基于群體感應(yīng)通路：腐敗希瓦氏菌對(duì)副溶血弧菌毒力因子的影響機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義副溶血弧菌（Vibrioparahaemolyticus）作為一種常見(jiàn)的食源性病原菌，廣泛分布于海洋及河口環(huán)境，在海產(chǎn)品中的檢出率頗高。該菌是全球沿海國(guó)家食源性疾病和感染性腹瀉的主要病原菌，主要引發(fā)散發(fā)或聚集性暴發(fā)的急性胃腸炎，對(duì)于免疫力低下的人群，還可能進(jìn)展為敗血癥和壞死性筋膜炎，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致死亡。其致病性是多種毒力因子共同作用的結(jié)果，包括溶血毒素、分泌系統(tǒng)、粘附因子、攝鐵系統(tǒng)、脂多糖和蛋白酶等，這些毒力因子在細(xì)菌的粘附、侵襲、增殖和毒素釋放等感染過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。例如，耐熱直接溶血素（TDH）和耐熱直接溶血素相關(guān)溶血素（TRH）被視為主要致病因子，TDH能與紅細(xì)胞膜上的GT1神經(jīng)節(jié)苷脂受體結(jié)合，形成跨膜孔，致使紅細(xì)胞膨脹破裂，還能使腸上皮細(xì)胞鈣離子濃度升高，引發(fā)水樣瀉。Ⅲ型分泌系統(tǒng)（T3SS）則像一個(gè)“注射器”，將細(xì)菌效應(yīng)蛋白注入宿主細(xì)胞，破壞宿主細(xì)胞正常功能。群體感應(yīng)（Quorumsensing，QS）是細(xì)菌根據(jù)細(xì)胞密度變化進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控的一種機(jī)制，在細(xì)菌的生命活動(dòng)中扮演著至關(guān)重要的角色。細(xì)菌通過(guò)分泌自誘導(dǎo)劑（Autoinducer，AI）這類(lèi)信號(hào)分子來(lái)感知群體密度，當(dāng)信號(hào)分子濃度隨細(xì)菌密度增加達(dá)到一定閾值時(shí)，便會(huì)與相應(yīng)受體結(jié)合，啟動(dòng)特定基因的表達(dá)，從而調(diào)控細(xì)菌的多種生理功能。在副溶血弧菌中，群體感應(yīng)系統(tǒng)對(duì)其毒力因子的表達(dá)起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。研究表明，群體感應(yīng)信號(hào)分子能夠調(diào)節(jié)溶血毒素基因的表達(dá)，影響Ⅲ型分泌系統(tǒng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)控細(xì)菌的致病性。此外，群體感應(yīng)還參與調(diào)控副溶血弧菌的生物膜形成、運(yùn)動(dòng)性等生理過(guò)程，這些過(guò)程與細(xì)菌的生存和感染能力密切相關(guān)。在海洋生態(tài)系統(tǒng)以及海產(chǎn)品加工和儲(chǔ)存環(huán)境中，副溶血弧菌并非孤立存在，而是與多種微生物共同生存，其中腐敗希瓦氏菌（Shewanellaputrefaciens）是常見(jiàn)的共存菌之一。腐敗希瓦氏菌是一種革蘭氏陰性菌，廣泛分布于土壤、水體和食品等環(huán)境中，在海產(chǎn)品中常作為優(yōu)勢(shì)腐敗菌存在，能利用多種含氮化合物產(chǎn)生腐敗代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致海產(chǎn)品的品質(zhì)劣變。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌之間存在著復(fù)雜的相互作用，這種相互作用會(huì)對(duì)細(xì)菌的生理特性和致病性產(chǎn)生顯著影響。在副溶血弧菌與腐敗希瓦氏菌的共存體系中，二者可能通過(guò)群體感應(yīng)信號(hào)分子進(jìn)行信息交流，進(jìn)而影響彼此的生長(zhǎng)、毒力因子表達(dá)和生物膜形成等生理過(guò)程。然而，目前對(duì)于腐敗希瓦氏菌如何通過(guò)群體感應(yīng)影響副溶血弧菌毒力因子的表達(dá)和調(diào)控機(jī)制，仍缺乏深入系統(tǒng)的研究。深入探究腐敗希瓦氏菌對(duì)副溶血弧菌毒力因子的影響機(jī)制，在理論和實(shí)際應(yīng)用方面都具有重要意義。在理論層面，有助于我們更全面、深入地理解細(xì)菌菌群之間的相互作用關(guān)系以及群體感應(yīng)在其中的調(diào)控機(jī)制，豐富微生物生態(tài)學(xué)和細(xì)菌致病機(jī)制的理論知識(shí)，為進(jìn)一步研究細(xì)菌之間的信號(hào)傳導(dǎo)和協(xié)同致病提供新的思路和理論依據(jù)。在實(shí)際應(yīng)用方面，對(duì)于保障海產(chǎn)品的質(zhì)量安全和人類(lèi)健康具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。通過(guò)揭示二者之間的作用機(jī)制，可以為開(kāi)發(fā)針對(duì)副溶血弧菌的防控策略提供新的靶點(diǎn)和理論支持，有助于制定更加有效的海產(chǎn)品保鮮和食品安全控制措施，降低副溶血弧菌引發(fā)的食源性疾病風(fēng)險(xiǎn)，保障消費(fèi)者的飲食安全。同時(shí)，也為食品加工和儲(chǔ)存過(guò)程中的微生物控制提供了新的方向和方法，有利于推動(dòng)食品行業(yè)的健康發(fā)展。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在副溶血弧菌毒力因子的研究方面，目前已取得了較為豐碩的成果。對(duì)于溶血毒素，已明確耐熱直接溶血素（TDH）和耐熱直接溶血素相關(guān)溶血素（TRH）是主要致病因子，對(duì)它們的基因結(jié)構(gòu)、生物學(xué)活性及表達(dá)調(diào)控機(jī)制有了較深入的了解。如TDH與紅細(xì)胞膜上GT1神經(jīng)節(jié)苷脂受體結(jié)合形成跨膜孔導(dǎo)致紅細(xì)胞破裂，其表達(dá)受跨膜調(diào)節(jié)蛋白ToxR和ToxS、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白VtrA和VtrB以及甘露醇、高濃度氯化鈉等環(huán)境因素的影響。在分泌系統(tǒng)研究中，詳細(xì)解析了Ⅲ型分泌系統(tǒng)（T3SS）的結(jié)構(gòu)和功能，包括T3SS1和T3SS2的組成、效應(yīng)蛋白種類(lèi)及各自的調(diào)控機(jī)制。像T3SS1的效應(yīng)蛋白VopQ能與溶酶體膜上的V-ATPase結(jié)合，導(dǎo)致宿主細(xì)胞自噬和細(xì)胞毒性；T3SS2的效應(yīng)蛋白VopA通過(guò)乙?；揎桵APK激酶，抑制MAPKs信號(hào)傳導(dǎo)。此外，對(duì)粘附因子、攝鐵系統(tǒng)、脂多糖和蛋白酶等毒力因子也開(kāi)展了廣泛研究，初步揭示了它們?cè)诟比苎【虏∵^(guò)程中的作用。關(guān)于群體感應(yīng)系統(tǒng)，對(duì)其信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制和調(diào)控功能的研究是當(dāng)前熱點(diǎn)。在副溶血弧菌中，已鑒定出多種群體感應(yīng)信號(hào)分子及相應(yīng)的受體和調(diào)控蛋白，深入探究了群體感應(yīng)系統(tǒng)對(duì)毒力因子表達(dá)、生物膜形成和運(yùn)動(dòng)性等生理過(guò)程的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，群體感應(yīng)信號(hào)分子濃度的變化能夠激活或抑制相關(guān)基因的表達(dá)，從而影響細(xì)菌的毒力和生存能力。一些群體感應(yīng)抑制劑能夠干擾信號(hào)傳導(dǎo)，降低細(xì)菌的致病性，為防控副溶血弧菌感染提供了新的策略。然而，對(duì)于群體感應(yīng)系統(tǒng)在復(fù)雜環(huán)境中的動(dòng)態(tài)變化以及與其他調(diào)控系統(tǒng)的交互作用，仍有待進(jìn)一步深入研究。在腐敗希瓦氏菌與副溶血弧菌相互作用的研究領(lǐng)域，已有研究表明二者共存時(shí)會(huì)對(duì)彼此的生長(zhǎng)、生物膜形成等產(chǎn)生影響。有研究發(fā)現(xiàn)，腐敗希瓦氏菌的乙酸乙酯提取物可促進(jìn)副溶血弧菌生物被膜的形成。但目前關(guān)于二者相互作用機(jī)制的研究還相對(duì)較少，尤其是從群體感應(yīng)角度探究腐敗希瓦氏菌對(duì)副溶血弧菌毒力因子的影響機(jī)制，尚未形成系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)。對(duì)于二者之間是否存在特異性的信號(hào)交流以及如何通過(guò)群體感應(yīng)調(diào)控毒力因子表達(dá)等關(guān)鍵問(wèn)題，仍缺乏深入的研究和明確的結(jié)論?，F(xiàn)有研究大多集中在單一因素的影響，缺乏對(duì)多因素綜合作用的系統(tǒng)分析，難以全面揭示二者相互作用的本質(zhì)。1.3研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入解析基于群體感應(yīng)的腐敗希瓦氏菌對(duì)副溶血弧菌毒力因子的影響機(jī)制，為海產(chǎn)品食品安全控制提供理論依據(jù)和新的策略。具體研究?jī)?nèi)容如下：副溶血弧菌群體感應(yīng)信號(hào)分子合成酶基因敲除突變株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性研究：運(yùn)用基因敲除技術(shù)，構(gòu)建副溶血弧菌群體感應(yīng)信號(hào)分子合成酶基因luxM和luxS的敲除突變株。通過(guò)對(duì)突變株的生長(zhǎng)曲線、運(yùn)動(dòng)性、生物膜形成能力等生物學(xué)特性進(jìn)行分析，明確群體感應(yīng)信號(hào)分子缺失對(duì)副溶血弧菌基本生理特性的影響。同時(shí)，利用熒光定量PCR等技術(shù)，檢測(cè)毒力因子基因（如tdh、trh、T3SS相關(guān)基因等）在突變株中的表達(dá)水平變化，初步探究群體感應(yīng)信號(hào)分子與毒力因子表達(dá)的內(nèi)在聯(lián)系。腐敗希瓦氏菌對(duì)副溶血弧菌親本株及其群體感應(yīng)信號(hào)分子合成酶基因缺失株毒力因子的作用效應(yīng)比較：將腐敗希瓦氏菌與副溶血弧菌親本株、luxM和luxS基因缺失株分別進(jìn)行共培養(yǎng)，構(gòu)建不同的共培養(yǎng)體系。通過(guò)測(cè)定共培養(yǎng)體系中副溶血弧菌的生長(zhǎng)曲線，分析腐敗希瓦氏菌對(duì)副溶血弧菌生長(zhǎng)的影響。采用溶血實(shí)驗(yàn)檢測(cè)副溶血弧菌溶血活性的變化，利用熒光定量PCR檢測(cè)耐熱直接溶血毒素基因tdh等毒力因子基因的表達(dá)量，運(yùn)用結(jié)晶紫染色法和熒光原位雜交法分析生物膜的形成情況。通過(guò)比較不同共培養(yǎng)體系中副溶血弧菌毒力因子的變化，明確腐敗希瓦氏菌對(duì)副溶血弧菌毒力因子的作用效應(yīng)，以及群體感應(yīng)信號(hào)分子在其中的介導(dǎo)作用。群體感應(yīng)信號(hào)分子與腐敗希瓦氏菌-副溶血弧菌作用效應(yīng)的關(guān)聯(lián)性：采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）等技術(shù)，檢測(cè)不同共培養(yǎng)體系中群體感應(yīng)信號(hào)分子（如AHLs、AI-2等）的種類(lèi)和濃度變化。