS等。AMBER力場(chǎng)在生物分子模擬中應(yīng)用廣泛，它對(duì)蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的描述較為準(zhǔn)確；CHARMM力場(chǎng)則具有較高的精度，適用于多種分子體系的模擬；GROMOS力場(chǎng)則在小分子和生物分子模擬中都有較好的表現(xiàn)。在選擇力場(chǎng)后，需要對(duì)力場(chǎng)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化和調(diào)整，以確保模擬結(jié)果的準(zhǔn)確性。對(duì)于一些特殊的分子體系或相互作用，可能需要對(duì)力場(chǎng)參數(shù)進(jìn)行定制或修正。引入隨機(jī)熱噪聲：在實(shí)際系統(tǒng)中，分子受到周圍環(huán)境的熱擾動(dòng)，存在隨機(jī)熱噪聲。為了模擬這種熱力學(xué)行為，在分子動(dòng)力學(xué)模擬中需要引入適當(dāng)?shù)碾S機(jī)噪聲。通常采用的方法是在運(yùn)動(dòng)方程中添加一個(gè)隨機(jī)力項(xiàng)，以模擬分子的熱運(yùn)動(dòng)。這個(gè)隨機(jī)力項(xiàng)的大小和方向是隨機(jī)的，但滿足一定的統(tǒng)計(jì)分布，如高斯分布。通過(guò)引入隨機(jī)熱噪聲，可以使模擬體系達(dá)到熱力學(xué)平衡態(tài)，從而能夠研究分子在真實(shí)環(huán)境下的動(dòng)態(tài)行為。數(shù)值積分求解運(yùn)動(dòng)方程：根據(jù)牛頓第二定律，計(jì)算原子受到的合力，并更新原子的速度和坐標(biāo)。由于原子的運(yùn)動(dòng)方程是一個(gè)二階常微分方程，無(wú)法直接求解，需要采用數(shù)值積分方法進(jìn)行近似求解。常用的數(shù)值積分算法有Verlet算法、Leapfrog算法等。Verlet算法是一種常用的積分算法，它通過(guò)對(duì)原子位置的遞推公式來(lái)更新原子的坐標(biāo)，具有較好的穩(wěn)定性和精度。其基本公式為r_{i}(t+\Deltat)=2r_{i}(t)-r_{i}(t-\Deltat)+\frac{F_{i}(t)}{m_{i}}\Deltat^2，其中r_{i}(t)是原子i在時(shí)刻t的位置，F(xiàn)_{i}(t)是原子i在時(shí)刻t所受的力，m_{i}是原子i的質(zhì)量，\Deltat是時(shí)間步長(zhǎng)。在每一個(gè)時(shí)間步長(zhǎng)內(nèi)，首先計(jì)算原子間的相互作用力，然后根據(jù)數(shù)值積分算法更新原子的速度和坐標(biāo)。模擬運(yùn)行與數(shù)據(jù)收集：設(shè)定模擬的時(shí)間長(zhǎng)度和時(shí)間步長(zhǎng)，開(kāi)始模擬運(yùn)行。在模擬過(guò)程中，按照設(shè)定的時(shí)間步長(zhǎng)不斷更新原子的位置和速度，同時(shí)收集體系的各種信息，如原子坐標(biāo)、速度、能量等。模擬時(shí)間的長(zhǎng)短取決于研究的目的和體系的性質(zhì)，對(duì)于一些快速的分子過(guò)程，可能只需要模擬幾納秒的時(shí)間；而對(duì)于一些緩慢的過(guò)程，如蛋白質(zhì)的折疊、分子的擴(kuò)散等，則可能需要模擬微秒甚至毫秒級(jí)別的時(shí)間。時(shí)間步長(zhǎng)的選擇也非常關(guān)鍵，它既要足夠小以保證模擬的精度，又不能太小導(dǎo)致計(jì)算量過(guò)大。通常時(shí)間步長(zhǎng)在飛秒級(jí)別，如1-2飛秒。在模擬運(yùn)行過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生大量的數(shù)據(jù)，需要對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行有效的存儲(chǔ)和管理。數(shù)據(jù)分析與結(jié)果解讀：模擬結(jié)束后，對(duì)收集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，以獲取有關(guān)分子體系結(jié)構(gòu)、動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)性質(zhì)的信息?？梢酝ㄟ^(guò)分析原子的軌跡，計(jì)算分子的均方根位移（RMSD）、均方根波動(dòng)（RMSF）、回轉(zhuǎn)半徑等參數(shù)，來(lái)研究分子的構(gòu)象變化和穩(wěn)定性。均方根位移用于衡量分子在模擬過(guò)程中的整體移動(dòng)距離，其計(jì)算公式為RMSD=\sqrt{\frac{1}{N}\sum_{i=1}^{N}(r_{i}(t)-r_{i}(0))^2}，其中N是原子的總數(shù)，r_{i}(t)是原子i在時(shí)刻t的位置，r_{i}(0)是原子i的初始位置。均方根波動(dòng)則用于描述分子中各個(gè)原子的波動(dòng)情況，反映了分子局部結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性?；剞D(zhuǎn)半徑用于衡量分子的緊湊程度，其計(jì)算公式為R_g=\sqrt{\frac{1}{N}\sum_{i=1}^{N}(r_{i}-\overline{r})^2}，其中\(zhòng)overline{r}是分子質(zhì)心的位置。還可以通過(guò)計(jì)算分子間的相互作用能、氫鍵數(shù)目、溶劑可及表面積等參數(shù)，來(lái)研究分子間的相互作用和分子與溶劑的相互作用。通過(guò)對(duì)這些參數(shù)的分析和解讀，可以深入理解分子體系的動(dòng)態(tài)行為和性質(zhì)，為研究天然產(chǎn)物的分子機(jī)理提供重要的依據(jù)。3.1.2應(yīng)用分子動(dòng)力學(xué)模擬探究天然產(chǎn)物作用機(jī)理以原皂苷A（PrA）與?；o酶A合成酶長(zhǎng)鏈家族成員4（ACSL4）的相互作用研究為例，分子動(dòng)力學(xué)模擬在探究天然產(chǎn)物作用機(jī)理方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用。原皂苷A是一種從蘇木精中提取的活性成分，具有多種藥理作用。