基于聚集誘導發(fā)光探針：開辟細胞染色質致密程度分析新路徑一、引言1.1研究背景與意義細胞染色質作為遺傳信息的載體，其結構和功能的研究一直是生物醫(yī)學領域的核心課題之一。染色質的基本結構單位是核小體，由DNA纏繞在組蛋白八聚體上形成，這些核小體通過連接DNA串聯(lián)在一起，進一步折疊和壓縮形成高度有序的染色質結構。染色質的致密程度在細胞的生理和病理過程中起著至關重要的作用。在細胞分裂過程中，染色質會經歷從松散到高度致密的轉變，以確保遺傳物質的準確分離和傳遞。而在基因表達調控方面，染色質的致密程度直接影響轉錄因子和RNA聚合酶等與DNA的結合能力，進而決定基因的表達水平。常染色質區(qū)域結構較為松散，基因易于轉錄；而異染色質區(qū)域結構致密，基因轉錄活性通常受到抑制。在生物醫(yī)學研究中，對細胞染色質致密程度的精確分析具有重要意義。在腫瘤研究領域，癌細胞的染色質結構常常發(fā)生異常改變，表現(xiàn)為染色質的過度濃縮或疏松。這些異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移以及對治療的響應密切相關。通過檢測染色質的致密程度，可以為腫瘤的早期診斷提供潛在的生物標志物，有助于實現(xiàn)腫瘤的早發(fā)現(xiàn)、早治療。例如，研究發(fā)現(xiàn)某些腫瘤細胞中異染色質的減少與癌基因的異常激活有關，檢測這些變化可以輔助腫瘤的診斷和預后評估。在神經退行性疾病研究中，如阿爾茨海默病和帕金森病，染色質的異常重塑被認為是導致神經元功能障礙和死亡的重要因素之一。深入了解染色質致密程度的變化機制，有助于揭示神經退行性疾病的發(fā)病機理，為開發(fā)有效的治療策略提供理論基礎。在干細胞研究中，染色質的狀態(tài)對于干細胞的自我更新和分化起著關鍵的調控作用。明確染色質致密程度與干細胞命運決定之間的關系，能夠為干細胞治療和再生醫(yī)學的發(fā)展提供重要的指導。傳統(tǒng)的細胞染色質致密程度分析方法存在諸多局限性。光學顯微鏡技術雖然能夠直觀地觀察染色質的形態(tài)，但分辨率較低，難以精確檢測染色質致密程度的細微變化。電子顯微鏡雖然具有較高的分辨率，但樣品制備過程復雜，對細胞結構有較大的損傷，且無法進行實時動態(tài)監(jiān)測。一些基于生化分析的方法，如染色質免疫沉淀測序（ChIP-seq）和微球菌核酸酶測序（MNase-seq），雖然能夠提供關于染色質結構的詳細信息，但需要大量的細胞樣本，操作繁瑣，不適用于單細胞水平的研究。聚集誘導發(fā)光（Aggregation-InducedEmission，AIE）現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)為細胞染色質致密程度分析提供了新的思路和方法。AIE是指某些熒光分子在溶液中表現(xiàn)出微弱的熒光，但在聚集狀態(tài)下熒光顯著增強的現(xiàn)象。與傳統(tǒng)的聚集誘導淬滅（Aggregation-CausedQuenching，ACQ）熒光分子相比，AIE熒光分子具有獨特的優(yōu)勢。AIE熒光分子在聚集狀態(tài)下能夠保持較高的熒光量子產率，避免了熒光淬滅的問題，從而可以實現(xiàn)高靈敏度的檢測。AIE熒光分子對環(huán)境的變化較為敏感，能夠通過熒光信號的變化反映周圍環(huán)境的物理和化學性質。AIE熒光分子還具有良好的光穩(wěn)定性和生物相容性，適合用于生物成像和細胞檢測等領域。將AIE探針應用于細胞染色質致密程度分析具有重要的研究意義和潛在的應用價值。AIE探針能夠與染色質特異性結合，通過熒光信號的變化準確反映染色質的致密程度。由于AIE探針具有高靈敏度和對環(huán)境敏感的特性，能夠檢測到染色質致密程度的微小變化，為細胞生理和病理過程的研究提供更精確的信息。AIE探針可以實現(xiàn)對活細胞染色質的實時動態(tài)監(jiān)測，有助于深入了解染色質結構在細胞周期、分化和疾病發(fā)生發(fā)展過程中的動態(tài)變化規(guī)律。AIE探針還可以與其他先進的成像技術，如熒光共振能量轉移（FRET）和多光子顯微鏡成像技術相結合，進一步拓展其在細胞染色質研究中的應用范圍，為揭示細胞生命活動的奧秘提供有力的工具。1.2國內外研究現(xiàn)狀在細胞染色質致密程度分析方法的研究方面，國內外取得了一系列重要進展。傳統(tǒng)的分析方法中，光學顯微鏡技術是最早用于觀察染色質形態(tài)和分布的手段之一。通過對染色質進行染色，如使用蘇木精-伊紅（H&E）染色等方法，能夠在光學顯微鏡下初步區(qū)分常染色質和異染色質。這種方法操作相對簡單、成本較低，但由于光學顯微鏡的分辨率限制，一般只能達到幾百納米，難以精確分辨染色質的細微結構和致密程度的微小變化。電子顯微鏡技術的出現(xiàn)極大地提高了染色質觀察的分辨率，能夠達到納米級別的分辨率，使得研究人員可以觀察到染色質的高級結構，如30納米纖維等。電子顯微鏡樣品制備過程復雜，需要對細胞進行固定、脫水、包埋等一系列處理，這些過程可能會對染色質的天然結構造成損傷，影響觀察結果的真實性。電子顯微鏡觀察通常是靜態(tài)的，難以對活細胞染色質的動態(tài)變化進行實時監(jiān)測。隨著分子生物學技術的發(fā)展，基于生化分析的染色質致密程度分析方法逐漸興起。染色質免疫沉淀測序（ChIP-seq）技術通過特異性抗體富集與特定蛋白結合的染色質區(qū)域，然后進行測序分析，從而獲得染色質上蛋白質結合位點的信息，間接反映染色質的結構和功能狀態(tài)。這種方法能夠提供全基因組范圍內的染色質信息，但需要大量的細胞樣本，操作繁瑣，實驗周期長，且對實驗技術要求較高。微球菌核酸酶測序（MNase-seq）利用微球菌核酸酶對染色質進行消化，根據(jù)消化后DNA片段的長度分布來推斷核小體的位置和間距，進而分析染色質的致密程度。MNase-seq同樣需要較多的細胞樣本，并且在實驗過程中可能會受到核酸酶消化不完全或過度消化等因素的影響，導致結果的準確性受到一定限制。