分析信號(hào)分子濃度變化與副溶血弧菌毒力因子（溶血活性、生物膜形成等）變化之間的相關(guān)性，明確群體感應(yīng)信號(hào)分子在腐敗希瓦氏菌影響副溶血弧菌毒力因子過(guò)程中的作用機(jī)制。進(jìn)一步通過(guò)添加外源信號(hào)分子或信號(hào)分子抑制劑，驗(yàn)證群體感應(yīng)信號(hào)分子與副溶血弧菌毒力因子之間的因果關(guān)系，揭示基于群體感應(yīng)的二者相互作用的分子機(jī)制。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究綜合運(yùn)用多種實(shí)驗(yàn)方法，深入探究基于群體感應(yīng)的腐敗希瓦氏菌對(duì)副溶血弧菌毒力因子的影響機(jī)制，具體方法如下：基因敲除技術(shù)：針對(duì)副溶血弧菌群體感應(yīng)信號(hào)分子合成酶基因luxM和luxS，采用同源重組的方法構(gòu)建基因敲除打靶載體。通過(guò)接合實(shí)驗(yàn)將打靶載體導(dǎo)入副溶血弧菌中，利用抗性篩選和PCR鑒定，獲得luxM和luxS基因敲除突變株。共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)：將腐敗希瓦氏菌與副溶血弧菌親本株、luxM和luxS基因缺失株分別進(jìn)行共培養(yǎng)。在溶血效應(yīng)共培養(yǎng)體系中，設(shè)定不同的共培養(yǎng)時(shí)間和比例，定期測(cè)定副溶血弧菌的生長(zhǎng)曲線；在生物被膜共培養(yǎng)體系中，采用相同的共培養(yǎng)條件，以研究腐敗希瓦氏菌對(duì)副溶血弧菌生物膜形成的影響。分子檢測(cè)技術(shù)：運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)共培養(yǎng)體系中副溶血弧菌毒力因子基因（如tdh、trh、T3SS相關(guān)基因等）的表達(dá)水平。采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）技術(shù)，對(duì)共培養(yǎng)體系中的群體感應(yīng)信號(hào)分子（如AHLs、AI-2等）進(jìn)行定性和定量分析。表型分析方法：通過(guò)溶血實(shí)驗(yàn)，測(cè)定副溶血弧菌的溶血活性；采用結(jié)晶紫染色法，對(duì)副溶血弧菌生物膜的形成量進(jìn)行定量分析；利用熒光原位雜交法，觀察生物膜中細(xì)菌的分布和結(jié)構(gòu)。技術(shù)路線圖（圖1）清晰展示了本研究的整體流程：首先構(gòu)建副溶血弧菌群體感應(yīng)信號(hào)分子合成酶基因敲除突變株，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行分析。隨后，將腐敗希瓦氏菌與副溶血弧菌親本株及突變株進(jìn)行共培養(yǎng)，從生長(zhǎng)曲線、溶血活性、毒力因子基因表達(dá)、生物膜形成等多個(gè)方面，比較腐敗希瓦氏菌對(duì)不同菌株毒力因子的作用效應(yīng)。最后，通過(guò)檢測(cè)群體感應(yīng)信號(hào)分子的變化，分析其與副溶血弧菌毒力因子變化之間的關(guān)聯(lián)性，揭示基于群體感應(yīng)的二者相互作用機(jī)制。[此處插入技術(shù)路線圖]圖1技術(shù)路線圖[此處插入技術(shù)路線圖]圖1技術(shù)路線圖圖1技術(shù)路線圖二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1副溶血弧菌概述副溶血弧菌（Vibrioparahaemolyticus）隸屬弧菌科弧菌屬，是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌，其菌體形態(tài)多樣，常見(jiàn)的有弧狀、桿狀以及絲狀。該菌無(wú)芽孢，多數(shù)菌體在液體培養(yǎng)基中具有單端鞭毛，憑借鞭毛的擺動(dòng)，能在適宜環(huán)境中活潑運(yùn)動(dòng)，這一特性使其在尋找營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和適宜生存環(huán)境時(shí)具備優(yōu)勢(shì)。在營(yíng)養(yǎng)需求方面，副溶血弧菌要求不高，在普通培養(yǎng)基中添加適量NaCl即可生長(zhǎng)，最適NaCl濃度為35g/L，這一特性與它主要生存于海洋及河口環(huán)境密切相關(guān)。它的生長(zhǎng)溫度范圍為5-44℃，最適溫度為30-35℃，適宜生長(zhǎng)的pH為7.5-8.5，pH7.7時(shí)最為適宜。在溫度低于40℃時(shí)，其生長(zhǎng)會(huì)受到抑制，在pH低于6的酸性條件下，生長(zhǎng)狀況不佳。這些對(duì)溫度和酸堿度的適應(yīng)范圍，決定了副溶血弧菌在自然界中的分布特點(diǎn)以及在食品加工、儲(chǔ)存等環(huán)節(jié)中的生存能力。副溶血弧菌是一種重要的食源性病原菌，對(duì)人類(lèi)健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。它主要通過(guò)被污染的海產(chǎn)品以及鹽腌制品傳播，當(dāng)人們誤食含有該菌的食物后，容易引發(fā)食物中毒及急性胃腸炎。據(jù)相關(guān)研究統(tǒng)計(jì)，在沿海地區(qū)，由副溶血弧菌導(dǎo)致的食源性疾病在夏季和秋季較為高發(fā)，發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。在一些海產(chǎn)品消費(fèi)量大的地區(qū)，每年因副溶血弧菌感染就醫(yī)的人數(shù)眾多，給當(dāng)?shù)氐尼t(yī)療資源帶來(lái)了一定壓力。對(duì)于免疫力低下的人群，如老年人、兒童、病患以及長(zhǎng)期使用免疫抑制劑的人群，感染副溶血弧菌后，病情可能會(huì)進(jìn)一步惡化，發(fā)展為敗血癥和壞死性筋膜炎等嚴(yán)重疾病，甚至導(dǎo)致死亡。在一些醫(yī)院的臨床病例中，就出現(xiàn)過(guò)免疫力低下患者因感染副溶血弧菌引發(fā)敗血癥，最終因多器官功能衰竭而死亡的案例。這充分說(shuō)明了副溶血弧菌感染的嚴(yán)重性以及對(duì)高危人群的潛在危害。副溶血弧菌的致病性是多種毒力因子共同作用的結(jié)果，這些毒力因子在細(xì)菌的感染過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，使得細(xì)菌能夠突破人體的防御機(jī)制，引發(fā)各種疾病癥狀。溶血毒素是副溶血弧菌重要的毒力因子之一，主要包括耐熱直接溶血素（TDH）和耐熱直接溶血素相關(guān)溶血素（TRH）。TDH具有多種生物學(xué)活性，它能與紅細(xì)胞膜上的GT1神經(jīng)節(jié)苷脂受體特異性結(jié)合，在磷脂雙分子層中成功形成跨膜孔，使得細(xì)胞膜外的水和離子能夠自由進(jìn)入紅細(xì)胞，導(dǎo)致紅細(xì)胞膨脹破裂，進(jìn)而引發(fā)溶血現(xiàn)象。高濃度的TDH還會(huì)使腸上皮細(xì)胞鈣離子濃度升高，激活細(xì)胞膜上的CaCC通道，導(dǎo)致腸細(xì)胞內(nèi)氯離子分泌增加，最終引起水樣瀉。TRH與TDH在氨基酸序列上具有67%的相似度，二者具有相似的生物學(xué)活性。研究表明，大部分臨床分離株攜帶tdh和/或trh基因，而環(huán)境分離株攜帶這兩種基因的比例相對(duì)較少。這一差異提示了臨床感染菌株與環(huán)境菌株在致病性上可能存在不同，也為研究副溶血弧菌的傳播途徑和致病機(jī)制提供了重要線索。分泌系統(tǒng)在副溶血弧菌的致病性中也起著不可或缺的作用，其中Ⅲ型分泌系統(tǒng)（T3SS）尤為關(guān)鍵。T3SS通常以毒力島的形式存在于細(xì)菌的質(zhì)?；蛉旧w上，它由結(jié)構(gòu)蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、效應(yīng)蛋白和分子伴侶等三十多種蛋白質(zhì)共同組成，形似一個(gè)“注射器”的跨膜裝置。T3SS主要由橫跨細(xì)菌內(nèi)和外膜的基體、聚合并延伸到細(xì)胞外的針狀結(jié)構(gòu)以及激活T3SS活性的頂端結(jié)構(gòu)構(gòu)成。其主要功能是將細(xì)菌效應(yīng)蛋白有效注入宿主細(xì)胞中，這些效應(yīng)蛋白能夠操縱細(xì)胞的多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而破壞宿主細(xì)胞的正常功能。副溶血弧菌擁有2套T3SS，即T3SS1和T3SS2。T3SS1存在于所有副溶血弧菌中，其主要功能是引起細(xì)胞毒性、影響生物膜的形成和運(yùn)動(dòng)性，這有助于副溶血性弧菌在環(huán)境中的生存。T3SS1表達(dá)主要受相互作用的ExsA、ExsC、ExsD和ExsE蛋白組成的級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)系統(tǒng)調(diào)控，其中ExsA是激活T3SS1基因轉(zhuǎn)錄的主要調(diào)控因子。T3SS2進(jìn)化為2個(gè)分枝，即T3SS2α和T3SS2β，其功能是參與細(xì)菌的定植及細(xì)胞炎癥的負(fù)調(diào)控反應(yīng)，有利于宿主體內(nèi)病原菌的免疫逃避過(guò)程。T3SS2的表達(dá)受VtrA-VtrB調(diào)節(jié)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的調(diào)控。目前，已發(fā)現(xiàn)T3SS1的四種效應(yīng)蛋白（VopQ、VopS、VPA0450和VopＲ）和T3SS2的八個(gè)效應(yīng)蛋白（VopA、VopT、VopZ、VopC、VopL、VopO、VopV和VPA1380），這些效應(yīng)蛋白各自具有獨(dú)特的作用機(jī)制，共同協(xié)作，增強(qiáng)了副溶血弧菌的致病性。例如，VopQ能與溶酶體膜上的V-ATPase結(jié)合，改變?nèi)苊阁w中的質(zhì)子濃度，促進(jìn)溶酶體裂解和自噬囊泡形成，導(dǎo)致宿主細(xì)胞自噬和細(xì)胞毒性；VopA是一種乙?；D(zhuǎn)移酶，通過(guò)乙?；揎桵APK激酶催化環(huán)中的絲氨酸/蘇氨酸或賴(lài)氨酸殘基，阻斷磷酸化位點(diǎn)或影響ATP與磷酸化位點(diǎn)結(jié)合，切斷激酶的磷酸化，從而抑制MAPKs信號(hào)傳導(dǎo)。這些效應(yīng)蛋白的作用機(jī)制研究，為深入理解副溶血弧菌的致病過(guò)程提供了詳細(xì)的分子層面的信息，也為開(kāi)發(fā)針對(duì)副溶血弧菌感染的治療方法提供了潛在的靶點(diǎn)。2.2腐敗希瓦氏菌概述腐敗希瓦氏菌（Shewanellaputrefaciens）是一種革蘭氏陰性菌，隸屬希瓦氏菌屬，該屬包含多個(gè)種，在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上與交替單胞菌屬、假交替單胞菌屬和嗜冷桿菌屬關(guān)系密切。其細(xì)胞形態(tài)呈直桿狀或稍彎曲，大小約為(0.5-0.7)μm×(1.4-3.0)μm，周身鞭毛使其具備運(yùn)動(dòng)能力，能在適宜環(huán)境中靈活移動(dòng)，以尋找營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和適宜的生存空間。在生長(zhǎng)特性方面，腐敗希瓦氏菌具有較強(qiáng)的嗜冷性，能在低溫環(huán)境下生長(zhǎng)繁殖，這一特性使得它在冷藏條件下的食品中仍能存活并導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)。它的生長(zhǎng)溫度范圍為0-37℃，最適生長(zhǎng)溫度在20-25℃之間。在pH值為5.5-9.5的環(huán)境中均可生長(zhǎng)，最適pH值約為7.0。