研究表明，原皂苷A對(duì)阿霉素（DOX）誘導(dǎo)的心肌損傷和心功能障礙具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制與抑制鐵死亡密切相關(guān)，而ACSL4是鐵死亡過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白。在這項(xiàng)研究中，首先通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)初步確定了原皂苷A與ACSL4可能的結(jié)合模式。分子對(duì)接是一種基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)方法，它通過(guò)將配體分子（原皂苷A）放置在受體分子（ACSL4）的活性位點(diǎn)處，尋找兩者之間的最佳結(jié)合構(gòu)象。在分子對(duì)接過(guò)程中，考慮了配體與受體之間的幾何互補(bǔ)性和能量互補(bǔ)性，通過(guò)不斷優(yōu)化配體的位置、取向和構(gòu)象，使得原皂苷A能夠與ACSL4的活性位點(diǎn)緊密結(jié)合。對(duì)接結(jié)果顯示，原皂苷A能夠與ACSL4形成穩(wěn)定的復(fù)合物，且結(jié)合位點(diǎn)位于ACSL4的關(guān)鍵功能區(qū)域。為了進(jìn)一步深入探究原皂苷A與ACSL4相互作用的動(dòng)態(tài)過(guò)程和分子細(xì)節(jié)，進(jìn)行了分子動(dòng)力學(xué)模擬。在模擬過(guò)程中，構(gòu)建了包含原皂苷A和ACSL4的模擬體系，并添加了適量的水分子和離子，以模擬真實(shí)的生理環(huán)境。選擇了合適的力場(chǎng)參數(shù)，如AMBER力場(chǎng)，對(duì)模擬體系進(jìn)行了優(yōu)化和平衡。在模擬運(yùn)行過(guò)程中，按照設(shè)定的時(shí)間步長(zhǎng)（如2飛秒）不斷更新原子的位置和速度，模擬時(shí)間達(dá)到了數(shù)微秒，以確保能夠充分觀察到原皂苷A與ACSL4相互作用的動(dòng)態(tài)變化。通過(guò)對(duì)分子動(dòng)力學(xué)模擬軌跡的分析，獲得了豐富的信息。計(jì)算了原皂苷A與ACSL4復(fù)合物的均方根位移（RMSD），結(jié)果表明在模擬過(guò)程中，復(fù)合物的結(jié)構(gòu)逐漸趨于穩(wěn)定，RMSD值在一定范圍內(nèi)波動(dòng)，說(shuō)明原皂苷A與ACSL4形成的復(fù)合物具有較好的穩(wěn)定性。分析了原皂苷A與ACSL4之間的相互作用能，發(fā)現(xiàn)兩者之間存在較強(qiáng)的相互作用，主要包括氫鍵相互作用、疏水相互作用和靜電相互作用。具體來(lái)說(shuō)，原皂苷A分子中的某些羥基和羰基與ACSL4分子中的氨基酸殘基形成了多個(gè)氫鍵，這些氫鍵的存在增強(qiáng)了兩者之間的結(jié)合力。原皂苷A的疏水部分與ACSL4的疏水區(qū)域相互匹配，形成了疏水相互作用，這對(duì)于維持復(fù)合物的穩(wěn)定性也起到了重要作用。原皂苷A與ACSL4之間還存在一定的靜電相互作用，進(jìn)一步促進(jìn)了它們之間的結(jié)合。研究還分析了原皂苷A與ACSL4相互作用對(duì)ACSL4構(gòu)象和功能的影響。通過(guò)計(jì)算ACSL4的均方根波動(dòng)（RMSF），發(fā)現(xiàn)與原皂苷A結(jié)合后，ACSL4分子中某些關(guān)鍵區(qū)域的RMSF值發(fā)生了明顯變化，說(shuō)明原皂苷A的結(jié)合影響了ACSL4的局部構(gòu)象。這種構(gòu)象變化可能導(dǎo)致ACSL4的活性位點(diǎn)發(fā)生改變，從而影響其與底物的結(jié)合能力和催化活性。進(jìn)一步的研究表明，原皂苷A與ACSL4的結(jié)合抑制了ACSL4的活性，從而阻斷了鐵死亡相關(guān)的信號(hào)通路，發(fā)揮了對(duì)心肌損傷的保護(hù)作用。通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬，不僅揭示了原皂苷A與ACSL4相互作用的動(dòng)態(tài)過(guò)程和分子細(xì)節(jié)，還深入探討了原皂苷A對(duì)ACSL4構(gòu)象和功能的影響，為闡明原皂苷A抑制鐵死亡、保護(hù)心肌損傷的分子機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)。這一研究實(shí)例充分展示了分子動(dòng)力學(xué)模擬在探究天然產(chǎn)物作用機(jī)理方面的強(qiáng)大能力和重要價(jià)值。3.2實(shí)驗(yàn)技術(shù)驗(yàn)證分子機(jī)理3.2.1表面等離子體共振（SPR）技術(shù)表面等離子體共振（SPR）技術(shù)是一種基于物理光學(xué)原理的生物物理學(xué)技術(shù)，廣泛應(yīng)用于檢測(cè)分子間相互作用，在天然產(chǎn)物分子機(jī)理研究中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。其基本原理基于光在不同介質(zhì)中傳播時(shí)產(chǎn)生消逝波，當(dāng)消逝波與金屬表面的等離子波發(fā)生共振時(shí)，會(huì)導(dǎo)致反射光強(qiáng)度的顯著變化。在實(shí)驗(yàn)中，將一種分子（配體）固定在金屬薄膜表面，通常采用金或銀薄膜，另一種分子（分析物）以溶液形式流經(jīng)金屬表面。當(dāng)分析物與配體發(fā)生特異性結(jié)合時(shí)，會(huì)引起金屬表面附近折射率的改變，進(jìn)而影響表面等離子體波的共振條件，導(dǎo)致反射光強(qiáng)度發(fā)生變化。通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反射光強(qiáng)度的變化，能夠獲取分子間相互作用的實(shí)時(shí)信息，包括結(jié)合、解離等動(dòng)態(tài)過(guò)程。SPR技術(shù)在檢測(cè)分子間相互作用的親和力方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。