在單細胞水平的染色質分析方面，轉座酶可及性測序（ATAC-seq）技術近年來得到了廣泛應用。該技術利用轉座酶能夠優(yōu)先結合到開放染色質區(qū)域的特性，將帶有測序接頭的轉座子插入到染色質的開放區(qū)域，然后通過測序分析來確定染色質的可及性區(qū)域。ATAC-seq可以在單細胞水平進行染色質分析，所需細胞數(shù)量少，能夠揭示單個細胞之間染色質狀態(tài)的差異，但該技術也存在一些局限性，如背景噪音較高、對實驗條件的要求較為嚴格等。聚集誘導發(fā)光（AIE）探針的研究和應用在國內外也受到了廣泛關注。自唐本忠院士團隊于2001年首次提出AIE概念以來，AIE材料在生物醫(yī)學領域的應用研究取得了迅猛發(fā)展。在生物成像方面，AIE探針已被成功應用于細胞質、細胞膜、線粒體、溶酶體等細胞內細胞器的成像研究。一些AIE探針通過與特定的細胞器靶向基團結合，能夠實現(xiàn)對線粒體的特異性成像，利用線粒體膜電位的差異，使AIE探針在線粒體內聚集并發(fā)出強烈熒光，從而清晰地顯示線粒體的形態(tài)和分布。這些研究充分展示了AIE探針在細胞成像中的高靈敏度和良好的光穩(wěn)定性等優(yōu)勢。在生物分子檢測方面，AIE探針也展現(xiàn)出了巨大的潛力。基于AIE分子設計的熒光傳感器能夠準確實現(xiàn)對各種離子（如F?、CN?、K?、Zn2?等）、有機小分子（如生物硫醇、硫化氫、小分子爆炸物等）以及生物大分子（如蛋白質、DNA、酶等）的檢測分析。通過熒光信號的變化，AIE探針可以對這些生物分子進行定性和定量分析，為生物醫(yī)學研究和臨床診斷提供了有力的工具。然而，將AIE探針應用于細胞染色質致密程度分析的研究仍處于起步階段，存在諸多不足與空白。目前，雖然已有一些關于AIE分子與DNA相互作用的研究報道，但對于AIE探針如何特異性地與染色質結合并準確反映其致密程度的機制尚未完全明確?，F(xiàn)有的AIE探針在染色質成像的分辨率和靈敏度方面還有待進一步提高，難以滿足對染色質細微結構和動態(tài)變化進行精確檢測的需求。在多參數(shù)成像和分析方面，如何將AIE探針與其他成像技術或分析方法相結合，實現(xiàn)對染色質致密程度以及其他相關參數(shù)的同時檢測和綜合分析，也是當前研究中亟待解決的問題。此外，AIE探針在體內應用的生物安全性和代謝機制等方面的研究還相對較少，這也限制了其在生物醫(yī)學領域的進一步應用和發(fā)展。1.3研究內容與創(chuàng)新點本研究旨在開發(fā)一種基于聚集誘導發(fā)光（AIE）探針的細胞染色質致密程度分析新方法，具體研究內容如下：新型AIE探針的設計與合成：通過分子結構設計，合成具有高靈敏度、高選擇性和良好生物相容性的AIE探針。引入特定的官能團，使其能夠與染色質中的特定成分，如DNA或組蛋白，發(fā)生特異性相互作用。利用有機合成化學方法，將具有AIE特性的熒光基團與靶向基團連接，構建出能夠精準識別染色質并反映其致密程度的AIE探針。通過改變分子結構中的共軛體系長度、取代基種類和位置等因素，優(yōu)化AIE探針的熒光性能，提高其對染色質致密程度變化的響應靈敏度。AIE探針與染色質相互作用機制研究：運用多種光譜技術，如熒光光譜、吸收光譜和圓二色光譜等，深入探究AIE探針與染色質的結合模式和作用機制。通過熒光滴定實驗，確定AIE探針與染色質的結合常數(shù)和結合位點，分析結合過程中的熒光變化規(guī)律，揭示AIE探針熒光信號與染色質致密程度之間的內在聯(lián)系。利用分子動力學模擬和量子化學計算等理論方法，從原子和分子層面深入研究AIE探針與染色質的相互作用機制，為探針的進一步優(yōu)化和應用提供理論依據(jù)?；贏IE探針的細胞染色質致密程度分析方法的建立：建立基于AIE探針的熒光成像和定量分析方法，實現(xiàn)對細胞染色質致密程度的精確檢測。優(yōu)化熒光成像條件，如激發(fā)光波長、發(fā)射光波長、曝光時間等，提高成像的分辨率和對比度，清晰地顯示染色質的分布和形態(tài)。結合圖像處理和數(shù)據(jù)分析技術，開發(fā)相應的軟件算法，實現(xiàn)對熒光圖像中染色質熒光強度的定量分析，準確評估染色質的致密程度。通過對不同細胞類型和生理狀態(tài)下的細胞進行染色質致密程度分析，驗證該方法的可靠性和通用性。AIE探針在生物醫(yī)學領域的應用研究：將所建立的方法應用于腫瘤細胞、干細胞等生物醫(yī)學相關細胞的研究，探索染色質致密程度變化與細胞生理和病理過程的關系。在腫瘤細胞研究中，分析不同腫瘤類型和不同分化程度的腫瘤細胞中染色質致密程度的差異，尋找與腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉移相關的染色質特征，為腫瘤的早期診斷和預后評估提供新的生物標志物和檢測方法。在干細胞研究中，研究干細胞分化過程中染色質致密程度的動態(tài)變化，揭示染色質狀態(tài)對干細胞命運決定的調控機制，為干細胞治療和再生醫(yī)學的發(fā)展提供理論支持。本研究的創(chuàng)新點主要體現(xiàn)在以下幾個方面：創(chuàng)新性地將AIE探針應用于細胞染色質致密程度分析：打破了傳統(tǒng)分析方法的局限性，利用AIE探針的獨特優(yōu)勢，實現(xiàn)了對染色質致密程度的高靈敏度、高分辨率檢測，為細胞染色質研究提供了全新的技術手段。與傳統(tǒng)的熒光探針相比，AIE探針在聚集狀態(tài)下熒光顯著增強，能夠有效避免熒光淬滅問題，提高檢測的靈敏度和準確性。AIE探針還具有良好的光穩(wěn)定性和生物相容性，適合用于活細胞成像和實時監(jiān)測。深入探究AIE探針與染色質的相互作用機制：從分子層面揭示了AIE探針熒光信號與染色質致密程度之間的內在聯(lián)系，為AIE探針的設計優(yōu)化和應用提供了堅實的理論基礎。通過多種光譜技術和理論計算方法的結合，全面深入地研究AIE探針與染色質的結合模式、結合位點和作用過程中的能量變化等，為進一步提高AIE探針的性能和應用效果提供了指導。