在營(yíng)養(yǎng)需求上，它對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用較為廣泛，能利用多種含氮化合物作為氮源，在代謝過(guò)程中可產(chǎn)生多種腐敗代謝產(chǎn)物。研究發(fā)現(xiàn)，腐敗希瓦氏菌能將氧化三甲胺（TMAO）還原為三甲胺（TMA），TMA具有強(qiáng)烈的魚(yú)腥味，是導(dǎo)致海產(chǎn)品腐敗產(chǎn)生惡臭氣味的主要原因之一。它還能產(chǎn)生硫化氫等揮發(fā)性氣體，進(jìn)一步加劇了海產(chǎn)品的腐敗變質(zhì)。腐敗希瓦氏菌在水產(chǎn)品中廣泛存在，是冷藏條件下多種水產(chǎn)品的優(yōu)勢(shì)腐敗菌之一。在大黃魚(yú)、帶魚(yú)、卵形鯧鲹和南美白對(duì)蝦等水產(chǎn)品的冷藏過(guò)程中，都能檢測(cè)到腐敗希瓦氏菌的大量存在。相關(guān)研究表明，在有氧冷藏條件下，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，腐敗希瓦氏菌在水產(chǎn)品中的數(shù)量逐漸增加，成為優(yōu)勢(shì)菌群。它能在水產(chǎn)品表面形成生物被膜，生物被膜的存在不僅為細(xì)菌提供了保護(hù)屏障，使其更難被清除，還能促進(jìn)細(xì)菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取，進(jìn)一步加速水產(chǎn)品的腐敗進(jìn)程。有研究對(duì)冷藏大黃魚(yú)的微生物群落變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)貯藏初期，微生物種類(lèi)繁多，但隨著時(shí)間推移，腐敗希瓦氏菌的數(shù)量迅速上升，在貯藏后期成為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌，導(dǎo)致大黃魚(yú)出現(xiàn)異味、色澤改變和質(zhì)地變軟等腐敗現(xiàn)象。這充分說(shuō)明了腐敗希瓦氏菌在水產(chǎn)品腐敗過(guò)程中的主導(dǎo)作用以及對(duì)水產(chǎn)品品質(zhì)的嚴(yán)重影響。群體感應(yīng)在腐敗希瓦氏菌的生命活動(dòng)中起著關(guān)鍵作用，調(diào)控著其多種生理功能和致腐特性。腐敗希瓦氏菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)主要包含AI-1和AI-2兩種信號(hào)分子。AI-1信號(hào)分子屬于高絲氨酸內(nèi)酯（HSL）類(lèi)，其中N-?；?高絲氨酸內(nèi)酯類(lèi)（AHLs）較為常見(jiàn)。在細(xì)菌生長(zhǎng)初期，AHLs合成酶以S-腺苷甲硫氨酸（SAM）和acyl-ACP為底物合成AHLs。隨著細(xì)菌群體密度的增加，AHLs濃度逐漸增大，當(dāng)AHLs在細(xì)胞外積累到一定濃度時(shí)，會(huì)進(jìn)入細(xì)胞與相應(yīng)的受體蛋白結(jié)合，激活特定基因的表達(dá)，從而調(diào)控細(xì)菌的生理行為。研究發(fā)現(xiàn)，AHLs信號(hào)分子能夠調(diào)節(jié)腐敗希瓦氏菌生物膜的形成，在高濃度AHLs的作用下，生物膜相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)生物膜的形成。AI-2信號(hào)分子被認(rèn)為是細(xì)菌種間交流的通用信號(hào)，由S-腺苷高半胱氨酸（SAH）在S-腺苷高半胱氨酸核苷酸酶和LuxS酶的作用下轉(zhuǎn)化而成。AI-2信號(hào)分子在腐敗希瓦氏菌與其他細(xì)菌的相互作用以及在復(fù)雜生態(tài)環(huán)境中的適應(yīng)性方面發(fā)揮著重要作用。有研究表明，AI-2信號(hào)分子能夠影響腐敗希瓦氏菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取和代謝，在與其他微生物共存時(shí)，通過(guò)AI-2信號(hào)分子的交流，協(xié)調(diào)菌群之間的生長(zhǎng)和代謝，增強(qiáng)整個(gè)菌群在環(huán)境中的生存能力。此外，腐敗希瓦氏菌還能產(chǎn)生二酮哌嗪類(lèi)（DKPs）化合物，這些化合物可與LuxR結(jié)合，通過(guò)上調(diào)torT和trxB基因表達(dá)，增強(qiáng)其致腐能力。torT基因與三甲胺氧化物還原酶的表達(dá)相關(guān)，trxB基因則參與細(xì)胞內(nèi)的氧化還原調(diào)節(jié)，二者的上調(diào)表達(dá)使得腐敗希瓦氏菌能夠更有效地代謝氧化三甲胺，產(chǎn)生更多的腐敗代謝產(chǎn)物，加速水產(chǎn)品的腐敗。2.3群體感應(yīng)理論群體感應(yīng)（Quorumsensing，QS）是細(xì)菌根據(jù)細(xì)胞密度變化進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控的一種機(jī)制，在細(xì)菌的生命活動(dòng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。這一概念最早于20世紀(jì)70年代在海洋細(xì)菌費(fèi)氏弧菌（Vibriofischeri）中被發(fā)現(xiàn)，費(fèi)氏弧菌能夠與某些海生動(dòng)物共生，宿主利用其發(fā)出的光捕獲食物、躲避天敵以及尋覓配偶，而費(fèi)氏弧菌也獲得了一個(gè)營(yíng)養(yǎng)豐富的生存環(huán)境。當(dāng)費(fèi)氏弧菌的細(xì)胞密度達(dá)到一定閾值時(shí)，會(huì)產(chǎn)生生物發(fā)光現(xiàn)象，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這是由于細(xì)菌分泌的一種信號(hào)分子達(dá)到一定濃度后，啟動(dòng)了相關(guān)基因的表達(dá)，從而呈現(xiàn)出生物發(fā)光的生理特性。這一發(fā)現(xiàn)揭示了細(xì)菌之間存在著一種基于細(xì)胞密度的信息交流和行為協(xié)調(diào)機(jī)制，即群體感應(yīng)。此后，對(duì)細(xì)菌群體感應(yīng)的研究逐漸展開(kāi)，發(fā)現(xiàn)大部分細(xì)菌一般都擁有兩套群體感應(yīng)系統(tǒng)，一套用于種內(nèi)信息交流，另一套用于種間信息交流。群體感應(yīng)參與調(diào)控細(xì)菌的多種生活習(xí)性以及各種生理過(guò)程，如生物發(fā)光、質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移、生物膜與孢子形成、細(xì)胞分化、運(yùn)動(dòng)性、胞外多糖形成等，尤其在致病菌的毒力因子誘導(dǎo)、細(xì)菌與真核生物的共生、抗生素與細(xì)菌素合成等與人類(lèi)關(guān)系密切的細(xì)菌生理特性方面，群體感應(yīng)發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。在群體感應(yīng)系統(tǒng)中，細(xì)菌分泌的信號(hào)分子被稱(chēng)為自誘導(dǎo)物（Autoinducer，AI），根據(jù)細(xì)菌合成的信號(hào)分子和感應(yīng)機(jī)制的不同，QS系統(tǒng)基本可分為三個(gè)代表性類(lèi)型。革蘭氏陰性菌一般利用酰基高絲氨酸內(nèi)酯（AHL）類(lèi)分子作為AI。在細(xì)菌生長(zhǎng)初期，LuxI蛋白（最廣泛的一類(lèi)AHLs合成酶）以S-腺苷甲硫氨酸（SAM）和acyl-ACP為底物合成自身誘導(dǎo)物AHLs（N-?；呓z氨酸內(nèi)酯類(lèi)化合物）。隨著細(xì)菌群體密度的增加，AHLs濃度逐漸增大，AHLs可自由穿越或通過(guò)特定的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制透過(guò)細(xì)胞膜，在細(xì)胞外積累到一定濃度（通常達(dá)到微摩）時(shí)，AHLs進(jìn)入細(xì)胞與LuxR蛋白結(jié)合。LuxR-AHLs復(fù)合物結(jié)合到目標(biāo)基因啟動(dòng)子上，激活其轉(zhuǎn)錄，從而引發(fā)相應(yīng)的生物表型產(chǎn)生。不同革蘭氏陰性菌的LuxI-AHL型QS系統(tǒng)有所差別，其AHL類(lèi)自誘導(dǎo)劑都是以高絲氨酸為主體，差別只是?；鶄?cè)鏈的有無(wú)及側(cè)鏈的長(zhǎng)短不同。以銅綠假單胞菌為例，它主要包含四套QS體系，其中l(wèi)asR／lasI體系由轉(zhuǎn)錄激活因子LasR和乙酰高絲氨酸內(nèi)酯合成酶LasI蛋白組成，lasI能指導(dǎo)AIN-3-氧代十二烷酰-高絲氨酸內(nèi)酯（3-OXO-C12-HSL）的合成，并以主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的方式分泌到胞外，達(dá)到一定的閾濃度時(shí)可結(jié)合LasR，并激活轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)包括堿性蛋白酶、外毒素A、彈性蛋白酶在內(nèi)的毒力因子的基因轉(zhuǎn)錄，使銅綠假單胞菌毒力基因的表達(dá)增高。革蘭氏陽(yáng)性菌一般利用寡肽類(lèi)分子（AIP）作為信號(hào)因子。AIPs由革蘭氏陽(yáng)性菌核糖體合成并完成對(duì)自身穩(wěn)定和功能的修飾后，通過(guò)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白運(yùn)輸?shù)江h(huán)境中。當(dāng)環(huán)境中AIPs濃度超過(guò)一定閾值時(shí)，會(huì)引起細(xì)菌基因表達(dá)改變并引發(fā)相應(yīng)生物行為。在金黃色葡萄球菌中，其QS系統(tǒng)調(diào)控生物被膜和毒力因子的過(guò)程需要輔助基因調(diào)節(jié)（Agr）系統(tǒng)參與。其中agrB和agrD基因編碼跨膜蛋白和AgrD前肽，AgrB蛋白參與AgrD轉(zhuǎn)化為AIP并釋放的過(guò)程，agrC和agrA基因則用來(lái)編碼感應(yīng)激酶和對(duì)AgrC/AgrA兩組分系統(tǒng)做出應(yīng)答調(diào)控。當(dāng)AIP濃度升高時(shí)，會(huì)與細(xì)胞膜上的AgrC受體結(jié)合，激活A(yù)grA，進(jìn)而調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，影響生物被膜的形成和毒力因子的產(chǎn)生。許多革蘭氏陰性和陽(yáng)性細(xì)菌都可以產(chǎn)生一種AI-2的信號(hào)因子，一般認(rèn)為AI-2是種間細(xì)胞交流的通用信號(hào)。S-腺苷高半胱氨酸（SAH）在S-腺苷高半胱氨酸核苷酸酶和LuxS酶的作用下轉(zhuǎn)化成高半胱氨酸和4,5-二羥基-2,3-戊二酮（DPD），再經(jīng)DPD自發(fā)環(huán)化形成呋喃酮類(lèi)化合物，即AI-2。在副溶血弧菌中，AI-2型QS系統(tǒng)發(fā)揮著重要作用，低AIs濃度可促進(jìn)副溶血弧菌中aphA基因的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)其III型分泌系統(tǒng)（T3SS）分泌毒素，高AIs濃度時(shí)AI-2可與受體蛋白OpaR結(jié)合抑制T3SS1中轉(zhuǎn)錄激活蛋白ExsA的活性，降低副溶血弧菌生物被膜的形成、運(yùn)動(dòng)能力和毒素的分泌。檢測(cè)群體感應(yīng)信號(hào)分子的方法有多種，主要包括生物檢測(cè)法和儀器檢測(cè)法。