通過(guò)監(jiān)測(cè)分析物與配體結(jié)合和解離過(guò)程中反射光強(qiáng)度的變化曲線，可以精確擬合得出分子間相互作用的結(jié)合速率常數(shù)ka（單位為1/Ms，表示結(jié)合的快慢）、解離速率常數(shù)kd（單位為1/s，表示解離的快慢）以及平衡解離常數(shù)/親和力常數(shù)KD（單位為M，表示結(jié)合的強(qiáng)弱）。這些動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)參數(shù)能夠定量地描述分子間相互作用的特性，為研究天然產(chǎn)物與靶標(biāo)之間的結(jié)合親和力提供了重要依據(jù)。在驗(yàn)證天然產(chǎn)物與靶標(biāo)結(jié)合的研究中，SPR技術(shù)有著廣泛的應(yīng)用。在研究某天然產(chǎn)物對(duì)腫瘤相關(guān)靶標(biāo)的作用時(shí)，將腫瘤靶標(biāo)蛋白固定在SPR傳感器的金屬表面，然后將不同濃度的天然產(chǎn)物溶液流經(jīng)傳感器表面。隨著天然產(chǎn)物與靶標(biāo)蛋白的結(jié)合，傳感器表面的折射率發(fā)生變化，導(dǎo)致SPR信號(hào)改變。通過(guò)監(jiān)測(cè)SPR信號(hào)隨時(shí)間的變化，獲得天然產(chǎn)物與靶標(biāo)蛋白結(jié)合和解離的動(dòng)力學(xué)曲線。從這些曲線中，可以計(jì)算出結(jié)合速率常數(shù)ka、解離速率常數(shù)kd以及親和力常數(shù)KD。如果KD值較小，表明天然產(chǎn)物與靶標(biāo)蛋白具有較強(qiáng)的結(jié)合親和力，兩者能夠穩(wěn)定地結(jié)合在一起。通過(guò)對(duì)不同天然產(chǎn)物與靶標(biāo)蛋白相互作用的動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行比較，可以篩選出具有較高親和力的天然產(chǎn)物，為進(jìn)一步的藥物研發(fā)提供有價(jià)值的線索。在研究某天然產(chǎn)物對(duì)心血管疾病相關(guān)靶標(biāo)的作用時(shí)，同樣可以利用SPR技術(shù)。將心血管疾病相關(guān)的靶標(biāo)蛋白固定在傳感器表面，將天然產(chǎn)物溶液流過(guò)表面。通過(guò)分析SPR信號(hào)的變化，發(fā)現(xiàn)該天然產(chǎn)物能夠與靶標(biāo)蛋白快速結(jié)合，且結(jié)合后解離緩慢，計(jì)算得到的親和力常數(shù)KD值較低，說(shuō)明該天然產(chǎn)物與靶標(biāo)蛋白具有很強(qiáng)的結(jié)合能力。進(jìn)一步的研究表明，這種強(qiáng)結(jié)合能力可能導(dǎo)致靶標(biāo)蛋白的構(gòu)象發(fā)生改變，從而影響其下游信號(hào)通路，發(fā)揮治療心血管疾病的作用。SPR技術(shù)不僅能夠驗(yàn)證天然產(chǎn)物與靶標(biāo)的結(jié)合，還能夠?yàn)樯钊胙芯科渥饔脵C(jī)制提供重要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。3.2.2細(xì)胞熱位移實(shí)驗(yàn)（CETSA）細(xì)胞熱位移實(shí)驗(yàn)（CETSA）是一種基于蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性變化來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)與配體結(jié)合穩(wěn)定性的技術(shù)，在天然產(chǎn)物分子機(jī)理研究中具有重要應(yīng)用價(jià)值。其基本原理基于蛋白質(zhì)在加熱過(guò)程中會(huì)逐漸變性沉淀的特性。在生理?xiàng)l件下，蛋白質(zhì)具有穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)，但隨著溫度的升高，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)會(huì)逐漸變得不穩(wěn)定，最終發(fā)生變性沉淀。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與配體（如天然產(chǎn)物）結(jié)合時(shí)，配體與蛋白質(zhì)之間的相互作用會(huì)使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，從而提高其熱穩(wěn)定性。在相同的加熱條件下，與配體結(jié)合的蛋白質(zhì)相比未結(jié)合配體的蛋白質(zhì)更不容易發(fā)生變性沉淀。在CETSA實(shí)驗(yàn)中，首先將細(xì)胞或組織樣品分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組加入天然產(chǎn)物，對(duì)照組則不加入。然后對(duì)兩組樣品進(jìn)行梯度加熱處理，隨著溫度的升高，蛋白質(zhì)逐漸變性沉淀。通過(guò)離心去除變性沉淀的蛋白質(zhì)，收集上清液，采用生化分析手段，如蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblotting）或質(zhì)譜（MS）等，檢測(cè)上清液中剩余的可溶性蛋白含量。以溫度為橫坐標(biāo)，可溶性蛋白含量為縱坐標(biāo)，繪制出蛋白質(zhì)的熔解曲線。對(duì)于對(duì)照組，蛋白質(zhì)的熔解曲線反映了其在自然狀態(tài)下的熱穩(wěn)定性；而實(shí)驗(yàn)組中，由于天然產(chǎn)物與蛋白質(zhì)的結(jié)合，蛋白質(zhì)的熔解曲線會(huì)發(fā)生右移，即相同溫度下，實(shí)驗(yàn)組中可溶性蛋白的含量更高。通過(guò)比較對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組蛋白質(zhì)熔解曲線的差異，可以確定天然產(chǎn)物與蛋白質(zhì)之間是否發(fā)生了結(jié)合，以及結(jié)合對(duì)蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的影響程度。以某天然產(chǎn)物對(duì)癌細(xì)胞中關(guān)鍵蛋白的作用研究為例，通過(guò)CETSA實(shí)驗(yàn)可以深入探究其分子機(jī)理。