建立了一套完整的基于AIE探針的細胞染色質致密程度分析新方法：該方法涵蓋了探針設計合成、相互作用機制研究、成像分析技術和生物醫(yī)學應用等多個方面，具有系統(tǒng)性和創(chuàng)新性。通過優(yōu)化熒光成像條件和數(shù)據(jù)分析算法，實現(xiàn)了對染色質致密程度的精確量化分析，為細胞生物學和生物醫(yī)學研究提供了一種高效、準確的分析工具。拓展了AIE探針在生物醫(yī)學領域的應用范圍：將AIE探針應用于腫瘤細胞和干細胞等研究，為腫瘤診斷、干細胞治療等領域提供了新的研究思路和方法，具有重要的潛在應用價值。通過分析染色質致密程度在腫瘤發(fā)生發(fā)展和干細胞分化過程中的變化規(guī)律，有望發(fā)現(xiàn)新的生物標志物和治療靶點，為相關疾病的診斷和治療提供新的策略。二、相關理論基礎2.1細胞染色質結構與功能2.1.1染色質的基本組成與結構層次染色質是指間期細胞核內由DNA、組蛋白、非組蛋白及少量RNA組成的線性復合結構，是間期細胞遺傳物質存在的形式，也是遺傳信息進行表達、遺傳物質進行復制的模板。其中，DNA是遺傳信息的攜帶者，它以雙螺旋結構為基礎，儲存著生物體的全部遺傳密碼。組蛋白是染色質的主要蛋白質成分，與DNA緊密結合，對染色質的結構和功能起著關鍵的支撐作用。組蛋白共有五種類型，分別為H1、H2A、H2B、H3和H4。其中，H2A、H2B、H3和H4各兩個分子組成一個八聚體核心，DNA雙螺旋分子纏繞在這個核心上1.75圈，形成核小體的核心顆粒。核小體的核心顆粒之間通過一段約60bp的連接DNA相連，H1組蛋白位于DNA進出核心顆粒的結合處，對維持核小體的結構穩(wěn)定性起著重要作用。這種由核小體組成的染色質纖維直徑約為10nm，是染色質的一級結構，又被稱為“串珠狀”結構。由核小體組成的10nm染色質纖維進一步螺旋盤繞，形成外徑約30nm、內徑10nm，螺距11nm的螺線管結構，即30nm纖維，這是染色質的二級結構。在30nm纖維中，每6個核小體組成一圈螺旋，H1組蛋白在其中起到了重要的穩(wěn)定作用，它可能參與了核小體之間的交聯(lián)和螺旋化過程，使得染色質纖維更加緊密和有序。30nm纖維再進一步折疊形成更高層次的染色質結構，這些結構包括染色質環(huán)、染色質袢等。在這個過程中，染色質結合蛋白如支架蛋白、凝聚蛋白等起到了關鍵作用，它們與DNA和組蛋白相互作用，介導染色質的折疊和組裝，形成復雜的三維結構。在細胞分裂期，染色質會進一步高度濃縮，形成染色體，此時染色質的結構變得更加緊密和有序，以確保遺傳物質在細胞分裂過程中的準確分離和傳遞。2.1.2染色質結構與基因表達的關系染色質結構對基因表達的調控是一個復雜而精細的過程，染色質的致密程度在其中起著關鍵作用。在常染色質區(qū)域，染色質結構較為松散，DNA易于與轉錄因子、RNA聚合酶等轉錄相關蛋白相互作用。這些轉錄相關蛋白能夠識別并結合到基因的啟動子區(qū)域，啟動基因的轉錄過程，使得基因得以表達。研究表明，在活躍轉錄的基因區(qū)域，染色質的30nm纖維結構會發(fā)生解聚，形成更為開放的結構，便于轉錄因子和RNA聚合酶的結合和作用，從而促進基因的轉錄。而異染色質區(qū)域的染色質結構則較為致密，DNA與組蛋白緊密結合，形成高度壓縮的結構。這種致密的結構限制了轉錄因子和RNA聚合酶等與DNA的接觸，使得基因的轉錄受到抑制，通常處于沉默狀態(tài)。異染色質區(qū)域的基因表達調控對于維持細胞的正常生理功能和發(fā)育過程具有重要意義。在胚胎發(fā)育過程中，某些基因在特定階段會被包裝到異染色質區(qū)域，從而抑制其表達，以確保胚胎發(fā)育的正常進程。染色質結構對基因表達的調控還與組蛋白修飾密切相關。組蛋白的修飾包括甲基化、乙?；?、磷酸化、泛素化等多種形式，這些修飾可以改變組蛋白與DNA之間的相互作用強度，以及染色質的高級結構，進而影響基因的表達。組蛋白乙?；ǔＥc染色質的松散狀態(tài)和基因的激活相關。乙?；揎椏梢灾泻徒M蛋白上的正電荷，減弱組蛋白與帶負電荷的DNA之間的靜電相互作用，使得染色質結構變得松散，有利于轉錄因子和RNA聚合酶的結合，從而促進基因的轉錄。相反，組蛋白甲基化修飾則較為復雜，不同位點和不同程度的甲基化可以產生不同的生物學效應，有些甲基化修飾與基因的激活相關，而有些則與基因的抑制相關。DNA甲基化也是一種重要的表觀遺傳修飾，它主要發(fā)生在CpG島區(qū)域。DNA甲基化可以招募甲基化結合蛋白，這些蛋白與染色質相互作用，導致染色質結構變得更加致密，從而抑制基因的轉錄。在腫瘤發(fā)生過程中，常常會出現(xiàn)某些抑癌基因的啟動子區(qū)域發(fā)生高甲基化，使得這些基因無法正常表達，進而失去對腫瘤細胞生長的抑制作用，促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。2.1.3細胞周期中染色質致密程度的動態(tài)變化在細胞周期中，染色質的致密程度呈現(xiàn)出明顯的動態(tài)變化，這種變化與細胞的生理活動密切相關，對細胞的正常分裂和遺傳信息的準確傳遞起著至關重要的作用。在細胞間期，包括G1期、S期和G2期，染色質處于相對松散的狀態(tài)，以便進行基因的轉錄和DNA的復制等重要生命活動。在G1期，細胞主要進行生長和代謝活動，此時染色質結構較為松散，基因表達活躍，細胞合成各種蛋白質和RNA，為后續(xù)的DNA復制做準備。進入S期，細胞開始進行DNA復制，染色質進一步解聚，以保證DNA聚合酶等復制相關蛋白能夠順利地與DNA模板結合，完成DNA的復制過程。在S期，染色質的解聚程度與DNA復制的起始、延伸和終止等過程密切相關，通過一系列的調控機制，確保DNA復制的準確性和高效性。在G2期，細胞繼續(xù)生長并合成蛋白質，同時對DNA復制過程中可能出現(xiàn)的錯誤進行修復。此時染色質仍然保持相對松散的狀態(tài)，基因表達持續(xù)進行，為細胞進入分裂期做好充分準備。研究發(fā)現(xiàn)，在G2期，一些與細胞分裂相關的基因開始表達，這些基因的產物參與了細胞分裂過程中的各種調控和執(zhí)行機制。