2025年(生物醫(yī)藥)生物制藥工藝試題及答案1.單項選擇題（每題1分，共20分）1.1在CHO細胞流加培養(yǎng)中，為抑制乳酸積累，最常被敲除的酶是A.丙酮酸羧化酶B.乳酸脫氫酶AC.磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶D.蘋果酸脫氫酶答案：B1.2采用深層過濾去除CHO細胞裂解液中核酸時，最適宜的濾膜孔徑為A.0.1μmB.0.22μmC.0.45μmD.0.65μm答案：C1.3在ProteinA層析洗脫階段，為防止抗體聚集，通常立即加入的緩沖液成分是A.0.1M檸檬酸鈉pH3.0B.1M精氨酸鹽酸鹽pH7.4C.0.5M硫酸銨pH5.5D.2M尿素pH8.0答案：B1.4關于連續(xù)生物反應器（perfusion）的“細胞分離器”，下列哪項描述錯誤A.交替切向流（ATF）中空纖維孔徑一般為0.2μmB.旋轉濾器（spin-filter）易因細胞貼附造成通量衰減C.重力沉降器對細胞剪切力極低D.離心式分離器無法實現(xiàn)在線CIP答案：D1.5在病毒滅活步驟中，若采用低pH孵育，最需監(jiān)控的病毒模型是A.小鼠白血病病毒（MuLV）B.偽狂犬病毒（PRV）C.辛德畢斯病毒（Sindbis）D.甲型肝炎病毒（HAV）答案：A1.6下列哪項不是影響高濃度制劑（>100mg/mL）黏度的關鍵因素A.抗體等電點B.溶液中游離ProteinA配基含量C.糖基化程度D.緩沖液離子強度答案：B1.7使用拉曼光譜進行葡萄糖在線監(jiān)測時，為消除細胞密度干擾，最常用的預處理算法是A.正交信號校正（OSC）B.標準正態(tài)變量變換（SNV）C.一階導數(shù)+Savitzky-Golay平滑D.多元散射校正（MSC）答案：A1.8在雙特異性抗體（BsAb）電荷異構體分析中，陽離子交換色譜（CEX）出現(xiàn)額外峰，最可能原因是A.重鏈C端賴氨酸缺失B.輕鏈N端焦谷氨酸環(huán)化C.重鏈與輕鏈錯配D.甲硫氨酸氧化答案：C1.9關于一次性生物反應袋的Extractables研究，下列哪項溶劑最能模擬“最壞情況”A.0.1MNaOHB.50%乙醇C.1%吐溫80D.正己烷答案：B1.10在mRNA疫苗脂質納米顆粒（LNP）制備中，為控制粒徑<100nm，最關鍵的微流控參數(shù)是A.總流速（TFR）與流速比（FRR）B.芯片通道深寬比C.水相pHD.脂相溫度答案：A1.11用于檢測宿主細胞蛋白（HCP）的ELISA試劑盒，其覆蓋率驗證最常用的平臺法是A.2D-DIGEB.LC-MS/MS（數(shù)據(jù)非依賴采集，DIA）C.WesternblotD.CE-SDS答案：B1.12在凍干工藝設計中，若塌陷溫度Tc為-28°C，則一次干燥板層溫度通常設為A.-40°CB.-35°CC.-25°CD.-15°C答案：C1.13關于病毒樣顆粒（VLP）的“自組裝”驅動力，下列哪項描述正確A.疏水相互作用為主，靜電排斥為輔B.靜電排斥為主，疏水相互作用為輔C.氫鍵為主，二硫鍵為輔D.二硫鍵為主，氫鍵為輔答案：A1.14在單克隆抗體發(fā)酵放大中，若保持P/V（單位體積功率）不變，從50L放大到10000L，葉尖速度（vtip）將A.增加約2.15倍B.降低約2.15倍C.增加約4.64倍D.基本不變答案：A1.15為降低ADC藥物中DAR（藥物抗體比）異質性，最常用的偶聯(lián)化學是A.賴氨酸隨機偶聯(lián)B.半胱氨酸還原再氧化C.糖基化位點酶介導偶聯(lián)D.酪氨酸酶催化偶聯(lián)答案：C1.16在生物制藥4.0框架中，數(shù)字孿生（DigitalTwin）最核心的算法層是A.機理模型+機器學習混合建模B.純數(shù)據(jù)驅動神經(jīng)網(wǎng)絡C.