將癌細(xì)胞分為兩組，一組加入該天然產(chǎn)物，另一組作為對(duì)照。對(duì)兩組細(xì)胞進(jìn)行梯度加熱處理，從30℃開(kāi)始，以5℃為梯度逐漸升高溫度至60℃。在每個(gè)溫度點(diǎn)，收集細(xì)胞裂解液并離心，取上清液進(jìn)行Westernblotting檢測(cè)，使用針對(duì)關(guān)鍵蛋白的特異性抗體來(lái)檢測(cè)上清液中該蛋白的含量。結(jié)果顯示，對(duì)照組中，隨著溫度的升高，關(guān)鍵蛋白的含量逐漸降低，在50℃左右時(shí)，大部分蛋白已經(jīng)變性沉淀，上清液中蛋白含量很低；而實(shí)驗(yàn)組中，由于天然產(chǎn)物的存在，關(guān)鍵蛋白的熱穩(wěn)定性明顯提高，在50℃時(shí)，上清液中仍能檢測(cè)到較高含量的蛋白，其熔解曲線相較于對(duì)照組明顯右移。這表明該天然產(chǎn)物能夠與癌細(xì)胞中的關(guān)鍵蛋白結(jié)合，增強(qiáng)其熱穩(wěn)定性，從而可能影響該蛋白的功能，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。通過(guò)進(jìn)一步的研究，可以確定該天然產(chǎn)物與關(guān)鍵蛋白結(jié)合的具體位點(diǎn)和作用機(jī)制，為開(kāi)發(fā)新型抗癌藥物提供理論基礎(chǔ)。3.2.3其他實(shí)驗(yàn)技術(shù)（如westernblot、免疫熒光等）除了表面等離子體共振（SPR）技術(shù)和細(xì)胞熱位移實(shí)驗(yàn)（CETSA）外，westernblot和免疫熒光等技術(shù)在驗(yàn)證天然產(chǎn)物對(duì)相關(guān)信號(hào)通路或蛋白表達(dá)影響方面也發(fā)揮著重要作用。westernblot，即蛋白質(zhì)免疫印跡，是一種常用的蛋白質(zhì)分析技術(shù)，用于檢測(cè)樣品中特定蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。在研究天然產(chǎn)物對(duì)相關(guān)信號(hào)通路的影響時(shí)，該技術(shù)可以發(fā)揮關(guān)鍵作用。當(dāng)研究某天然產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞內(nèi)MAPK信號(hào)通路的影響時(shí)，首先將細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組用該天然產(chǎn)物處理，對(duì)照組則不做處理。在處理一定時(shí)間后，收集細(xì)胞并提取總蛋白。通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）將蛋白樣品按分子量大小進(jìn)行分離，然后將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移到固相載體（如硝酸纖維素膜或PVDF膜）上。接著，用特異性抗體與膜上的目標(biāo)蛋白進(jìn)行孵育，抗體能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合目標(biāo)蛋白。再加入帶有標(biāo)記（如辣根過(guò)氧化物酶或熒光標(biāo)記）的二抗，二抗與一抗結(jié)合。最后，通過(guò)化學(xué)發(fā)光或熒光檢測(cè)的方法，使標(biāo)記物產(chǎn)生信號(hào)，從而檢測(cè)出目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況。如果在實(shí)驗(yàn)組中，與MAPK信號(hào)通路相關(guān)的蛋白（如ERK、JNK等）的表達(dá)水平與對(duì)照組相比發(fā)生了顯著變化，如表達(dá)上調(diào)或下調(diào)，這就表明該天然產(chǎn)物可能通過(guò)調(diào)節(jié)這些蛋白的表達(dá)來(lái)影響MAPK信號(hào)通路，進(jìn)而發(fā)揮其生物學(xué)作用。通過(guò)對(duì)多個(gè)相關(guān)蛋白的檢測(cè)和分析，可以更全面地了解天然產(chǎn)物對(duì)信號(hào)通路的影響機(jī)制。免疫熒光技術(shù)則是利用熒光標(biāo)記的特異性抗體與細(xì)胞或組織中的抗原結(jié)合，通過(guò)熒光顯微鏡觀察熒光信號(hào)的分布和強(qiáng)度，從而定位和定量分析抗原的表達(dá)和分布情況。在探究天然產(chǎn)物對(duì)特定蛋白表達(dá)和定位的影響時(shí)，免疫熒光技術(shù)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。當(dāng)研究某天然產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的影響時(shí)，將細(xì)胞用天然產(chǎn)物處理后，用多聚甲醛固定細(xì)胞，使其保持原有形態(tài)和結(jié)構(gòu)。然后用TritonX-100等試劑對(duì)細(xì)胞進(jìn)行通透處理，使抗體能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。加入熒光標(biāo)記的針對(duì)該轉(zhuǎn)錄因子的抗體，抗體與細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子特異性結(jié)合。在熒光顯微鏡下觀察，能夠看到熒光信號(hào)的分布情況。如果在對(duì)照組中，轉(zhuǎn)錄因子主要分布在細(xì)胞核內(nèi)，而在實(shí)驗(yàn)組中，由于天然產(chǎn)物的作用，轉(zhuǎn)錄因子的分布發(fā)生了改變，如部分轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中，這就表明該天然產(chǎn)物可能通過(guò)影響轉(zhuǎn)錄因子的定位來(lái)調(diào)節(jié)其功能。通過(guò)對(duì)熒光信號(hào)強(qiáng)度的定量分析，還可以了解天然產(chǎn)物對(duì)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量的影響。