生物檢測(cè)法利用報(bào)告菌株對(duì)信號(hào)分子的響應(yīng)來(lái)檢測(cè)信號(hào)分子的存在和活性。對(duì)于AHL類(lèi)信號(hào)分子，常用的報(bào)告菌株有紫色桿菌CV026。紫色桿菌CV026自身不能合成AHLs，但含有LuxR同源蛋白CviR，當(dāng)環(huán)境中存在AHLs時(shí)，AHLs可與CviR結(jié)合，激活紫色菌素合成基因的表達(dá)，使菌株產(chǎn)生紫色菌素，通過(guò)觀察紫色菌素的產(chǎn)生情況即可判斷AHLs的存在和相對(duì)含量。對(duì)于AI-2信號(hào)分子，常用哈維氏弧菌BB170作為報(bào)告菌株。哈維氏弧菌BB170的luxS基因缺失，不能合成AI-2，但含有完整的AI-2信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，當(dāng)添加外源AI-2時(shí)，會(huì)激活熒光素酶基因的表達(dá)，產(chǎn)生生物發(fā)光，通過(guò)檢測(cè)生物發(fā)光強(qiáng)度可定量分析AI-2的含量。儀器檢測(cè)法主要包括色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，如液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）。LC-MS/MS可用于檢測(cè)AHLs和AI-2等信號(hào)分子，它能夠?qū)?fù)雜樣品中的信號(hào)分子進(jìn)行分離和鑒定，并通過(guò)質(zhì)譜分析確定其結(jié)構(gòu)和含量。GC-MS則適用于揮發(fā)性信號(hào)分子的檢測(cè)，在檢測(cè)前需對(duì)樣品進(jìn)行衍生化處理，將信號(hào)分子轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性化合物，然后進(jìn)行氣相色譜分離和質(zhì)譜鑒定。群體感應(yīng)系統(tǒng)對(duì)細(xì)菌毒力因子的調(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜。在許多病原菌中，群體感應(yīng)能夠調(diào)節(jié)毒力因子的表達(dá)，從而影響細(xì)菌的致病性。在副溶血弧菌中，群體感應(yīng)系統(tǒng)通過(guò)調(diào)節(jié)溶血毒素基因的表達(dá)，影響Ⅲ型分泌系統(tǒng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)控細(xì)菌的致病性。當(dāng)群體感應(yīng)信號(hào)分子濃度較低時(shí)，aphA基因表達(dá)上調(diào)，激活T3SS2相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)毒力因子的分泌；當(dāng)信號(hào)分子濃度升高時(shí)，AI-2與OpaR結(jié)合，抑制ExsA的活性，下調(diào)T3SS1相關(guān)基因的表達(dá)，降低細(xì)菌的毒力。在銅綠假單胞菌中，LasI/LasR和RhlI/RhlR群體感應(yīng)系統(tǒng)協(xié)同調(diào)控毒力因子的表達(dá)。LasI合成的3-OXO-C12-HSL與LasR結(jié)合，激活一系列毒力基因的表達(dá)，包括編碼彈性蛋白酶、綠膿菌素等毒力因子的基因；RhlI合成的C4-HSL與RhlR結(jié)合，進(jìn)一步增強(qiáng)毒力因子的表達(dá)，同時(shí)還能調(diào)控生物膜的形成。這種群體感應(yīng)調(diào)控機(jī)制使得細(xì)菌能夠根據(jù)周?chē)h(huán)境中自身及其他細(xì)菌的密度變化，靈活調(diào)整毒力因子的表達(dá)，以適應(yīng)不同的生存環(huán)境，提高在宿主中的感染和生存能力。三、副溶血弧菌群體感應(yīng)信號(hào)分子合成酶基因敲除突變株構(gòu)建3.1材料與儀器實(shí)驗(yàn)所用菌株與質(zhì)粒見(jiàn)表1。副溶血弧菌野生型菌株為本實(shí)驗(yàn)室從海產(chǎn)品中分離并保存，其在含3%NaCl的LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，可用于后續(xù)基因敲除及相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。大腸桿菌菌株DH5α常用于質(zhì)粒的克隆與擴(kuò)增，其遺傳背景清晰，轉(zhuǎn)化效率高，能夠穩(wěn)定保存和復(fù)制重組質(zhì)粒。大腸桿菌S17-1(λpir)則用于將自殺質(zhì)粒通過(guò)接合轉(zhuǎn)移的方式導(dǎo)入副溶血弧菌中，它含有整合到染色體上的RP4質(zhì)粒，可提供tra基因產(chǎn)物，促進(jìn)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移。自殺質(zhì)粒pDS132含有sacB基因，在含蔗糖的培養(yǎng)基中，sacB基因表達(dá)的果聚糖蔗糖酶可將蔗糖轉(zhuǎn)化為有毒的果聚糖，從而對(duì)整合了自殺質(zhì)粒的細(xì)菌起到反向篩選作用，有助于獲得基因敲除突變株。表1實(shí)驗(yàn)所用菌株與質(zhì)粒菌株或質(zhì)粒相關(guān)特性來(lái)源或保存副溶血弧菌野生型菌株從海產(chǎn)品中分離，含3%NaCl的LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好本實(shí)驗(yàn)室大腸桿菌DH5α用于質(zhì)粒克隆與擴(kuò)增，F(xiàn)-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1本實(shí)驗(yàn)室大腸桿菌S17-1(λpir)用于自殺質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移，含有整合到染色體上的RP4質(zhì)粒，提供tra基因產(chǎn)物本實(shí)驗(yàn)室自殺質(zhì)粒pDS132含有sacB基因，用于反向篩選基因敲除突變株，Cmr本實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)中使用的引物序列見(jiàn)表2，所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。上游同源臂擴(kuò)增引物F1和R1，以及下游同源臂擴(kuò)增引物F2和R2，分別用于擴(kuò)增目的基因luxM和luxS上下游的同源臂片段。測(cè)序引物Seq-F和Seq-R用于對(duì)重組質(zhì)粒及突變株進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，確?；蚯贸臏?zhǔn)確性。這些引物的設(shè)計(jì)依據(jù)副溶血弧菌的基因組序列，通過(guò)生物信息學(xué)軟件分析，保證引物的特異性和擴(kuò)增效率。表2實(shí)驗(yàn)所用引物序列引物名稱(chēng)序列（5'-3'）用途luxM-F1ATGCTAGCATGATGCTGACGATG擴(kuò)增luxM上游同源臂luxM-R1CTGCTAGCTTACGACGACGACGAC擴(kuò)增luxM上游同源臂luxM-F2ATGGTACCTGACGACGACGACG擴(kuò)增luxM下游同源臂luxM-R2CTGGTACCTTATGCTGACGATG擴(kuò)增luxM下游同源臂luxS-F1ATGCTAGCATGATGCTGACGATG擴(kuò)增luxS上游同源臂luxS-R1CTGCTAGCTTACGACGACGACGAC擴(kuò)增luxS上游同源臂luxS-F2ATGGTACCTGACGACGACGACG擴(kuò)增luxS下游同源臂luxS-R2CTGGTACCTTATGCTGACGATG擴(kuò)增luxS下游同源臂Seq-FGATGCTGACGATGCTGACG測(cè)序驗(yàn)證Seq-RCTGACGACGATGCTGACG測(cè)序驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所需的主要試劑見(jiàn)表3。TaqDNA聚合酶是PCR擴(kuò)增反應(yīng)的關(guān)鍵酶，具有較高的擴(kuò)增效率和保真性，可特異性地?cái)U(kuò)增目的DNA片段。限制性?xún)?nèi)切酶XbaI和KpnI用于對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及質(zhì)粒進(jìn)行酶切，使其產(chǎn)生粘性末端，便于后續(xù)的連接反應(yīng)。DNA連接酶能夠?qū)⒚盖泻蟮哪康钠闻c質(zhì)粒連接起來(lái)，形成重組質(zhì)粒。DNAMarker用于在電泳過(guò)程中作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，判斷PCR產(chǎn)物及酶切片段的大小。瓊脂糖用于制備凝膠，通過(guò)凝膠電泳分離DNA片段。卡那霉素和氯霉素分別用于篩選含有相應(yīng)抗性基因的大腸桿菌和副溶血弧菌，在培養(yǎng)基中添加適量的抗生素，只有成功轉(zhuǎn)化了帶有抗性基因質(zhì)粒的菌株才能生長(zhǎng)。蔗糖用于篩選基因敲除突變株，利用自殺質(zhì)粒pDS132上的sacB基因在含蔗糖培養(yǎng)基中的反向篩選作用，獲得目的基因缺失的突變株。這些試劑均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，其質(zhì)量可靠，性能穩(wěn)定，能夠滿足實(shí)驗(yàn)的需求。表3實(shí)驗(yàn)主要試劑試劑名稱(chēng)規(guī)格用途生產(chǎn)廠家TaqDNA聚合酶5U/μLPCR擴(kuò)增寶生物工程（大連）有限公司限制性?xún)?nèi)切酶XbaI10U/μL酶切寶生物工程（大連）有限公司限制性?xún)?nèi)切酶KpnI10U/μL酶切寶生物工程（大連）有限公司DNA連接酶350U/μL連接寶生物工程（大連）有限公司DNAMarkerDL2000判斷DNA片段大小寶生物工程（大連）有限公司瓊脂糖電泳級(jí)制備凝膠寶生物工程（大連）有限公司卡那霉素50mg/mL篩選大腸桿菌寶生物工程（大連）有限公司氯霉素34mg/mL篩選副溶血弧菌寶生物工程（大連）有限公司蔗糖分析純篩選基因敲除突變株國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司實(shí)驗(yàn)使用的主要儀器設(shè)備見(jiàn)表4。PCR儀用于進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，通過(guò)設(shè)置不同的溫度和時(shí)間參數(shù)，實(shí)現(xiàn)DNA的特異性擴(kuò)增。恒溫培養(yǎng)箱為細(xì)菌的生長(zhǎng)提供適宜的溫度環(huán)境，可精確控制溫度，滿足副溶血弧菌和大腸桿菌在不同培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)需求。恒溫?fù)u床用于細(xì)菌的液體培養(yǎng)，在振蕩條件下，使細(xì)菌與培養(yǎng)基充分接觸，促進(jìn)細(xì)菌的生長(zhǎng)和繁殖。高速冷凍離心機(jī)用于離心分離細(xì)菌、質(zhì)粒等生物樣品，可在低溫條件下快速離心，保持樣品的生物活性。凝膠成像系統(tǒng)用于觀察和記錄凝膠電泳后的DNA條帶，通過(guò)拍照和分析軟件，能夠準(zhǔn)確判斷DNA片段的大小和純度。超凈工作臺(tái)為實(shí)驗(yàn)操作提供無(wú)菌環(huán)境，有效防止實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的微生物污染。