當細胞進入分裂期（M期），染色質會經歷一系列復雜的變化，逐漸高度濃縮形成染色體。在前期，染色質開始逐漸凝聚，變得更加致密，形成可見的染色體結構。這一過程中，染色質結合蛋白如凝聚蛋白等發(fā)揮了重要作用，它們通過與染色質相互作用，促進染色質的折疊和壓縮，使得染色質逐漸轉變?yōu)楦叨扔行虻娜旧w。在中期，染色體達到最高程度的濃縮，排列在細胞赤道板上，此時染色體的形態(tài)和結構最為清晰，便于在顯微鏡下觀察和分析。在后期和末期，隨著細胞分裂的進行，染色體逐漸解聚，染色質又恢復到相對松散的狀態(tài)，分別進入兩個子細胞中，為子細胞的正常生理活動奠定基礎。細胞周期中染色質致密程度的動態(tài)變化是一個受到嚴格調控的過程，涉及到多種蛋白質、酶和信號通路的協(xié)同作用。這些調控機制確保了染色質在不同時期能夠呈現(xiàn)出合適的致密程度，以滿足細胞生理活動的需求，保證細胞的正常生長、分裂和遺傳信息的穩(wěn)定傳遞。如果染色質致密程度的動態(tài)變化出現(xiàn)異常，可能會導致細胞周期紊亂、基因表達異常，進而引發(fā)各種疾病，如腫瘤等。2.2聚集誘導發(fā)光（AIE）原理2.2.1AIE現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)與定義2001年，唐本忠院士團隊在研究中發(fā)現(xiàn)了一種與傳統(tǒng)熒光現(xiàn)象截然不同的奇特現(xiàn)象。他們觀察到硅雜環(huán)戊二烯（silole）衍生物在溶液狀態(tài)下幾乎不發(fā)光，然而當這些分子形成聚集態(tài)時，卻能發(fā)出強烈的熒光。以1-甲基-1,2,3,4,5-五苯基噻咯為例，在乙腈溶液中，它幾乎沒有熒光發(fā)射，但在含有大量不良溶劑水的乙腈溶液中，隨著分子的聚集，卻發(fā)出了很強的綠色熒光?；诖?，唐本忠院士團隊首次提出了“聚集誘導發(fā)光（Aggregation-InducedEmission，AIE）”的概念，用以描述這種分子在聚集狀態(tài)下熒光顯著增強的現(xiàn)象。這一發(fā)現(xiàn)打破了傳統(tǒng)的聚集誘導淬滅（ACQ）觀念，為熒光材料的研究開辟了全新的方向，引發(fā)了科學界的廣泛關注和深入研究。AIE現(xiàn)象的定義為：某些熒光分子在單分子分散的溶液狀態(tài)下，由于分子內的各種運動（如分子內旋轉、振動等）較為自由，激發(fā)態(tài)能量容易通過非輻射躍遷的方式耗散，導致熒光發(fā)射較弱；而當這些分子聚集在一起時，分子間的相互作用限制了分子內的運動，使得激發(fā)態(tài)能量更傾向于通過輻射躍遷的方式回到基態(tài)，從而發(fā)射出強烈的熒光。AIE現(xiàn)象的出現(xiàn)，為解決傳統(tǒng)熒光分子在聚集態(tài)下熒光淬滅的問題提供了新的思路和方法，使得熒光材料在固態(tài)或聚集態(tài)下的高效發(fā)光成為可能，極大地拓展了熒光材料的應用范圍。2.2.2AIE探針的發(fā)光機理分子內旋轉受限（RestrictedIntramolecularRotation，RIR）被認為是導致AIE現(xiàn)象的主要機理之一。以六苯基硅雜環(huán)戊二烯（HPS）為例，在純丙酮溶液中，HPS分子外圍的芳香族取代基通過可旋轉的單鍵與硅雜環(huán)戊二烯中心相連，這些芳香族取代基能夠繞單鍵自由旋轉。這種自由旋轉過程會消耗激發(fā)態(tài)能量，成為一種非輻射衰變渠道，使得分子的熒光發(fā)射減弱，此時HPS的熒光量子產率僅為0.22%。而在丙酮和水的混合溶劑中，隨著不良溶劑水的加入，HPS分子逐漸聚集形成納米粒子。在聚集狀態(tài)下，由于分子間的空間限制，芳香族取代基的分子內旋轉受到很大阻礙，上述非輻射衰變渠道被有效抑制。激發(fā)態(tài)分子無法通過分子內旋轉來耗散能量，只能通過輻射衰變的方式回到基態(tài)，從而使熒光顯著增強。當水含量達到99%時，HPS的熒光量子產率提高到56%，增大了255倍。通過一系列實驗可以進一步驗證分子內旋轉受限機理。Chen等研究了溫度對HPS溶液熒光的影響，發(fā)現(xiàn)隨著溫度降低，分子的熱運動減緩，分子內旋轉變得更加困難，HPS的THF溶液熒光強度顯著增加。這表明當分子內旋轉受到抑制時，熒光發(fā)射增強，符合RIR機理的預測。Chen等還研究了黏度對HPS溶液熒光的影響。在甲醇/甘油混合溶劑中，隨著甘油含量的增加，溶劑黏度增大，分子內旋轉受到的阻礙也增大。當甘油含量為0-50%時，熒光強度隨甘油含量呈線性上升；當甘油含量大于50%時，熒光強度以指數(shù)形式上升。這進一步證明了分子內旋轉受限與熒光增強之間的密切關系。Fan等測量了HPS薄膜在不同外加壓力下的熒光光譜，發(fā)現(xiàn)當壓力小于104atm時，隨著壓力的增大，分子間的距離減小，分子內旋轉受到更強的限制，熒光強度很快升高；當壓力繼續(xù)增大時，雖然熒光強度開始緩慢下降，但在壓力達到600atm時，熒光強度仍高于未受壓時的強度。這些實驗結果都有力地支持了分子內旋轉受限是AIE現(xiàn)象產生的重要機理。除了分子內旋轉受限，分子內共平面也是AIE現(xiàn)象的一個重要機理。在一些AIE分子中，當分子處于單分子狀態(tài)時，分子內的共軛結構可能由于單鍵的旋轉而處于非共平面狀態(tài)，這會降低分子的共軛程度，減少π電子的離域范圍，從而導致熒光較弱。而當分子聚集時，分子間的相互作用促使分子內的共軛結構趨于共平面，增大了共軛程度，使得π電子能夠在更大的范圍內離域，增強了分子的熒光發(fā)射。一些含有多苯環(huán)結構的AIE分子，在溶液中苯環(huán)之間可能存在一定的扭轉角度，共軛程度有限；但在聚集態(tài)下，苯環(huán)之間的扭轉角度減小，逐漸趨于共平面，從而使熒光增強。抑制光化學或光物理過程也可能導致AIE現(xiàn)象。在溶液中，熒光分子可能會發(fā)生一些光化學或光物理過程，如分子間的能量轉移、電子轉移、激基締合物的形成等，這些過程會消耗激發(fā)態(tài)能量，導致熒光淬滅。