免疫熒光技術(shù)能夠直觀地展示天然產(chǎn)物對(duì)蛋白表達(dá)和定位的影響，為深入研究其分子機(jī)理提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。3.3組學(xué)技術(shù)在分子機(jī)理研究中的應(yīng)用3.3.1轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析轉(zhuǎn)錄組學(xué)作為研究細(xì)胞或組織中全部轉(zhuǎn)錄本的學(xué)科，在揭示天然產(chǎn)物作用下基因表達(dá)變化以及挖掘潛在作用機(jī)制方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，可以全面了解天然產(chǎn)物處理后細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)水平的改變，進(jìn)而深入探究其分子作用機(jī)制。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析的核心是運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)細(xì)胞或組織中的RNA進(jìn)行測(cè)序。以研究某天然產(chǎn)物對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制為例，首先從經(jīng)該天然產(chǎn)物處理和未處理的腫瘤細(xì)胞中提取總RNA，利用mRNA具有polyA尾的特點(diǎn)，通過(guò)oligo(dT)磁珠進(jìn)行富集，獲得mRNA。接著，將mRNA隨機(jī)打斷成短片段，以這些短片段為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA雙鏈。對(duì)cDNA進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾和連接測(cè)序接頭等一系列處理后，構(gòu)建成cDNA文庫(kù)。將文庫(kù)中的DNA片段加載到測(cè)序平臺(tái)上，如Illumina測(cè)序平臺(tái)，進(jìn)行高通量測(cè)序。測(cè)序過(guò)程中，DNA片段在測(cè)序芯片上進(jìn)行橋式擴(kuò)增，形成DNA簇，然后通過(guò)邊合成邊測(cè)序的方式，讀取每個(gè)DNA片段的堿基序列，生成大量的測(cè)序數(shù)據(jù)。獲得測(cè)序數(shù)據(jù)后，需要進(jìn)行一系列的生物信息學(xué)分析。首先，使用質(zhì)量控制工具，如FastQC，對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，檢查數(shù)據(jù)的堿基質(zhì)量、序列長(zhǎng)度分布、GC含量等指標(biāo)，確保數(shù)據(jù)的可靠性。去除低質(zhì)量的序列、接頭污染以及含N比例過(guò)高的序列，進(jìn)行數(shù)據(jù)清洗。然后，利用比對(duì)工具，如Bowtie或BWA，將清洗后的測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到參考基因組上，確定每個(gè)測(cè)序片段在基因組中的位置。通過(guò)比對(duì)結(jié)果，使用基因表達(dá)定量工具，如HTSeq或featureCounts，計(jì)算每個(gè)基因的表達(dá)量，通常以每百萬(wàn)映射reads中來(lái)自某基因每千堿基長(zhǎng)度的reads數(shù)（FPKM）或每千堿基轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度每百萬(wàn)映射讀取的轉(zhuǎn)錄本(TPM)來(lái)表示。在分析基因表達(dá)變化時(shí)，通過(guò)比較天然產(chǎn)物處理組和對(duì)照組中基因表達(dá)量的差異，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，如DESeq2或edgeR軟件，篩選出差異表達(dá)基因。如果某基因在天然產(chǎn)物處理組中的表達(dá)量顯著高于或低于對(duì)照組，且經(jīng)過(guò)多重檢驗(yàn)校正后P值小于設(shè)定的閾值（如0.05），則將其認(rèn)定為差異表達(dá)基因。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋和富集分析，使用基因本體（GO）數(shù)據(jù)庫(kù)和京都基因與基因組百科全書（KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)，了解這些基因參與的生物學(xué)過(guò)程、分子功能和信號(hào)通路。如果發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因顯著富集在細(xì)胞凋亡相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路中，這就提示該天然產(chǎn)物可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗癌作用。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，能夠系統(tǒng)地揭示天然產(chǎn)物作用下基因表達(dá)的變化，為深入理解其分子作用機(jī)制提供全面的信息。3.3.2蛋白質(zhì)組學(xué)分析蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在鑒定天然產(chǎn)物作用靶點(diǎn)及相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)方面具有重要應(yīng)用，能夠從蛋白質(zhì)層面深入揭示天然產(chǎn)物的分子作用機(jī)制。其主要原理是利用高分辨率的質(zhì)譜技術(shù)，對(duì)細(xì)胞或組織中的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離、鑒定和定量分析。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，首先從經(jīng)天然產(chǎn)物處理和未處理的樣本中提取蛋白質(zhì)。