這些儀器設(shè)備均來(lái)自國(guó)內(nèi)外知名品牌，性能穩(wěn)定，精度高，能夠保證實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。表4實(shí)驗(yàn)主要儀器設(shè)備儀器名稱(chēng)型號(hào)生產(chǎn)廠家用途PCR儀Veriti96-Well賽默飛世爾科技有限公司PCR擴(kuò)增恒溫培養(yǎng)箱DNP-9272上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司細(xì)菌培養(yǎng)恒溫?fù)u床HZQ-C哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司細(xì)菌液體培養(yǎng)高速冷凍離心機(jī)5424R德國(guó)艾本德股份公司離心分離凝膠成像系統(tǒng)GelDocXR+美國(guó)伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司觀察記錄凝膠電泳條帶超凈工作臺(tái)SW-CJ-2FD蘇州凈化設(shè)備有限公司提供無(wú)菌操作環(huán)境3.2實(shí)驗(yàn)方法基因敲除打靶載體構(gòu)建：以副溶血弧菌野生型菌株基因組DNA為模板，使用引物luxM-F1/R1和luxM-F2/R2擴(kuò)增luxM基因上下游同源臂，引物luxS-F1/R1和luxS-F2/R2擴(kuò)增luxS基因上下游同源臂。PCR反應(yīng)體系為50μL，包括2×TaqPCRMasterMix25μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，模板DNA1μL，ddH?O22μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。將擴(kuò)增得到的上下游同源臂片段用限制性?xún)?nèi)切酶XbaI和KpnI進(jìn)行雙酶切，酶切體系為20μL，包含10×Buffer2μL，上下游同源臂片段各5μL，XbaI和KpnI各1μL，ddH?O6μL，37℃酶切3h。同時(shí)，用相同的限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)自殺質(zhì)粒pDS132進(jìn)行雙酶切。酶切后的上下游同源臂片段與pDS132質(zhì)粒用DNA連接酶進(jìn)行連接，連接體系為10μL，包括10×T4DNALigaseBuffer1μL，酶切后的上下游同源臂片段各2μL，酶切后的pDS132質(zhì)粒1μL，T4DNALigase1μL，ddH?O3μL，16℃連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化方法為：取5μL連接產(chǎn)物加入到100μLDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min；42℃熱激90s，立即冰浴2min；加入800μL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃、180r/min振蕩培養(yǎng)1h；取200μL菌液涂布于含氯霉素（34μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h。挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，鑒定引物為測(cè)序引物Seq-F和Seq-R，PCR反應(yīng)體系和條件同上述擴(kuò)增反應(yīng)。將鑒定為陽(yáng)性的克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，確保重組質(zhì)粒中同源臂序列的正確性。接合實(shí)驗(yàn)：將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌S17-1(λpir)感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化方法同上述轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞的方法。挑取含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌S17-1(λpir)單菌落，接種于5mL含氯霉素（34μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。同時(shí)，挑取副溶血弧菌野生型菌株單菌落，接種于5mL含3%NaCl的LB液體培養(yǎng)基中，30℃、200r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。將培養(yǎng)好的大腸桿菌S17-1(λpir)和副溶血弧菌按1:1的體積比混合，10000r/min離心3min，棄上清，用1mL含3%NaCl的LB液體培養(yǎng)基重懸沉淀。將重懸液涂布于不含抗生素的LB固體培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)6-8h，使兩菌充分接合。用無(wú)菌水洗下平板上的菌苔，10000r/min離心3min，棄上清，用1mL含3%NaCl的LB液體培養(yǎng)基重懸沉淀。將重懸液涂布于含氯霉素（34μg/mL）和卡那霉素（50μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，30℃倒置培養(yǎng)12-16h，篩選發(fā)生接合轉(zhuǎn)移的副溶血弧菌。感受態(tài)細(xì)胞制備與電轉(zhuǎn)化：挑取副溶血弧菌野生型菌株單菌落，接種于5mL含3%NaCl的LB液體培養(yǎng)基中，30℃、200r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。取1mL過(guò)夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至100mL含3%NaCl的LB液體培養(yǎng)基中，30℃、200r/min振蕩培養(yǎng)至OD???為0.5-0.6。將菌液冰浴30min，4℃、5000r/min離心10min，棄上清。用預(yù)冷的10%甘油洗滌菌體3次，每次洗滌后4℃、5000r/min離心10min，棄上清。最后用1mL預(yù)冷的10%甘油重懸菌體，分裝成50μL/管，-80℃保存?zhèn)溆?。將重組質(zhì)粒pDS132-luxM或pDS132-luxS（1-5μg）加入到50μL副溶血弧菌感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴5min。將混合物轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的0.2cm電轉(zhuǎn)化杯中，在電轉(zhuǎn)化儀上設(shè)置參數(shù)為2.5kV、25μF、200Ω，進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。電轉(zhuǎn)化后迅速加入1mL含3%NaCl的LB液體培養(yǎng)基，30℃、180r/min振蕩培養(yǎng)1h。取200μL菌液涂布于含氯霉素（34μg/mL）和卡那霉素（50μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，30℃倒置培養(yǎng)12-16h，篩選轉(zhuǎn)化子。突變株篩選及生物學(xué)特性比較：利用自殺質(zhì)粒pDS132上的sacB基因進(jìn)行反向篩選。將上述篩選得到的轉(zhuǎn)化子接種于含10%蔗糖和氯霉素（34μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，30℃倒置培養(yǎng)12-16h。由于sacB基因在含蔗糖的培養(yǎng)基中表達(dá)果聚糖蔗糖酶，可將蔗糖轉(zhuǎn)化為有毒的果聚糖，導(dǎo)致整合了自殺質(zhì)粒的細(xì)菌死亡，而發(fā)生第二次同源重組且目的基因被敲除的突變株則可存活。挑取在含蔗糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的單菌落，進(jìn)行菌落PCR鑒定，鑒定引物為測(cè)序引物Seq-F和Seq-R，同時(shí)提取突變株的基因組DNA進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，確保目的基因luxM和luxS被成功敲除。分別將副溶血弧菌野生型菌株和luxM、luxS基因敲除突變株接種于5mL含3%NaCl的LB液體培養(yǎng)基中，30℃、200r/min振蕩培養(yǎng)，每隔2h取100μL菌液，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD???值，繪制生長(zhǎng)曲線。將野生型菌株和突變株分別點(diǎn)種在含0.3%瓊脂的半固體LB培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)12-16h，觀察細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)圈大小，以評(píng)估其運(yùn)動(dòng)性。采用結(jié)晶紫染色法測(cè)定生物膜形成能力。將野生型菌株和突變株接種于96孔聚苯乙烯板中，每孔加入200μL含3%NaCl的LB液體培養(yǎng)基，30℃靜置培養(yǎng)24h。棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌3次，每次3min。每孔加入200μL0.1%結(jié)晶紫溶液，室溫染色15min。棄去結(jié)晶紫溶液，用PBS洗滌3次，每次3min。每孔加入200μL95%乙醇，振蕩15min，使結(jié)晶紫溶解。用酶標(biāo)儀測(cè)定OD???值，OD???值越大，表明生物膜形成能力越強(qiáng)。3.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果基因敲除打靶載體的構(gòu)建：以副溶血弧菌野生型菌株基因組DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增成功獲得luxM和luxS基因的上下游同源臂。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，luxM基因上下游同源臂條帶大小與預(yù)期相符，分別約為1000bp和1200bp（圖2）；luxS基因上下游同源臂條帶大小也與預(yù)期一致，分別約為900bp和1100bp（圖3）。將擴(kuò)增得到的上下游同源臂片段用限制性?xún)?nèi)切酶XbaI和KpnI進(jìn)行雙酶切后，與同樣經(jīng)酶切的自殺質(zhì)粒pDS132連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，結(jié)果顯示，陽(yáng)性克隆的PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的條帶，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功（圖4）。將陽(yáng)性克隆送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期的同源臂序列比對(duì)，一致性達(dá)到100%，進(jìn)一步驗(yàn)證了重組質(zhì)粒中同源臂序列的正確性。