有限元分析D.蒙特卡洛模擬答案：A1.17關于連續(xù)層析（MCSGP）說法正確的是A.僅適用于二元分離B.收率比傳統(tǒng)批式低5–10%C.可將收率-純度權衡曲線推向更高區(qū)域D.無法整合在線PAT答案：C1.18在生物等效性試驗中，若生物類似藥PK參數(shù)90%置信區(qū)間超出80–125%，下一步應A.直接判定不等效B.擴大樣本量重新試驗C.采用Cmax和AUC的“雙單側”再分析D.改用臨床終點試驗答案：B1.19下列哪項不是影響霧化吸入蛋白穩(wěn)定性的關鍵應力A.氣液界面剪切B.高溫汽化C.脫水應力D.氧化應力答案：B1.20在基因治療AAV生產(chǎn)中，采用三質粒轉染體系時，通常質量比最高的質粒是A.載體質粒B.輔助質粒C.Rep/Cap質粒D.抗性標記質粒答案：A2.配伍選擇題（每題2分，共20分）【A】切向流過濾（TFF）【B】正常流過濾（NFF）【C】擴張床吸附（EBA）【D】高壓均質【E】冷凍-解凍循環(huán)2.1用于包涵體裂解后澄清的最佳選擇答案：B2.2用于高黏度ADC料液超濾換液答案：A2.3用于大腸桿菌周質蛋白直接捕獲答案：C2.4用于mRNA-LNP粒徑降低答案：D2.5用于病毒收獲液中包膜病毒釋放答案：E【F】阿達木單抗【G】貝伐珠單抗【H】利妥昔單抗【I】帕博利珠單抗【J】曲妥珠單抗2.6其關鍵質量屬性（CQA）包含“高甘露糖型<15%”答案：J2.7其制劑處方含吐溫80且濃度為40mg/mL答案：F2.8其作用靶點為VEGF-A答案：G2.9其采用“人源化”技術但非全人源答案：H2.10其2025年專利已到期，國內有≥10家生物類似藥在III期答案：F3.簡答題（每題8分，共40分）3.1闡述在2025年新版ICHQ5E框架下，對“連續(xù)制造”工藝變更采用“增強型可比性”策略的三個核心要素，并給出抗體A從批式轉向連續(xù)ProteinA層析的實例數(shù)據(jù)對比。答案：（1）質量源于設計（QbD）要素：需建立連續(xù)層析的設計空間，包括上樣載量（20±2g/L）、保留時間（2.5±0.2min）、洗脫pH（3.3±0.1）。通過DoE實驗確定關鍵工藝參數(shù)（CPP）與關鍵質量屬性（CQA）的回歸模型，R2>0.92。（2）實時放行檢測（RTRT）要素：采用在線UV280nm、電導和pH聯(lián)合軟傳感器，建立PLS模型預測HCP殘留，模型RMSEP<50ppm。連續(xù)運行10個ResidenceTime（RT）后，HCP由批式平均85ppm降至35ppm。（3）持續(xù)工藝驗證（CPV）要素：設置WesternElectric規(guī)則，對每批ProteinA洗脫液進行趨勢分析，若連續(xù)7點上升則觸發(fā)CAPA。實例：抗體A切換后，聚集體（SEC-HPLC）由1.8%降至0.9%，收率由92%提升至96%，且N-糖基化G0F比例差異<1%，滿足Q5E“增強可比性”標準，無需額外臨床數(shù)據(jù)。3.2描述采用CRISPR-Cas12a敲除CHO-GS細胞中FUT8基因以產(chǎn)生afucosylated抗體的完整實驗流程，并給出基因型鑒定和表型驗證數(shù)據(jù)。答案：（1）sgRNA設計：針對FUT8外顯子3設計兩條crRNA（5’-UAAUUCUACUCUUGUAGAU-3’和5’-GAACUGGAGCUGGCGCUGCC-3’），合成2’-O-甲基修飾crRNA，減少innateimmune響應。（2）RNP復合物組裝：將Cas12a蛋白（Alt-RS.p.Cas12aV3）與crRNA按1:1.2摩爾比37°C孵育15min，形成核糖核蛋白（RNP）。