為了保證蛋白質(zhì)的完整性和活性，通常采用溫和的細(xì)胞裂解方法，如使用含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液，在低溫下進(jìn)行操作。提取的蛋白質(zhì)樣品經(jīng)過(guò)處理后，采用二維凝膠電泳（2-DE）或液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）等技術(shù)進(jìn)行分離和鑒定。二維凝膠電泳是一種經(jīng)典的蛋白質(zhì)分離技術(shù)，它結(jié)合了等電聚焦和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。在第一向等電聚焦中，蛋白質(zhì)根據(jù)其等電點(diǎn)在pH梯度膠上進(jìn)行分離，不同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)會(huì)在膠上的不同位置聚集。在第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中，蛋白質(zhì)根據(jù)其分子量大小在凝膠上進(jìn)一步分離，從而將復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物分離成單個(gè)的蛋白質(zhì)點(diǎn)。通過(guò)對(duì)凝膠上蛋白質(zhì)點(diǎn)的染色（如考馬斯亮藍(lán)染色、銀染等）和成像，能夠直觀地觀察到蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。對(duì)于感興趣的蛋白質(zhì)點(diǎn)，可以將其從凝膠上切下，經(jīng)過(guò)酶解處理，將蛋白質(zhì)消化成肽段，然后通過(guò)質(zhì)譜分析鑒定肽段的序列，進(jìn)而確定蛋白質(zhì)的身份。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)則是目前應(yīng)用更為廣泛的蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)。它將液相色譜的高分離能力與質(zhì)譜的高靈敏度和高分辨率相結(jié)合。在LC-MS/MS分析中，蛋白質(zhì)樣品首先經(jīng)過(guò)液相色譜柱的分離，不同的蛋白質(zhì)在色譜柱中由于其物理化學(xué)性質(zhì)的差異而被分離成不同的餾分。這些餾分依次進(jìn)入質(zhì)譜儀中，在質(zhì)譜儀中，蛋白質(zhì)被離子化，然后根據(jù)其質(zhì)荷比（m/z）進(jìn)行分離和檢測(cè)。通過(guò)質(zhì)譜儀采集到的質(zhì)譜圖，可以獲得蛋白質(zhì)的分子量信息。進(jìn)一步對(duì)肽段進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析（MS/MS），將肽段進(jìn)一步裂解成更小的碎片離子，通過(guò)分析這些碎片離子的質(zhì)荷比和相對(duì)豐度，能夠推斷出肽段的氨基酸序列，從而鑒定蛋白質(zhì)。通過(guò)比較天然產(chǎn)物處理組和對(duì)照組中蛋白質(zhì)的表達(dá)水平和修飾狀態(tài)，可以篩選出差異表達(dá)或修飾的蛋白質(zhì)。使用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，如學(xué)生t檢驗(yàn)、方差分析等，對(duì)蛋白質(zhì)的表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，確定差異表達(dá)蛋白質(zhì)。如果某蛋白質(zhì)在天然產(chǎn)物處理組中的表達(dá)量與對(duì)照組相比有顯著差異（如表達(dá)上調(diào)或下調(diào)），且滿足設(shè)定的統(tǒng)計(jì)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)（如P值小于0.05），則將其視為差異表達(dá)蛋白質(zhì)。對(duì)于蛋白質(zhì)的修飾狀態(tài)，如磷酸化、乙酰化等，通過(guò)特定的富集方法和質(zhì)譜分析技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)和鑒定。使用磷酸化抗體富集磷酸化蛋白質(zhì)或肽段，然后通過(guò)質(zhì)譜分析確定磷酸化位點(diǎn)和磷酸化水平的變化。對(duì)篩選出的差異表達(dá)或修飾的蛋白質(zhì)進(jìn)行功能分析和蛋白網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。利用生物信息學(xué)工具，如STRING數(shù)據(jù)庫(kù)、DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)等，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行功能注釋和富集分析，了解它們參與的生物學(xué)過(guò)程、分子功能和信號(hào)通路。如果發(fā)現(xiàn)某些差異表達(dá)蛋白質(zhì)顯著富集在細(xì)胞周期調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過(guò)程中，這就表明天然產(chǎn)物可能通過(guò)調(diào)節(jié)這些蛋白質(zhì)的表達(dá)或修飾，影響細(xì)胞周期和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而發(fā)揮其生物學(xué)作用。通過(guò)構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，能夠直觀地展示蛋白質(zhì)之間的相互關(guān)系和作用網(wǎng)絡(luò)。在網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點(diǎn)代表蛋白質(zhì)，邊代表蛋白質(zhì)之間的相互作用。通過(guò)分析網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)蛋白質(zhì)，能夠深入了解天然產(chǎn)物作用的分子機(jī)制和潛在靶點(diǎn)。