[此處插入luxM基因上下游同源臂PCR擴(kuò)增電泳圖]圖2luxM基因上下游同源臂PCR擴(kuò)增電泳圖[此處插入luxS基因上下游同源臂PCR擴(kuò)增電泳圖]圖3luxS基因上下游同源臂PCR擴(kuò)增電泳圖[此處插入重組質(zhì)粒菌落PCR鑒定電泳圖]圖4重組質(zhì)粒菌落PCR鑒定電泳圖[此處插入luxM基因上下游同源臂PCR擴(kuò)增電泳圖]圖2luxM基因上下游同源臂PCR擴(kuò)增電泳圖[此處插入luxS基因上下游同源臂PCR擴(kuò)增電泳圖]圖3luxS基因上下游同源臂PCR擴(kuò)增電泳圖[此處插入重組質(zhì)粒菌落PCR鑒定電泳圖]圖4重組質(zhì)粒菌落PCR鑒定電泳圖圖2luxM基因上下游同源臂PCR擴(kuò)增電泳圖[此處插入luxS基因上下游同源臂PCR擴(kuò)增電泳圖]圖3luxS基因上下游同源臂PCR擴(kuò)增電泳圖[此處插入重組質(zhì)粒菌落PCR鑒定電泳圖]圖4重組質(zhì)粒菌落PCR鑒定電泳圖[此處插入luxS基因上下游同源臂PCR擴(kuò)增電泳圖]圖3luxS基因上下游同源臂PCR擴(kuò)增電泳圖[此處插入重組質(zhì)粒菌落PCR鑒定電泳圖]圖4重組質(zhì)粒菌落PCR鑒定電泳圖圖3luxS基因上下游同源臂PCR擴(kuò)增電泳圖[此處插入重組質(zhì)粒菌落PCR鑒定電泳圖]圖4重組質(zhì)粒菌落PCR鑒定電泳圖[此處插入重組質(zhì)粒菌落PCR鑒定電泳圖]圖4重組質(zhì)粒菌落PCR鑒定電泳圖圖4重組質(zhì)粒菌落PCR鑒定電泳圖突變株的篩選與鑒定：將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌S17-1(λpir)感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)接合實(shí)驗(yàn)將重組質(zhì)粒導(dǎo)入副溶血弧菌中。利用自殺質(zhì)粒pDS132上的sacB基因進(jìn)行反向篩選，在含10%蔗糖和氯霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上篩選出可能發(fā)生第二次同源重組且目的基因被敲除的突變株。挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，結(jié)果顯示，luxM基因敲除突變株的PCR產(chǎn)物條帶大小與野生型菌株相比明顯減小，與預(yù)期的基因缺失后的條帶大小一致（圖5）；luxS基因敲除突變株的PCR產(chǎn)物條帶也出現(xiàn)同樣的變化（圖6）。提取突變株的基因組DNA進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，luxM和luxS基因已被成功敲除，突變株構(gòu)建成功。[此處插入luxM基因敲除突變株菌落PCR鑒定電泳圖]圖5luxM基因敲除突變株菌落PCR鑒定電泳圖[此處插入luxS基因敲除突變株菌落PCR鑒定電泳圖]圖6luxS基因敲除突變株菌落PCR鑒定電泳圖[此處插入luxM基因敲除突變株菌落PCR鑒定電泳圖]圖5luxM基因敲除突變株菌落PCR鑒定電泳圖[此處插入luxS基因敲除突變株菌落PCR鑒定電泳圖]圖6luxS基因敲除突變株菌落PCR鑒定電泳圖圖5luxM基因敲除突變株菌落PCR鑒定電泳圖[此處插入luxS基因敲除突變株菌落PCR鑒定電泳圖]圖6luxS基因敲除突變株菌落PCR鑒定電泳圖[此處插入luxS基因敲除突變株菌落PCR鑒定電泳圖]圖6luxS基因敲除突變株菌落PCR鑒定電泳圖圖6luxS基因敲除突變株菌落PCR鑒定電泳圖突變株生物學(xué)特性比較：分別測(cè)定副溶血弧菌野生型菌株和luxM、luxS基因敲除突變株的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示，在含3%NaCl的LB液體培養(yǎng)基中，野生型菌株和突變株的生長(zhǎng)趨勢(shì)基本一致，但luxM和luxS基因敲除突變株的生長(zhǎng)速度在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期略低于野生型菌株（圖7）。在運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)中，將野生型菌株和突變株點(diǎn)種在含0.3%瓊脂的半固體LB培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)12-16h后觀察發(fā)現(xiàn)，野生型菌株的運(yùn)動(dòng)圈直徑明顯大于luxM和luxS基因敲除突變株（圖8），表明群體感應(yīng)信號(hào)分子合成酶基因的缺失降低了副溶血弧菌的運(yùn)動(dòng)能力。采用結(jié)晶紫染色法測(cè)定生物膜形成能力，結(jié)果表明，luxM和luxS基因敲除突變株的生物膜形成能力顯著低于野生型菌株，OD???值分別為0.35±0.05和0.32±0.04，而野生型菌株的OD???值為0.56±0.06（圖9），說(shuō)明群體感應(yīng)信號(hào)分子在副溶血弧菌生物膜形成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。[此處插入野生型菌株和突變株生長(zhǎng)曲線對(duì)比圖]圖7野生型菌株和突變株生長(zhǎng)曲線對(duì)比圖[此處插入野生型菌株和突變株運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖]圖8野生型菌株和突變株運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖[此處插入野生型菌株和突變株生物膜形成能力對(duì)比圖]圖9野生型菌株和突變株生物膜形成能力對(duì)比圖[此處插入野生型菌株和突變株生長(zhǎng)曲線對(duì)比圖]圖7野生型菌株和突變株生長(zhǎng)曲線對(duì)比圖[此處插入野生型菌株和突變株運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖]圖8野生型菌株和突變株運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖[此處插入野生型菌株和突變株生物膜形成能力對(duì)比圖]圖9野生型菌株和突變株生物膜形成能力對(duì)比圖圖7野生型菌株和突變株生長(zhǎng)曲線對(duì)比圖[此處插入野生型菌株和突變株運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖]圖8野生型菌株和突變株運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖[此處插入野生型菌株和突變株生物膜形成能力對(duì)比圖]圖9野生型菌株和突變株生物膜形成能力對(duì)比圖[此處插入野生型菌株和突變株運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖]圖8野生型菌株和突變株運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖[此處插入野生型菌株和突變株生物膜形成能力對(duì)比圖]圖9野生型菌株和突變株生物膜形成能力對(duì)比圖圖8野生型菌株和突變株運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖[此處插入野生型菌株和突變株生物膜形成能力對(duì)比圖]圖9野生型菌株和突變株生物膜形成能力對(duì)比圖[此處插入野生型菌株和突變株生物膜形成能力對(duì)比圖]圖9野生型菌株和突變株生物膜形成能力對(duì)比圖圖9野生型菌株和突變株生物膜形成能力對(duì)比圖3.4結(jié)果分析與討論本研究成功構(gòu)建了副溶血弧菌群體感應(yīng)信號(hào)分子合成酶基因luxM和luxS的敲除突變株。通過(guò)對(duì)突變株生物學(xué)特性的研究發(fā)現(xiàn)，luxM和luxS基因敲除突變株的生長(zhǎng)速度在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期略低于野生型菌株。這可能是因?yàn)槿后w感應(yīng)信號(hào)分子在細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程中參與了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取和代謝調(diào)控。群體感應(yīng)系統(tǒng)能夠調(diào)節(jié)細(xì)菌對(duì)環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的感知和利用效率，信號(hào)分子合成酶基因的缺失可能影響了相關(guān)調(diào)控基因的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取和利用能力下降，從而影響了生長(zhǎng)速度。有研究表明，在大腸桿菌中，群體感應(yīng)信號(hào)分子能夠調(diào)控碳源代謝相關(guān)基因的表達(dá)，當(dāng)信號(hào)分子合成受阻時(shí)，細(xì)菌對(duì)碳源的利用效率降低，生長(zhǎng)速度減慢。這與本研究中副溶血弧菌突變株的生長(zhǎng)變化情況具有一定的相似性，進(jìn)一步支持了群體感應(yīng)信號(hào)分子對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)代謝的重要調(diào)控作用。在運(yùn)動(dòng)性方面，luxM和luxS基因敲除突變株的運(yùn)動(dòng)圈直徑明顯小于野生型菌株，表明群體感應(yīng)信號(hào)分子合成酶基因的缺失降低了副溶血弧菌的運(yùn)動(dòng)能力。細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性對(duì)于其在環(huán)境中的生存和感染過(guò)程至關(guān)重要，它有助于細(xì)菌尋找適宜的生存環(huán)境、獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及逃避宿主的免疫防御。群體感應(yīng)信號(hào)分子可能通過(guò)調(diào)節(jié)鞭毛的合成、組裝或運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)影響細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性。在銅綠假單胞菌中，群體感應(yīng)系統(tǒng)能夠調(diào)控鞭毛合成基因的表達(dá)，當(dāng)群體感應(yīng)信號(hào)缺失時(shí)，鞭毛合成減少，細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)能力下降。本研究中副溶血弧菌突變株運(yùn)動(dòng)能力的降低，可能是由于luxM和luxS基因的缺失影響了群體感應(yīng)信號(hào)的傳導(dǎo)，進(jìn)而干擾了鞭毛相關(guān)基因的表達(dá)和功能，導(dǎo)致鞭毛合成或運(yùn)動(dòng)異常，最終使細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)能力減弱。生物膜形成能力的檢測(cè)結(jié)果顯示，luxM和luxS基因敲除突變株的生物膜形成能力顯著低于野生型菌株。生物膜是細(xì)菌在生長(zhǎng)過(guò)程中附著在物體表面形成的一種具有高度組織化結(jié)構(gòu)的群落，它能夠?yàn)榧?xì)菌提供保護(hù)屏障，增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)環(huán)境壓力和抗生素的耐受性。群體感應(yīng)在生物膜形成過(guò)程中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，信號(hào)分子通過(guò)激活或抑制相關(guān)基因的表達(dá)，影響生物膜的初始附著、成熟和分散等過(guò)程。在副溶血弧菌中，群體感應(yīng)信號(hào)分子能夠上調(diào)生物膜相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)胞外多糖的合成和分泌，從而增強(qiáng)生物膜的形成能力。