而在聚集狀態(tài)下，分子間的相對位置和取向發(fā)生改變，這些不利于熒光發(fā)射的光化學或光物理過程受到抑制，從而使熒光增強。一些AIE分子在溶液中容易形成激基締合物，激基締合物的熒光發(fā)射較弱；但在聚集態(tài)下，由于分子間的排列方式發(fā)生變化，激基締合物的形成受到抑制，熒光發(fā)射增強。非緊密堆積、形成J-聚集體以及形成特殊激基締合物等也被認為是可能導致AIE現(xiàn)象的原因，但具體情況因分子結構而異。對于每一個具有AIE性質的分子而言，AIE現(xiàn)象的形成往往是多種因素共同作用的結果，這些因素相互影響、相互制約，共同決定了分子在聚集態(tài)下的熒光發(fā)射特性。2.2.3AIE探針的特性與優(yōu)勢AIE探針具有高發(fā)光效率的特性，這是其區(qū)別于傳統(tǒng)ACQ熒光探針的顯著優(yōu)勢之一。在聚集態(tài)下，AIE探針由于分子內運動受限等機制，能夠有效地抑制非輻射躍遷過程，使得激發(fā)態(tài)能量更多地以熒光輻射的形式釋放出來，從而實現(xiàn)高發(fā)光效率。一些基于四苯乙烯（TPE）的AIE探針，在聚集狀態(tài)下的熒光量子產率可以達到80%以上，而傳統(tǒng)的ACQ熒光探針在聚集態(tài)下往往會發(fā)生嚴重的熒光淬滅，熒光量子產率極低。高發(fā)光效率使得AIE探針在熒光檢測和成像等應用中能夠產生更強的熒光信號，提高檢測的靈敏度和成像的清晰度，有助于檢測到低豐度的目標分子或觀察到細胞內的細微結構和動態(tài)變化。AIE探針的溶劑效應相對較小。傳統(tǒng)熒光探針的熒光性質常常會受到溶劑極性、黏度等因素的顯著影響，在不同的溶劑環(huán)境中，其熒光發(fā)射波長、強度和量子產率等參數(shù)可能會發(fā)生較大變化，這給實際應用帶來了諸多不便。而AIE探針由于其獨特的發(fā)光機理，在不同溶劑中，其分子內運動受限的程度變化相對較小，因此熒光性質受溶劑的影響也較小。以一種基于AIE分子的陽離子探針為例，在水、乙醇、二氯甲烷等不同極性的溶劑中，其熒光發(fā)射波長和強度的變化均在較小范圍內，能夠保持相對穩(wěn)定的熒光性能。這種較小的溶劑效應使得AIE探針在復雜的生物體系中能夠保持穩(wěn)定的熒光信號，減少了由于溶劑環(huán)境變化而導致的檢測誤差，提高了檢測結果的可靠性和準確性。AIE探針還具有良好的光穩(wěn)定性。在光照條件下，傳統(tǒng)熒光探針容易發(fā)生光漂白現(xiàn)象，即熒光分子在吸收光子后發(fā)生不可逆的結構變化，導致熒光強度逐漸減弱甚至消失，這限制了其在長時間成像和檢測等應用中的使用。而AIE探針由于分子結構的穩(wěn)定性以及聚集態(tài)下的特殊發(fā)光機制，能夠有效地抵抗光漂白作用。在連續(xù)光照下，AIE探針能夠保持較長時間的穩(wěn)定熒光發(fā)射，為長時間的細胞成像和動態(tài)監(jiān)測提供了有力保障。例如，在對活細胞進行長時間熒光成像時，AIE探針可以在數(shù)小時的光照過程中保持熒光強度基本不變，清晰地顯示細胞內的結構和活動變化，而傳統(tǒng)熒光探針往往在短時間光照后就會出現(xiàn)明顯的光漂白現(xiàn)象，無法滿足長時間成像的需求。AIE探針的生物相容性良好，這使得它們非常適合用于生物檢測和細胞成像等生物醫(yī)學領域。生物相容性是指材料與生物體之間相互作用時，不會對生物體產生明顯的毒性和不良反應，能夠保證生物體的正常生理功能。許多AIE探針通過合理的分子設計，引入了親水性基團或生物可降解的結構單元，使其能夠在生物體內穩(wěn)定存在，并且不會對細胞的生長、增殖和代謝等過程產生顯著影響。一些表面修飾有聚乙二醇（PEG）的AIE納米探針，PEG的親水性和生物相容性能夠有效地降低納米探針與生物分子之間的非特異性相互作用，減少對細胞的毒性，同時提高探針在生物體系中的分散性和穩(wěn)定性。將這些AIE探針用于細胞染色和成像時，能夠清晰地顯示細胞內的染色質結構，并且對細胞的正常生理功能沒有明顯干擾，為細胞生物學研究提供了一種安全、有效的工具。AIE探針的響應速度快也是其重要優(yōu)勢之一。在生物檢測中，能夠快速地對目標分子或生物事件做出響應是非常關鍵的。AIE探針與目標分子結合后，能夠迅速改變分子的聚集狀態(tài)或分子內運動狀態(tài)，從而導致熒光信號的快速變化?；贏IE探針設計的熒光傳感器，在檢測生物硫醇時，生物硫醇與AIE探針發(fā)生特異性反應，使得AIE探針的分子結構發(fā)生改變，聚集狀態(tài)也隨之變化，熒光信號在短時間內顯著增強，能夠實現(xiàn)對生物硫醇的快速檢測。這種快速的響應速度使得AIE探針在實時監(jiān)測生物分子動態(tài)變化和生物過程等方面具有巨大的應用潛力，能夠及時捕捉到生物體系中的微小變化，為生物學研究和臨床診斷提供及時、準確的信息。三、現(xiàn)有細胞染色質致密程度分析方法綜述3.1傳統(tǒng)分析方法概述3.1.1顯微鏡觀察法顯微鏡觀察法是研究細胞染色質致密程度的常用手段之一，主要包括光學顯微鏡觀察和電子顯微鏡觀察，它們在細胞染色質研究中發(fā)揮著重要作用，但也各自存在一定的局限性。光學顯微鏡觀察是一種較為基礎且應用廣泛的方法。在進行觀察時，首先需要對細胞進行固定和染色處理，以增強染色質與周圍背景的對比度，便于觀察。常用的染色方法有蘇木精-伊紅（H&E）染色、吉姆薩染色等。蘇木精能夠將細胞核中的染色質染成藍紫色，伊紅則將細胞質染成粉紅色，通過這種染色方式，可以在光學顯微鏡下初步區(qū)分常染色質和異染色質。常染色質呈淺染狀態(tài)，而異染色質由于結構較為致密，會被染成深染狀態(tài)。光學顯微鏡的分辨率通常在200納米左右，這一分辨率限制了其對染色質細微結構和致密程度微小變化的觀察能力。對于一些染色質結構的精細特征，如核小體的排列方式、染色質纖維的局部折疊情況等，光學顯微鏡難以提供清晰的圖像。