如果某蛋白質(zhì)在網(wǎng)絡(luò)中處于中心位置，與多個(gè)其他蛋白質(zhì)存在相互作用，那么它可能是天然產(chǎn)物作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)，進(jìn)一步研究該蛋白質(zhì)的功能和作用機(jī)制，有助于揭示天然產(chǎn)物的作用原理。四、天然產(chǎn)物虛擬篩選與分子機(jī)理研究案例分析4.1丹參對(duì)缺血性中風(fēng)的作用研究4.1.1丹參提取物的化學(xué)分析為全面鑒定丹參提取物（SME）的化學(xué)成分，研究團(tuán)隊(duì)采用了正交液相分離方法。首先，利用正相硅膠柱色譜，依據(jù)極性差異將SME分離成10個(gè)餾分。正相硅膠柱色譜是基于化合物極性不同進(jìn)行分離的技術(shù)，極性大的化合物在硅膠柱上的保留時(shí)間長(zhǎng)，極性小的化合物則先被洗脫下來(lái)。通過(guò)這種方式，能夠初步將SME中的成分按極性進(jìn)行分類。接著，使用反相C18柱色譜進(jìn)一步分離這些餾分。反相C18柱色譜的固定相是非極性的C18烷基鍵合相，流動(dòng)相通常為極性溶劑，如甲醇-水或乙腈-水體系。在反相色譜中，極性小的化合物保留時(shí)間長(zhǎng)，極性大的化合物先被洗脫，與正相色譜形成互補(bǔ)，能夠更精細(xì)地分離SME中的成分。隨后，研究團(tuán)隊(duì)運(yùn)用UPLC-MS/MS對(duì)每個(gè)餾分進(jìn)行組分鑒定。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）技術(shù)結(jié)合了超高效液相色譜的高分離效率和串聯(lián)質(zhì)譜的高靈敏度、高選擇性，能夠?qū)?fù)雜混合物中的化合物進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的分析。在UPLC-MS/MS分析中，樣品首先通過(guò)超高效液相色譜柱進(jìn)行分離，不同的化合物在色譜柱中由于其物理化學(xué)性質(zhì)的差異而被分離成不同的餾分。這些餾分依次進(jìn)入質(zhì)譜儀中，在質(zhì)譜儀中，化合物被離子化，然后根據(jù)其質(zhì)荷比（m/z）進(jìn)行分離和檢測(cè)。通過(guò)質(zhì)譜儀采集到的質(zhì)譜圖，可以獲得化合物的分子量信息。進(jìn)一步對(duì)化合物進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析（MS/MS），將化合物的母離子進(jìn)一步裂解成更小的碎片離子，通過(guò)分析這些碎片離子的質(zhì)荷比和相對(duì)豐度，能夠推斷出化合物的結(jié)構(gòu)信息。研究團(tuán)隊(duì)還通過(guò)文獻(xiàn)綜述和串聯(lián)質(zhì)譜解釋進(jìn)一步分析SME的化學(xué)特征。通過(guò)查閱大量的文獻(xiàn)資料，了解丹參中已知成分的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜分析得到的碎片離子信息，對(duì)SME中的化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和分析。為了證明鑒定化合物之間的片段相似性，采用了GNPS分子網(wǎng)絡(luò)算法，并使用Cytoscape軟件將結(jié)果可視化。GNPS（GlobalNaturalProductsSocialMolecularNetworking）是一個(gè)基于網(wǎng)絡(luò)的天然產(chǎn)物分析平臺(tái)，它能夠通過(guò)比較質(zhì)譜數(shù)據(jù)，構(gòu)建分子網(wǎng)絡(luò)，展示化合物之間的結(jié)構(gòu)相似性。Cytoscape是一款功能強(qiáng)大的網(wǎng)絡(luò)分析和可視化軟件，能夠?qū)NPS分析得到的分子網(wǎng)絡(luò)以直觀的圖形方式展示出來(lái)。通過(guò)這些分析方法，在SME中發(fā)現(xiàn)了10個(gè)主要簇。苯丙烷類和聚酮類由31種化合物表示，其中丹酚酸B是該類化合物中的典型代表；低聚糖化合物由60個(gè)節(jié)點(diǎn)表示，水蘇糖為核心物質(zhì)；脂質(zhì)和脂質(zhì)樣分子簇包含62個(gè)節(jié)點(diǎn)，具有丹參酮IIA等典型化合物。這些成分是SME中已知的活性成分，對(duì)心血管保護(hù)、抗炎、抗氧化等方面具有顯著的藥理作用。在這項(xiàng)對(duì)SME的全面化學(xué)分析中，共鑒定出151種化合物，支撐材料列舉了SME中所選代表性化合物（丹酚酸C、丹酚酸B、迷迭香酸）的離子碎片匹配信息。這是迄今為止在一項(xiàng)研究中報(bào)道的SME的最廣泛的表征。4.1.2虛擬篩選與靶標(biāo)預(yù)測(cè)虛擬篩選（VS）作為一種重要的計(jì)算方法，利用計(jì)算機(jī)模擬來(lái)快速且經(jīng)濟(jì)高效地預(yù)測(cè)大量化合物與生物靶標(biāo)之間的結(jié)合相互作用，從而加速藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)過(guò)程。在對(duì)丹參提取物（SME）的研究中，研究團(tuán)隊(duì)采用VS技術(shù)獲得SME中生物活性化合物的綜合靶標(biāo)信息，同時(shí)考慮其結(jié)構(gòu)和生物活性特性。藥物開(kāi)發(fā)的ChemicalChecker（CC）平臺(tái)提供了一個(gè)全面的數(shù)據(jù)集成框架，研究團(tuán)隊(duì)將CC基于深度學(xué)習(xí)的多維相似性分析應(yīng)用于SME化合物。通過(guò)這種分析方法，發(fā)現(xiàn)了SME中的兩種關(guān)鍵化合物丹酚酸C和丹酚酸B之間的結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)相似性，以及它們?cè)谂c其他相關(guān)分子結(jié)合后的共同靶標(biāo)。丹酚酸C和丹酚酸B在結(jié)構(gòu)上具有一定的相似性，都含有酚羥基、羧基等官能團(tuán)，這些相似的結(jié)構(gòu)特征可能導(dǎo)致它們?cè)谂c靶標(biāo)結(jié)合時(shí)具有相似的作用方式和親和力。通過(guò)分析它們與其他相關(guān)分子結(jié)合后的共同靶標(biāo)，能夠更深入地了解它們的作用機(jī)制和潛在的治療靶點(diǎn)。