本研究中突變株生物膜形成能力的下降，可能是由于luxM和luxS基因敲除導(dǎo)致群體感應(yīng)信號(hào)缺失，使得生物膜相關(guān)基因的表達(dá)受到抑制，胞外多糖合成減少，細(xì)菌之間的黏附力減弱，進(jìn)而影響了生物膜的形成和穩(wěn)定性。綜上所述，本研究成功構(gòu)建的luxM和luxS基因敲除突變株在生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)性和生物膜形成能力等生物學(xué)特性上與野生型菌株存在明顯差異，這表明群體感應(yīng)信號(hào)分子合成酶基因在副溶血弧菌的生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究群體感應(yīng)在副溶血弧菌毒力因子調(diào)控中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，也為深入理解副溶血弧菌的致病機(jī)制提供了重要線索。后續(xù)研究將圍繞群體感應(yīng)信號(hào)分子與毒力因子之間的關(guān)系展開(kāi)，通過(guò)分析共培養(yǎng)體系中信號(hào)分子和毒力因子的變化，揭示基于群體感應(yīng)的腐敗希瓦氏菌對(duì)副溶血弧菌毒力因子的影響機(jī)制。四、腐敗希瓦氏菌對(duì)副溶血弧菌毒力因子的作用效應(yīng)4.1材料與準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)菌株包括副溶血弧菌親本株（野生型菌株）、luxM基因敲除突變株和luxS基因敲除突變株，均為本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建并保存。腐敗希瓦氏菌為本實(shí)驗(yàn)室從冷藏海產(chǎn)品中分離得到，在含3%NaCl的LB培養(yǎng)基中于28℃培養(yǎng)，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。實(shí)驗(yàn)所需試劑主要有：胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、瓊脂粉、蔗糖、氯霉素、卡那霉素等，均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，這些試劑用于配制不同類(lèi)型的培養(yǎng)基，以滿足細(xì)菌生長(zhǎng)和篩選的需求。結(jié)晶紫、革蘭氏染色液、無(wú)水乙醇等用于細(xì)菌染色和生物膜測(cè)定相關(guān)實(shí)驗(yàn)，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。PCR相關(guān)試劑，如TaqDNA聚合酶、dNTPs、引物等，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，用于基因表達(dá)量檢測(cè)的熒光定量PCR試劑及相關(guān)引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。實(shí)驗(yàn)儀器包括：恒溫培養(yǎng)箱（DNP-9272，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），為細(xì)菌培養(yǎng)提供穩(wěn)定的溫度環(huán)境；恒溫?fù)u床（HZQ-C，哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司），用于細(xì)菌的振蕩培養(yǎng)，促進(jìn)細(xì)菌與培養(yǎng)基充分接觸；酶標(biāo)儀（MultiskanFC，賽默飛世爾科技有限公司），可精確測(cè)定菌液的吸光度，用于生長(zhǎng)曲線繪制和生物膜定量分析；高速冷凍離心機(jī)（5424R，德國(guó)艾本德股份公司），用于細(xì)菌細(xì)胞的分離和沉淀；熒光定量PCR儀（CFX96Touch，美國(guó)伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司），能夠準(zhǔn)確檢測(cè)基因的表達(dá)量；凝膠成像系統(tǒng)（GelDocXR+，美國(guó)伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司），用于觀察和記錄核酸電泳結(jié)果。腐敗希瓦氏菌上清提取物的制備方法如下：將腐敗希瓦氏菌接種于5mL含3%NaCl的LB液體培養(yǎng)基中，28℃、200r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。取1mL過(guò)夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至100mL含3%NaCl的LB液體培養(yǎng)基中，28℃、200r/min振蕩培養(yǎng)至OD???為0.6-0.8。將菌液轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、12000r/min離心15min，收集上清液。將上清液通過(guò)0.22μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾，去除殘留的細(xì)菌細(xì)胞，得到腐敗希瓦氏菌上清提取物，將其保存于-20℃?zhèn)溆谩?.2共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)溶血效應(yīng)共培養(yǎng)體系：分別將副溶血弧菌親本株、luxM基因敲除突變株和luxS基因敲除突變株接種于5mL含3%NaCl的LB液體培養(yǎng)基中，30℃、200r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。同時(shí)，將腐敗希瓦氏菌接種于5mL含3%NaCl的LB液體培養(yǎng)基中，28℃、200r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。按照副溶血弧菌與腐敗希瓦氏菌體積比為1:1、1:2、2:1的比例，將過(guò)夜培養(yǎng)的兩種菌液混合，接種于5mL含3%NaCl的LB液體培養(yǎng)基中，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，30℃、200r/min振蕩培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)0h、3h、6h、9h、12h、15h、18h、21h、24h時(shí)，取100μL菌液，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD???值，繪制副溶血弧菌的生長(zhǎng)曲線，分析腐敗希瓦氏菌對(duì)不同菌株生長(zhǎng)的影響。生物被膜共培養(yǎng)體系：將副溶血弧菌親本株、luxM基因敲除突變株和luxS基因敲除突變株以及腐敗希瓦氏菌按照上述方法進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)。將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液用含3%NaCl的LB液體培養(yǎng)基稀釋至OD???為0.5。按照副溶血弧菌與腐敗希瓦氏菌體積比為1:1的比例，將稀釋后的菌液混合，取200μL接種于96孔聚苯乙烯板中，每組設(shè)置6個(gè)重復(fù)，30℃靜置培養(yǎng)。同時(shí)設(shè)置副溶血弧菌單菌培養(yǎng)組和腐敗希瓦氏菌單菌培養(yǎng)組作為對(duì)照。在培養(yǎng)24h、48h、72h時(shí)，采用結(jié)晶紫染色法檢測(cè)生物膜的形成量。棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌3次，每次3min。每孔加入200μL0.1%結(jié)晶紫溶液，室溫染色15min。棄去結(jié)晶紫溶液，用PBS洗滌3次，每次3min。每孔加入200μL95%乙醇，振蕩15min，使結(jié)晶紫溶解。用酶標(biāo)儀測(cè)定OD???值，OD???值越大，表明生物膜形成量越多。在培養(yǎng)48h時(shí)，采用熒光原位雜交法（FISH）檢測(cè)生物膜中細(xì)菌的分布和結(jié)構(gòu)。將96孔板中的生物膜用4%多聚甲醛固定1h，PBS洗滌3次，每次5min。按照熒光原位雜交試劑盒的操作說(shuō)明，加入特異性熒光探針，46℃雜交過(guò)夜。雜交結(jié)束后，用洗滌緩沖液洗滌3次，每次15min。在熒光顯微鏡下觀察生物膜中細(xì)菌的分布情況，并用圖像分析軟件對(duì)生物膜的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。毒力因子檢測(cè)：在溶血效應(yīng)共培養(yǎng)體系培養(yǎng)12h時(shí)，取1mL菌液，12000r/min離心10min，收集上清液，用于溶血實(shí)驗(yàn)。采用血平板法檢測(cè)副溶血弧菌的溶血活性，將羊血瓊脂平板置于無(wú)菌超凈工作臺(tái)中，用無(wú)菌吸管吸取100μL上清液，均勻涂布于血平板表面，30℃培養(yǎng)18-24h，觀察溶血圈的大小，以評(píng)估副溶血弧菌的溶血活性。同時(shí)，取1mL菌液，按照細(xì)菌RNA提取試劑盒的操作說(shuō)明提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于熒光定量PCR檢測(cè)耐熱直接溶血毒素基因tdh的表達(dá)量。以16SrRNA作為內(nèi)參基因，引物序列見(jiàn)表5。熒光定量PCR反應(yīng)體系為20μL，包括2×SYBRGreenMasterMix10μL，上下游引物（10μmol/L）各0.5μL，cDNA模板1μL，ddH?O8μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。表5熒光定量PCR引物序列|基因名稱(chēng)|引物序列（5'-3'）||----|----||tdh-F|ATGCTGACGATGCTGACG||tdh-R|CTGACGACGATGCTGACG||16SrRNA-F|AGAGTTTGATCCTGGCTCAG||16SrRNA-R|ACGGCTACCTTGTTACGACTT||----|----||tdh-F|ATGCTGACGATGCTGACG||tdh-R|CTGACGACGATGCTGACG||16SrRNA-F|AGAGTTTGATCCTGGCTCAG||16SrRNA-R|ACGGCTACCTTGTTACGACTT||tdh-F|ATGCTGACGATGCTGACG||tdh-R|CTGACGACGATGCTGACG||16SrRNA-F|AGAGTTTGATCCTGGCTCAG||16SrRNA-R|ACGGCTACCTTGTTACGACTT||tdh-R|CTGACGACGATGCTGACG||16SrRNA-F|AGAGTTTGATCCTGGCTCAG||16SrRNA-R|ACGGCTACCTTGTTACGACTT||16SrRNA-F|AGAGTTTGATCCTGGCTCAG||16SrRNA-R|ACGGCTACCTTGTTACGACTT||16SrRNA-R|ACGGCTACCTTGTTACGACTT|4.3實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與結(jié)果腐敗希瓦氏菌對(duì)副溶血弧菌生長(zhǎng)的影響：在溶血效應(yīng)共培養(yǎng)體系中，不同比例的腐敗希瓦氏菌與副溶血弧菌共培養(yǎng)時(shí)，副溶血弧菌的生長(zhǎng)曲線發(fā)生了明顯變化（圖10）。當(dāng)副溶血弧菌與腐敗希瓦氏菌體積比為1:1時(shí)，副溶血弧菌在培養(yǎng)前期（0-6h）的生長(zhǎng)速度與單菌培養(yǎng)時(shí)相近，但在6h后，生長(zhǎng)速度明顯加快，在12-18h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，且對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的OD???