光學顯微鏡觀察主要依賴于染色質的形態(tài)和顏色變化來判斷致密程度，這種判斷方式相對主觀，不同觀察者之間可能存在一定的判斷差異。電子顯微鏡觀察技術則為染色質研究帶來了更高的分辨率，能夠達到納米級別的分辨率，如透射電子顯微鏡（TEM）的分辨率可達0.1-0.2納米。在利用電子顯微鏡觀察染色質時，同樣需要對細胞進行一系列復雜的樣品制備過程，包括固定、脫水、包埋、切片等步驟。這些步驟旨在保持染色質的結構完整性，并使其能夠在電子顯微鏡下成像。通過電子顯微鏡，研究人員可以觀察到染色質的高級結構，如30納米纖維等，這些結構在光學顯微鏡下是難以分辨的。電子顯微鏡樣品制備過程對細胞結構有較大的損傷，可能會導致染色質的天然結構發(fā)生改變，從而影響觀察結果的真實性。電子顯微鏡觀察通常是靜態(tài)的，難以對活細胞染色質的動態(tài)變化進行實時監(jiān)測，這限制了其在研究染色質動態(tài)行為方面的應用。電子顯微鏡設備昂貴，操作復雜，需要專業(yè)的技術人員進行維護和操作，這也在一定程度上限制了其廣泛應用。3.1.2生化分析法生化分析法是一類重要的細胞染色質致密程度分析方法，其中核酸酶敏感性分析和染色質免疫沉淀等技術在染色質研究中具有廣泛的應用。核酸酶敏感性分析是基于染色質結構與核酸酶作用的差異來檢測染色質致密程度的方法。其原理是：在染色質中，處于開放狀態(tài)的常染色質區(qū)域由于結構較為松散，DNA更容易與核酸酶接觸，因此對核酸酶的敏感性較高；而異染色質區(qū)域結構致密，DNA被緊密包裹，對核酸酶的敏感性較低。以脫氧核糖核酸酶I（DNaseI）為例，它是一種核酸內切酶，可以對單鏈或雙鏈DNA進行非特異性的消化和切割。在實驗過程中，將細胞與DNaseI孵育，然后提取DNA并進行測序分析。通過比較不同區(qū)域DNA被酶切的程度，可以推斷染色質的致密程度。在常染色質區(qū)域，由于DNA對DNaseI敏感，會被切割成較短的片段；而異染色質區(qū)域的DNA由于對DNaseI不敏感，被切割的程度較低，片段相對較長。核酸酶敏感性分析能夠提供關于染色質開放狀態(tài)和致密程度的信息，但該方法需要使用大量的細胞樣本，且實驗操作較為復雜，對實驗條件的控制要求較高。核酸酶的消化程度可能受到多種因素的影響，如酶的濃度、消化時間、細胞生理狀態(tài)等，這些因素可能導致實驗結果的重復性和準確性受到一定限制。染色質免疫沉淀（ChromatinImmunoprecipitation，ChIP）技術則是通過特異性抗體富集與特定蛋白結合的染色質區(qū)域，從而間接反映染色質的結構和功能狀態(tài)，包括染色質的致密程度。該技術的基本原理是：在生理狀態(tài)下，用甲醛等交聯(lián)劑將細胞內的DNA與蛋白質交聯(lián)在一起，形成穩(wěn)定的DNA-蛋白質復合物。然后通過超聲或酶處理將染色質切為小片段，利用抗原抗體的特異性識別反應，將與目的蛋白相結合的DNA片段沉淀下來。對于與染色質致密程度相關的研究，可選擇與染色質結構蛋白（如組蛋白等）或參與染色質重塑的蛋白特異性結合的抗體。如果目的蛋白與致密染色質區(qū)域結合緊密，那么通過ChIP技術富集到的相應DNA片段就能夠反映該區(qū)域染色質的致密狀態(tài)。染色質免疫沉淀技術的操作流程較為繁瑣，需要經過細胞固定、染色質斷裂、免疫沉淀、交聯(lián)反應的逆轉、DNA的純化以及DNA的鑒定等多個步驟。具體來說，首先用甲醛處理細胞，使蛋白質-DNA復合物交聯(lián)固定；然后進行細胞裂解及超聲打斷，將染色質切成200-1000bp的小片段；接著加入特異性抗體，使其與靶蛋白-DNA復合物相互結合；再加入ProteinA/G結合抗體-靶蛋白-DNA復合物，沉淀復合物并清洗，除去非特異性結合蛋白；之后洗脫，得到富集的靶蛋白-DNA復合物，解交聯(lián)，純化富集的DNA片段；最后通過qPCR分析驗證或測序檢測。該技術需要高質量的特異性抗體，抗體的質量和特異性會直接影響實驗結果的準確性。染色質免疫沉淀技術通常需要大量的細胞樣本，對于一些難以獲取大量細胞的研究對象，應用受到限制。3.2傳統(tǒng)方法的局限性在細胞染色質致密程度分析領域，傳統(tǒng)方法雖然在過去的研究中發(fā)揮了重要作用，但隨著研究的深入，其局限性也日益凸顯，主要體現(xiàn)在靈敏度、特異性、對活細胞檢測的影響以及操作復雜性等方面。傳統(tǒng)方法的靈敏度相對較低，難以檢測到染色質致密程度的微小變化。以光學顯微鏡觀察法為例，由于其分辨率有限，通常只能達到200納米左右，對于染色質結構的細微改變，如核小體間距的微小變化、染色質纖維局部的折疊程度改變等，難以清晰分辨。在研究細胞分化過程中染色質致密程度的動態(tài)變化時，這些細微變化可能蘊含著重要的生物學信息，但光學顯微鏡卻無法準確捕捉，導致對細胞分化機制的研究受到限制。在研究腫瘤細胞與正常細胞染色質致密程度的差異時，腫瘤細胞染色質的一些早期微小變化可能是腫瘤發(fā)生的重要標志，但傳統(tǒng)光學顯微鏡由于靈敏度不足，難以發(fā)現(xiàn)這些細微差異，影響了腫瘤的早期診斷和治療。傳統(tǒng)方法的特異性也存在一定問題。一些生化分析法，如核酸酶敏感性分析，雖然可以根據(jù)染色質對核酸酶的敏感性來推斷其致密程度，但這種方法并非完全特異性地針對染色質致密程度。核酸酶的消化程度不僅受到染色質致密程度的影響，還可能受到DNA序列、染色質結合蛋白等多種因素的干擾。某些DNA序列本身可能對核酸酶具有較高的抗性，即使染色質結構較為松散，該區(qū)域的DNA也可能不易被核酸酶切割，從而導致對染色質致密程度的誤判。在使用脫氧核糖核酸酶I（DNaseI）進行核酸酶敏感性分析時，若細胞中存在一些能夠保護DNA免受DNaseI切割的蛋白質，就會干擾對染色質致密程度的準確判斷。傳統(tǒng)方法對活細胞檢測存在較大影響，難以實現(xiàn)對活細胞染色質致密程度的實時動態(tài)監(jiān)測。電子顯微鏡觀察需要對細胞進行固定、脫水、包埋、切片等復雜的樣品制備過程，這些操作會導致細胞死亡，無法觀察活細胞中染色質的動態(tài)變化。