研究團(tuán)隊(duì)整合基于結(jié)構(gòu)相似性篩選和多維生物相似性分析得到的靶點(diǎn)信息，共鑒定出126個(gè)SME化合物的281個(gè)潛在靶蛋白?；诮Y(jié)構(gòu)相似性篩選是通過(guò)比較化合物的結(jié)構(gòu)特征，尋找與已知活性化合物結(jié)構(gòu)相似的分子，這些分子可能具有相似的生物活性和作用靶點(diǎn)。多維生物相似性分析則從多個(gè)維度考慮化合物的生物活性、藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)等因素，綜合評(píng)估化合物與靶標(biāo)的相互作用。通過(guò)將這兩種分析方法得到的靶點(diǎn)信息進(jìn)行整合，能夠更全面、準(zhǔn)確地鑒定出SME化合物的潛在靶蛋白。研究團(tuán)隊(duì)使用“缺血性中風(fēng)”作為關(guān)鍵詞，將已確定的潛在靶點(diǎn)與DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行交叉分析，以確定與該疾病治療相關(guān)的重疊靶點(diǎn)。DisGeNET是一個(gè)綜合性的疾病-基因關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫(kù)，包含了大量與各種疾病相關(guān)的基因和靶點(diǎn)信息。通過(guò)將SME化合物的潛在靶點(diǎn)與DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)中的缺血性中風(fēng)相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行交叉分析，能夠篩選出可能涉及SME對(duì)抗缺血性中風(fēng)作用機(jī)制的共同靶標(biāo)。這種全面的方法最終確定了29個(gè)可能涉及SME對(duì)抗缺血性中風(fēng)的作用機(jī)制的共同靶標(biāo)，為后續(xù)深入研究SME治療缺血性中風(fēng)的分子機(jī)制提供了重要的靶點(diǎn)信息。4.1.3分子機(jī)理驗(yàn)證與分析為了深入探究丹參提取物（SME）治療缺血性中風(fēng)的分子機(jī)理，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了一系列的驗(yàn)證與分析工作。在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)方面，體外實(shí)驗(yàn)在PC12細(xì)胞中使用氧-葡萄糖剝奪/復(fù)氧（OGD/R）模型，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用大鼠永久性大腦中動(dòng)脈閉塞（pMCAO）模型。在體外實(shí)驗(yàn)中，用SME預(yù)處理PC12細(xì)胞24h，然后進(jìn)行2hOGD建模和24h再供氧，然后進(jìn)行CCK-8測(cè)定以評(píng)估SME對(duì)OGD誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的增殖作用。結(jié)果顯示SME對(duì)缺氧缺血性損傷發(fā)揮線粒體保護(hù)作用，從而提供神經(jīng)保護(hù)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SME預(yù)處理減少大鼠腦中的缺血損傷，減輕了組織壞死，維持了細(xì)胞完整性，并減少神經(jīng)元凋亡。這些全面的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)為SME對(duì)缺血性中風(fēng)損傷的神經(jīng)保護(hù)作用提供了有力的證據(jù)，驗(yàn)證了其治療缺血性中風(fēng)的潛在治療效果。在富集分析方面，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)兩組靶點(diǎn)進(jìn)行了GO富集分析，同時(shí)對(duì)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)相似靶點(diǎn)與缺血性中風(fēng)相關(guān)靶點(diǎn)交集的29個(gè)重疊靶點(diǎn)進(jìn)行了富集分析?；虮倔w（GO）富集分析能夠確定基因或蛋白質(zhì)在生物學(xué)過(guò)程、分子功能和細(xì)胞組成等方面的富集情況。通過(guò)GO富集分析，發(fā)現(xiàn)SME可能通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)和絲氨酸水解酶活性來(lái)影響缺血性中風(fēng)的進(jìn)展。在炎癥反應(yīng)方面，SME可能調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，抑制炎癥因子的釋放，減輕炎癥對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷；在細(xì)胞外基質(zhì)方面，SME可能影響細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解，維持細(xì)胞外環(huán)境的穩(wěn)定，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)和再生；在絲氨酸水解酶活性方面，SME可能通過(guò)調(diào)節(jié)絲氨酸水解酶的活性，影響相關(guān)信號(hào)通路的傳導(dǎo)，從而發(fā)揮治療缺血性中風(fēng)的作用。研究團(tuán)隊(duì)對(duì)29種潛在靶蛋白進(jìn)行KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)血清素能突觸功能通路中ALOX12、ALOX5、ALOX15、APP和PTGS2的富集，以及花生四烯酸代謝中PTGS2、ALOX5、ALOX15和ALOX12的富集。京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析能夠確定基因或蛋白質(zhì)在代謝通路、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等方面的富集情況