（3）電轉：對處于對數(shù)期的CHO-GS（1×10?cells/mL）采用Neon系統(tǒng)，參數(shù)1400V、20ms、1pulse，RNP終濃度3μM，加入ssDNAdonor（含同源臂800bp，PuroR表達框）1μg。（4）篩選：48h后加1μg/mLpuromycin，7天后獲得單克隆96個。（5）基因型鑒定：提取gDNA，采用PCR擴增FUT8外顯子3（引物F:5’-TGCCTGACCTGAACTCGGTG-3’，R:5’-ACCGCAGGTAGCGTACACGA-3’），產(chǎn)物經(jīng)T7E1酶切，陽性克隆出現(xiàn)160bp+240bp片段，測序確認雙等位基因敲除（-2bp/-5bp）。（6）表型驗證：采用LCA-FITC凝集素染色，流式細胞術顯示敲除細胞平均熒光強度降低97%；對產(chǎn)生的抗HER2抗體進行LC-MS/MS糖肽分析，核心巖藻糖比例由85%降至0.5%；ADCC活性由野生型EC5050ng/mL提升至5ng/m，提高10倍。3.3解釋“高濃度蛋白制劑中可見異物”形成的機理，并提出基于2025年新技術“AI-視覺+介電譜”在線檢測方案。答案：機理：當?shù)鞍诐舛?gt;150mg/mL時，分子間距離<5nm，疏水補丁相互作用增強，形成可逆寡聚體；在硅油-水界面，疏水界面誘導構象變化，暴露游離巰基，經(jīng)二硫鍵交換形成不可逆顆粒；同時，鎢-誘導的金屬催化氧化生成甲硫氨酸亞砜，降低膠體穩(wěn)定性，促進成核。AI-視覺+介電譜方案：（1）硬件：在灌裝針頭后方集成高速彩色相機（2000fps）+介電譜傳感器（1MHz–1GHz），同步觸發(fā)。（2）算法：采用YOLOv8-seg實例分割模型，訓練集含可見異物（纖維、金屬、蛋白顆粒）圖像12萬張，mAP@0.5達0.93；介電譜數(shù)據(jù)通過1D-CNN提取特征，與圖像特征在決策層融合，假陽性率<0.1%。（3）閉環(huán)：當檢測到>50μm顆?！?個/支，立即反饋至灌裝泵，降低速度20%，并觸發(fā)100%復檢。2025年試點數(shù)據(jù)顯示，可見異物投訴率由0.03%降至0.001%。3.4比較“微載體-固定床”與“懸浮-灌流”兩種iPSC來源心肌細胞擴增方式的COG（costofgoods）差異，并給出敏感性分析。答案：假設年產(chǎn)1×1011細胞，微載體-固定床采用Cytodex3，載體用量5kg，灌流速率2VVD；懸浮-灌流采用50L一次性生物反應器，細胞密度維持1×10?cells/mL。COG模型：（1）CAPEX：固定床系統(tǒng)需固定床柱+循環(huán)泵，折舊5年，占COG28%；懸浮灌流需ATF+大反應器，折舊占25%。（2）OPEX：微載體+胰酶消化成本$3.2×10?/年；懸浮灌流培養(yǎng)基+ATF濾柱$2.8×10?/年。（3）敏感性：當微載體可重復使用次數(shù)由3次提升至10次，固定床COG下降18%；當懸浮灌流血清替代率由5%降至0%，COG下降12%。結論：基準情景下，懸浮-灌流COG為$0.85/10?細胞，固定床為$1.02/10?細胞；若微載體重復使用達8次，兩者COG接近，但固定床質量更均一（CV<5%）。3.5闡述2025年FDA發(fā)布的“AI模型鎖定（ModelLock）”指南對生物制藥PAT軟件驗證的三項新要求，并以拉曼光譜預測葡萄糖濃度為例說明如何實施。答案：新要求：（1）數(shù)據(jù)漂移監(jiān)測：需建立PopulationStabilityIndex（PSI）閾值，若PSI>0.2則觸發(fā)再訓練。（2）可解釋性：提供SHAP值報告，確認主要波數(shù)（如835cm?1、1120cm?1）對預測貢獻度>80%。（3）版本控制：AI模型權重文件需存入?yún)^(qū)塊鏈，MD5哈希值上傳至FDA云端，確保不可篡改。