在研究細胞周期中染色質致密程度的變化時，由于電子顯微鏡無法對活細胞進行實時觀察，只能獲取細胞在某個固定時間點的靜態(tài)圖像，無法全面了解染色質在整個細胞周期中的動態(tài)變化過程。一些生化分析方法也需要對細胞進行裂解等處理，同樣無法實現(xiàn)對活細胞的檢測。傳統(tǒng)方法的操作通常較為復雜，需要專業(yè)的技術人員和昂貴的設備，限制了其廣泛應用。染色質免疫沉淀技術（ChIP），其操作流程繁瑣，包括細胞固定、染色質斷裂、免疫沉淀、交聯(lián)反應的逆轉、DNA的純化以及DNA的鑒定等多個步驟，每個步驟都需要嚴格控制實驗條件，否則容易導致實驗失敗或結果不準確。ChIP技術需要高質量的特異性抗體，而獲取這些抗體往往具有一定難度且成本較高。該技術還需要大量的細胞樣本，對于一些難以獲取大量細胞的研究對象，如珍稀的臨床樣本或少量的干細胞，應用受到極大限制。3.3新型分析技術的探索隨著科技的不斷進步，新型的細胞染色質致密程度分析技術不斷涌現(xiàn)，為該領域的研究帶來了新的機遇和挑戰(zhàn)?；跍y序技術的染色質可及性分析是近年來發(fā)展迅速的一類新型技術，其中轉座酶可及性測序（ATAC-seq）、脫氧核糖核酸酶I超敏位點測序（DNase-seq）和微球菌核酸酶測序（MNase-seq）等技術備受關注。轉座酶可及性測序（ATAC-seq）是一種利用轉座酶研究染色質可及性的高通量測序技術。其原理是利用轉座酶Tn5可切割開放染色質區(qū)域的特性，將攜帶已知DNA序列標簽的轉座復合物與細胞核一起孵育，轉座酶會將測序接頭插入到開放染色質區(qū)域，然后通過PCR擴增和測序，即可獲得開放染色質的區(qū)域信息。該技術具有諸多優(yōu)勢，它能夠在低至20個細胞的樣本中快速獲取調控的多維信息，非常適用于珍貴稀少的樣本。ATAC-seq無片段選擇性，可以同時獲得“開放”染色質的位置、轉錄因子的結合位點、核小體的調控區(qū)域和染色質狀態(tài)等信息。在研究胚胎發(fā)育過程中，利用ATAC-seq技術可以分析不同發(fā)育階段細胞染色質的可及性變化，揭示胚胎發(fā)育過程中基因表達調控的動態(tài)變化機制。脫氧核糖核酸酶I超敏位點測序（DNase-seq）是基于染色質上不同區(qū)域的DNA序列對DNaseI內切酶敏感性存在差異的原理發(fā)展而來。失去核小體保護的DNA序列相對于纏繞在核小體上的DNA序列更容易與DNaseI結合并被切割，這些對DNaseI高度敏感的基因組區(qū)域就稱為DNaseI超敏位點（DHSs），通常被認為是開放染色質區(qū)。將傳統(tǒng)DNaseI足跡法與下一代測序技術結合，能夠在全基因組范圍內識別與DNA相互作用的調控元件，從而反映染色質的開放狀態(tài)和致密程度。DNase-seq技術在研究基因表達調控方面具有重要作用，通過分析DHSs位點的分布和變化，可以了解轉錄因子等調控蛋白與染色質的結合情況，進而揭示基因表達調控的機制。微球菌核酸酶測序（MNase-seq）則是利用微球菌核酸酶（Micrococcalnuclease，MNase）對染色質進行消化。MNase是一種限制性外切酶，進行片段化處理時，將DNA切成缺口后，逐個切除寡核苷酸，直到獲得被核小體包裹或者被轉錄因子綁定的區(qū)域為止。通過MNase消化法和二代測序聯(lián)合使用，可以定性和定量地識別基因組范圍內的平均核小體占據(jù)率、定位以及染色質開放區(qū)域。在研究染色質結構與基因表達的關系時，MNase-seq技術可以幫助確定核小體在染色質上的分布情況，以及染色質開放區(qū)域與基因轉錄活性之間的關聯(lián)。盡管這些基于測序技術的染色質可及性分析方法為細胞染色質致密程度分析提供了強大的工具，但它們也面臨著一些挑戰(zhàn)。這類技術需要專業(yè)的測序設備和復雜的數(shù)據(jù)分析流程，對實驗人員的技術水平和數(shù)據(jù)分析能力要求較高。測序成本仍然相對較高，限制了其在一些資源有限的實驗室中的廣泛應用。在實驗過程中，樣本制備的質量對實驗結果的準確性影響較大，如細胞的裂解程度、轉座酶的活性、核酸酶的消化程度等因素都可能導致實驗結果的偏差。數(shù)據(jù)分析方面，由于測序數(shù)據(jù)量龐大，如何從海量的數(shù)據(jù)中準確地提取和分析與染色質致密程度相關的信息，也是一個亟待解決的問題。還需要進一步提高這些技術的分辨率和靈敏度，以更好地檢測染色質致密程度的微小變化和精細結構。四、基于聚集誘導發(fā)光探針的分析新方法設計4.1AIE探針的選擇與設計4.1.1適合細胞染色質分析的AIE探針篩選在細胞染色質分析中，AIE探針的選擇至關重要，需綜合考慮多個關鍵因素以篩選出最合適的探針。從發(fā)光波長角度來看，不同的細胞成像技術和分析需求對AIE探針的發(fā)光波長有不同要求。對于常規(guī)的熒光顯微鏡成像，可見光區(qū)域（400-760nm）的發(fā)光波長較為常用，此范圍內的AIE探針能與常見的熒光顯微鏡激發(fā)光源和濾光片系統(tǒng)相匹配，便于直接觀察和分析染色質的熒光信號。在一些需要深入研究細胞內部結構和功能的實驗中，如對細胞核內染色質進行高分辨率成像時，選擇在藍光（400-500nm）或綠光（500-560nm）區(qū)域發(fā)光的AIE探針，能利用其較短的波長和較高的分辨率，清晰地顯示染色質的細微結構。藍光激發(fā)的AIE探針可以用于觀察染色質的局部聚集狀態(tài)和分布情況，為研究染色質的高級結構提供重要信息。在近紅外光區(qū)域（760-1700nm）發(fā)光的AIE探針則具有獨特的優(yōu)勢。由于生物組織對近紅外光的吸收和散射較少，近紅外AIE探針能夠實現(xiàn)更深層次的組織穿透，減少背景熒光干擾，適用于活體成像和對深層組織中細胞染色質的分析。在研究腫瘤組織中染色質的變化時，近紅外AIE探針可以穿透腫瘤組織表面的多層細胞，直接對腫瘤內部的染色質進行成像和分析，為腫瘤的早期診斷和治療監(jiān)測提供更準確的信息。AIE探針的穩(wěn)定性也是篩選過程中不可忽視的因素。