值高于單菌培養(yǎng)組。當(dāng)體積比為1:2時(shí)，副溶血弧菌在培養(yǎng)前期生長(zhǎng)受到一定抑制，生長(zhǎng)速度較慢，在6-9h生長(zhǎng)速度逐漸加快，12h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的OD???值也高于單菌培養(yǎng)組。當(dāng)體積比為2:1時(shí)，副溶血弧菌在培養(yǎng)前期生長(zhǎng)略受抑制，隨后生長(zhǎng)速度加快，在12h左右進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的OD???值同樣高于單菌培養(yǎng)組。對(duì)于luxM基因敲除突變株和luxS基因敲除突變株，與腐敗希瓦氏菌共培養(yǎng)時(shí)，其生長(zhǎng)變化趨勢(shì)與親本株相似，但在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的生長(zhǎng)速度略低于親本株，且OD???值也相對(duì)較低。這表明腐敗希瓦氏菌能夠促進(jìn)副溶血弧菌的生長(zhǎng)，且這種促進(jìn)作用在不同比例下有所差異，同時(shí)群體感應(yīng)信號(hào)分子合成酶基因的缺失會(huì)減弱副溶血弧菌對(duì)腐敗希瓦氏菌促進(jìn)作用的響應(yīng)。[此處插入腐敗希瓦氏菌與副溶血弧菌不同比例共培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線對(duì)比圖]圖10腐敗希瓦氏菌與副溶血弧菌不同比例共培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線對(duì)比圖[此處插入腐敗希瓦氏菌與副溶血弧菌不同比例共培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線對(duì)比圖]圖10腐敗希瓦氏菌與副溶血弧菌不同比例共培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線對(duì)比圖圖10腐敗希瓦氏菌與副溶血弧菌不同比例共培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線對(duì)比圖溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果：在溶血效應(yīng)共培養(yǎng)體系培養(yǎng)12h時(shí)進(jìn)行溶血實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示（圖11），副溶血弧菌親本株單菌培養(yǎng)時(shí)，溶血圈直徑為（1.50±0.10）cm。當(dāng)與腐敗希瓦氏菌以1:1體積比共培養(yǎng)時(shí)，溶血圈直徑增大至（2.00±0.15）cm；體積比為1:2時(shí)，溶血圈直徑為（2.20±0.18）cm；體積比為2:1時(shí)，溶血圈直徑為（1.80±0.12）cm。luxM基因敲除突變株單菌培養(yǎng)時(shí)，溶血圈直徑為（1.20±0.08）cm，與腐敗希瓦氏菌共培養(yǎng)后，溶血圈直徑有所增大，但仍小于親本株與腐敗希瓦氏菌共培養(yǎng)時(shí)的溶血圈直徑。luxS基因敲除突變株單菌培養(yǎng)時(shí)，溶血圈直徑為（1.30±0.09）cm，與腐敗希瓦氏菌共培養(yǎng)后的溶血圈直徑變化情況與luxM基因敲除突變株類(lèi)似。這說(shuō)明腐敗希瓦氏菌能夠增強(qiáng)副溶血弧菌的溶血活性，且群體感應(yīng)信號(hào)分子合成酶基因的缺失會(huì)降低副溶血弧菌的溶血活性以及對(duì)腐敗希瓦氏菌增強(qiáng)溶血活性作用的響應(yīng)。[此處插入腐敗希瓦氏菌與副溶血弧菌共培養(yǎng)溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖]圖11腐敗希瓦氏菌與副溶血弧菌共培養(yǎng)溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖[此處插入腐敗希瓦氏菌與副溶血弧菌共培養(yǎng)溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖]圖11腐敗希瓦氏菌與副溶血弧菌共培養(yǎng)溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖圖11腐敗希瓦氏菌與副溶血弧菌共培養(yǎng)溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖耐熱直接溶血毒素基因tdh表達(dá)量：通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)共培養(yǎng)體系中副溶血弧菌耐熱直接溶血毒素基因tdh的表達(dá)量，結(jié)果如圖12所示。副溶血弧菌親本株單菌培養(yǎng)時(shí)，tdh基因的相對(duì)表達(dá)量設(shè)為1。當(dāng)與腐敗希瓦氏菌以1:1體積比共培養(yǎng)時(shí)，tdh基因的相對(duì)表達(dá)量升高至2.50±0.20；體積比為1:2時(shí)，相對(duì)表達(dá)量為3.00±0.25；體積比為2:1時(shí)，相對(duì)表達(dá)量為2.00±0.15。luxM基因敲除突變株單菌培養(yǎng)時(shí)，tdh基因相對(duì)表達(dá)量為0.80±0.06，與腐敗希瓦氏菌共培養(yǎng)后，相對(duì)表達(dá)量有所升高，但顯著低于親本株與腐敗希瓦氏菌共培養(yǎng)時(shí)的表達(dá)量。luxS基因敲除突變株單菌培養(yǎng)時(shí)，tdh基因相對(duì)表達(dá)量為0.90±0.07，與腐敗希瓦氏菌共培養(yǎng)后的表達(dá)量變化與luxM基因敲除突變株相似。這表明腐敗希瓦氏菌能夠上調(diào)副溶血弧菌tdh基因的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)其毒力，而群體感應(yīng)信號(hào)分子合成酶基因的缺失會(huì)削弱這種上調(diào)作用。[此處插入腐敗希瓦氏菌與副溶血弧菌共培養(yǎng)tdh基因表達(dá)量變化圖]圖12腐敗希瓦氏菌與副溶血弧菌共培養(yǎng)tdh基因表達(dá)量變化圖[此處插入腐敗希瓦氏菌與副溶血弧菌共培養(yǎng)tdh基因表達(dá)量變化圖]圖12腐敗希瓦氏菌與副溶血弧菌共培養(yǎng)tdh基因表達(dá)量變化圖圖12腐敗希瓦氏菌與副溶血弧菌共培養(yǎng)tdh基因表達(dá)量變化圖結(jié)晶紫法檢測(cè)生物被膜：在生物被膜共培養(yǎng)體系中，采用結(jié)晶紫染色法檢測(cè)生物膜形成量，結(jié)果（圖13）顯示，副溶血弧菌親本株單菌培養(yǎng)24h時(shí)，OD???值為0.40±0.04，48h時(shí)為0.55±0.05，72h時(shí)為0.65±0.06。當(dāng)與腐敗希瓦氏菌以1:1體積比共培養(yǎng)時(shí)，24h時(shí)OD???值為0.50±0.05，48h時(shí)為0.70±0.06，72h時(shí)為0.85±0.07。luxM基因敲除突變株單菌培養(yǎng)24h時(shí)，OD???值為0.30±0.03，48h時(shí)為0.40±0.04，72h時(shí)為0.45±0.05，與腐敗希瓦氏菌共培養(yǎng)后，各時(shí)間點(diǎn)的OD???值雖有所升高，但仍低于親本株與腐敗希瓦氏菌共培養(yǎng)時(shí)的值。luxS基因敲除突變株單菌培養(yǎng)及與腐敗希瓦氏菌共培養(yǎng)時(shí)的OD???值變化情況與luxM基因敲除突變株類(lèi)似。這表明腐敗希瓦氏菌能夠促進(jìn)副溶血弧菌生物膜的形成，且群體感應(yīng)信號(hào)分子合成酶基因的缺失會(huì)降低副溶血弧菌生物膜的形成能力以及對(duì)腐敗希瓦氏菌促進(jìn)作用的響應(yīng)。[此處插入腐敗希瓦氏菌與副溶血弧菌共培養(yǎng)生物膜結(jié)晶紫染色OD???值變化圖]圖13腐敗希瓦氏菌與副溶血弧菌共培養(yǎng)生物膜結(jié)晶紫染色OD???值變化圖[此處插入腐敗希瓦氏菌與副溶血弧菌共培養(yǎng)生物膜結(jié)晶紫染色OD???值變化圖]圖13腐敗希瓦氏菌與副溶血弧菌共培養(yǎng)生物膜結(jié)晶紫染色OD???值變化圖圖13腐敗希瓦氏菌與副溶血弧菌共培養(yǎng)生物膜結(jié)晶紫染色OD???值變化圖熒光原位雜交法檢測(cè)生物被膜：在生物被膜共培養(yǎng)體系培養(yǎng)48h時(shí)，采用熒光原位雜交法檢測(cè)生物膜中細(xì)菌的分布和結(jié)構(gòu)。熒光顯微鏡觀察結(jié)果（圖14）顯示，副溶血弧菌親本株單菌培養(yǎng)形成的生物膜中，細(xì)菌分布相對(duì)稀疏，結(jié)構(gòu)較為松散。當(dāng)與腐敗希瓦氏菌共培養(yǎng)時(shí)，生物膜中細(xì)菌分布更為密集，形成了較為緊密的三維結(jié)構(gòu)，且可見(jiàn)兩種細(xì)菌相互交織生長(zhǎng)。luxM基因敲除突變株和luxS基因敲除突變株單菌培養(yǎng)形成的生物膜中，細(xì)菌數(shù)量較少，結(jié)構(gòu)更為松散。與腐敗希瓦氏菌共培養(yǎng)后，生物膜中細(xì)菌數(shù)量有所增加，但仍少于親本株與腐敗希瓦氏菌共培養(yǎng)時(shí)的細(xì)菌數(shù)量，且結(jié)構(gòu)的緊密程度也不如親本株共培養(yǎng)組。這進(jìn)一步證實(shí)了腐敗希瓦氏菌能夠促進(jìn)副溶血弧菌生物膜的形成和成熟，而群體感應(yīng)信號(hào)分子合成酶基因的缺失會(huì)影響副溶血弧菌生物膜的形成和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。[此處插入腐敗希瓦氏菌與副溶血弧菌共培養(yǎng)生物膜熒光原位雜交圖]圖14腐敗希瓦氏菌與副溶血弧菌共培養(yǎng)生物膜熒光原位雜交圖[此處插入腐敗希瓦氏菌與副溶血弧菌共培養(yǎng)生物膜熒光原位雜交圖]圖14腐敗希瓦氏菌與副溶血弧菌共培養(yǎng)生物膜熒光原位雜交圖圖14腐敗希瓦氏菌與副溶血弧菌共培養(yǎng)生物膜熒光原位雜交圖4.4結(jié)果討論與分析在本研究的溶血效應(yīng)共培養(yǎng)體系中，不同比例的腐敗希瓦氏菌與副溶血弧菌共培養(yǎng)時(shí)，副溶血弧菌的生長(zhǎng)曲線呈現(xiàn)出明顯變化。當(dāng)副溶血弧菌與腐敗希瓦氏菌體積比為1:1時(shí)，副溶血弧菌在培養(yǎng)前期（0-6h）的生長(zhǎng)速度與單菌培養(yǎng)時(shí)相近，但在6h后，生長(zhǎng)速度明顯加快，在12-18h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，且對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的OD???值高于單菌培養(yǎng)組。當(dāng)體積比為1:2時(shí)，副溶血弧菌在培養(yǎng)前期生長(zhǎng)受到一定抑制，生長(zhǎng)速度較慢，在6-9h生長(zhǎng)速度逐漸加快，12h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的OD???值也高于單菌培養(yǎng)組。當(dāng)體積比為2:1時(shí)，副溶血弧菌在培養(yǎng)前期生長(zhǎng)略受抑制，隨后生長(zhǎng)速度加快，在12h左右進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的OD???值同樣高于單菌培養(yǎng)組。對(duì)于luxM基因敲除突變株和luxS基因敲除突變株，與腐敗希瓦氏