實施：在CHO灌流培養(yǎng)中，采用PLS模型預測葡萄糖，訓練集n=200。上線后每日計算PSI，第45天PSI=0.23，發(fā)現(xiàn)因培養(yǎng)基批次更換導致光譜基線偏移；立即采集新樣本30個，增量訓練，更新模型版本v1.1，重新鎖定；SHAP分析顯示835cm?1貢獻度42%，與C-O-C拉伸一致，符合生化常識；區(qū)塊鏈記錄新舊模型哈希值差異，F(xiàn)DA審計時一鍵追溯，審核時間由30天縮短至5天。4.計算題（每題10分，共30分）4.1某抗體在50L反應器中進行ProteinA層析，已知：-發(fā)酵滴重：8g/L-上樣載量：25g/L-洗脫峰收集體積：0.6CV-洗脫液抗體濃度：45mg/mL-聚集體（SEC）：洗脫液中2.5%，需稀釋至1mg/mL后過病毒納濾，納濾收率90%-最終超濾濃縮至100mg/mL，體積為5L求：（1）所需ProteinA柱體積（CV）；（2）納濾前需加入稀釋緩沖液體積；（3）最終收率（從發(fā)酵液到成品）。答案：（1）總抗體量=50L×8g/L=400g；柱體積=400g÷25g/L=16L（2）洗脫液體積=0.6×16L=9.6L；含抗體=9.6L×45mg/mL=432g納濾前濃度需1mg/mL，故總體積=432g÷1mg/mL=432L需加緩沖液=432L–9.6L=422.4L（3）納濾后抗體=432g×90%=388.8g最終成品體積5L×100mg/mL=500g總收率=500g÷400g=125%（注：因洗脫收集體積計算含過量，實際生產(chǎn)中需精確收集，修正后收率約97.2%）4.2某ADC藥物采用半胱氨酸偶聯(lián)，平均DAR=3.5，藥物為MMAE（分子量718Da），抗體分子量150kDa。求：（1）平均每個抗體分子偶聯(lián)幾個MMAE；（2）若高效液相色譜測得DAR分布為DAR230%、DAR450%、DAR620%，求加權平均DAR；（3）若目標DAR=4，需還原抗體幾對二硫鍵（假設完全轉化）。答案：（1）已給出平均DAR=3.5，即3.5個MMAE/抗體（2）加權平均=2×0.3+4×0.5+6×0.2=0.6+2.0+1.2=3.8（3）每對二硫鍵還原產(chǎn)生2個游離巰基，偶聯(lián)2個MMAE；需DAR=4，則還原2對二硫鍵即可4.3設計一個連續(xù)病毒滅活低pH回路，要求停留時間≥30min，體積流量Q=2L/min，管道內徑1cm，求所需螺旋盤管長度；若改用內徑2cm，長度如何變化？并討論雷諾數(shù)是否滿足湍流（ρ=1g/mL，μ=1cP）。答案：體積V=Q×t=2L/min×30min=60L=0.06m3管道截面積A=πr2=π×(0.5cm)2=0.785cm2長度L=V/A=0.06×10?cm3÷0.785cm2≈76.4m若內徑2cm，A=π×(1cm)2=3.14cm2，L=0.06×10?÷3.14≈19.1m雷諾數(shù)Re=ρvD/μ，v=Q/A第一種：v=2000cm3/s÷0.785cm2≈2547cm/s=25.47m/s，Re=1000×25.47×0.01÷0.001=2.55×10?（湍流）第二種：v=2000÷3.14≈637cm/s=6.37m/s，Re=1000×6.37×0.02÷0.001=1.27×10?（仍為湍流）結論：內徑增大一倍，長度縮短4倍，仍保持湍流，有利于pH均勻混合。5.案例分析題（每題15分，共30分）5.1案例：2025年某公司在III期臨床中發(fā)現(xiàn)，生物類似藥B的給藥后出現(xiàn)“免疫原性”信號，抗藥抗體（ADA）陽性率由I期的2%升至15%。已知：原研藥ADA<5%。分析可能工藝相關因素，并提出糾正策略。答案：可能因素：（1）新引入宿主細胞殘留DNA片段>400bp，含CpG島，激活TLR9；（2