穩(wěn)定性主要包括化學穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性。化學穩(wěn)定性是指AIE探針在不同的化學環(huán)境中，如細胞內復雜的生理環(huán)境下，能夠保持其分子結構和熒光性能的穩(wěn)定。細胞內存在著各種生物分子、離子和酸堿環(huán)境，AIE探針需要在這些條件下不發(fā)生分解、水解或其他化學反應，以確保其能夠準確地與染色質結合并發(fā)出穩(wěn)定的熒光信號。一些含有特殊化學鍵或結構的AIE探針，如具有剛性骨架的分子結構，能夠增強其化學穩(wěn)定性，使其在細胞內環(huán)境中保持穩(wěn)定。光穩(wěn)定性則是指AIE探針在光照條件下，其熒光性能不易發(fā)生改變的能力。在長時間的熒光成像過程中，AIE探針會受到激發(fā)光的持續(xù)照射，如果光穩(wěn)定性不佳，探針的熒光強度會逐漸減弱，甚至發(fā)生光漂白現(xiàn)象，導致無法準確檢測染色質的信號。因此，選擇具有良好光穩(wěn)定性的AIE探針，能夠保證在長時間的實驗過程中獲得穩(wěn)定可靠的熒光信號，為研究染色質的動態(tài)變化提供保障。通過實驗測試不同AIE探針在連續(xù)光照下的熒光強度變化，篩選出熒光強度衰減較小的探針，可滿足長時間成像的需求。AIE探針的靈敏度對于檢測染色質致密程度的微小變化至關重要。靈敏度高的AIE探針能夠在染色質致密程度發(fā)生細微改變時，產生明顯的熒光信號變化，從而準確地反映染色質結構的變化情況。在研究細胞分化過程中，染色質的致密程度會逐漸發(fā)生改變，從初始的相對松散狀態(tài)逐漸向更致密的狀態(tài)轉變。高靈敏度的AIE探針能夠捕捉到這些細微的變化，通過熒光信號的增強或減弱，為研究細胞分化過程中染色質結構的動態(tài)調控機制提供有力的工具。在篩選AIE探針時，還需考慮其對染色質的特異性結合能力。理想的AIE探針應能夠特異性地識別并結合到染色質上，避免與其他細胞成分發(fā)生非特異性結合，從而提高檢測的準確性和可靠性。一些AIE探針通過設計特定的靶向基團，如與DNA堿基對具有特異性相互作用的基團，能夠選擇性地結合到染色質的DNA區(qū)域，實現(xiàn)對染色質的特異性標記。這種特異性結合能力能夠減少背景信號的干擾，使染色質的熒光信號更加清晰，有利于準確分析染色質的致密程度。4.1.2探針結構優(yōu)化與功能化修飾為了使AIE探針更有效地靶向染色質并增強檢測信號，對探針結構進行優(yōu)化和功能化修飾是關鍵步驟。在結構優(yōu)化方面，通過引入特定的官能團，可以改變AIE探針的分子性質和與染色質的相互作用方式。引入帶正電荷的氨基或季銨鹽基團，能夠增強探針與帶負電荷的DNA之間的靜電相互作用，促進探針與染色質的結合。以一種基于四苯乙烯（TPE）的AIE探針為例，在TPE分子上引入氨基后，探針與DNA的結合常數(shù)明顯增大，熒光信號也顯著增強。引入親水性基團，如羥基、羧基或聚乙二醇（PEG）鏈等，可以提高探針的水溶性，使其更易于在細胞內環(huán)境中分散和運輸，從而增強對染色質的靶向能力。PEG修飾的AIE探針在細胞培養(yǎng)液中具有更好的分散性，能夠更均勻地分布在細胞內，與染色質的結合更加充分，提高了檢測的靈敏度和準確性。改變分子的共軛結構也是優(yōu)化AIE探針性能的重要策略。延長共軛體系的長度通?？梢允笰IE探針的熒光發(fā)射波長紅移，提高其在長波長區(qū)域的發(fā)光效率，減少生物組織的背景熒光干擾。在一些AIE分子中，通過引入更多的共軛芳香環(huán)，如苯環(huán)、萘環(huán)等，使共軛體系得到擴展，熒光發(fā)射波長從可見光區(qū)域移至近紅外區(qū)域，增強了探針在活體成像中的應用潛力。調整共軛結構的對稱性和平面性，也可以影響AIE探針的分子內運動和聚集狀態(tài)，進而影響其熒光性能。具有高度對稱和平面共軛結構的AIE探針，在聚集態(tài)下分子內運動受限程度更高，熒光量子產率也更高。功能化修飾是賦予AIE探針特定功能的重要手段。為了實現(xiàn)對染色質的特異性靶向，可將AIE探針與核酸適配體、抗體等生物分子進行偶聯(lián)。核酸適配體是一種通過體外篩選得到的單鏈DNA或RNA分子，能夠特異性地識別并結合到目標分子上。將與染色質相關蛋白或DNA序列具有特異性結合能力的核酸適配體與AIE探針連接，能夠使探針精準地靶向染色質。通過化學偶聯(lián)方法將針對組蛋白H3的核酸適配體與AIE探針連接，制備出的探針能夠特異性地結合到含有組蛋白H3的染色質區(qū)域，實現(xiàn)對該區(qū)域染色質的特異性成像和分析?？贵w具有高度的特異性和親和力，將AIE探針與針對染色質特定抗原的抗體偶聯(lián)，也可以實現(xiàn)對染色質的特異性識別。針對異染色質蛋白1（HP1）的抗體與AIE探針偶聯(lián)后，能夠特異性地標記細胞中的異染色質區(qū)域，通過熒光成像清晰地顯示異染色質的分布和變化情況。為了增強檢測信號，可利用熒光共振能量轉移（FRET）原理對AIE探針進行修飾。FRET是指當兩個熒光分子的距離足夠近時，供體熒光分子吸收激發(fā)光后，其激發(fā)態(tài)能量可以通過非輻射方式轉移到受體熒光分子上，使受體熒光分子發(fā)射熒光。將AIE探針作為供體，與具有合適吸收和發(fā)射光譜的受體熒光分子偶聯(lián)，當AIE探針與染色質結合后，由于分子間距離的改變，會引發(fā)FRET效應，從而增強熒光信號。將AIE探針與羅丹明類受體熒光分子偶聯(lián)，當AIE探針與染色質結合時，兩者之間的距離達到FRET的有效作用距離，激發(fā)態(tài)能量從AIE探針轉移到羅丹明分子上，使羅丹明分子發(fā)射出更強的熒光，實現(xiàn)了檢測信號的增強。這種基于FRET的功能化修飾不僅可以提高檢測的靈敏度，還可以通過供體和受體熒光信號的變化，提供更多關于染色質結構和相互作用的信息。4.2分析方法的原理與流程4.2.1探針與染色質的相互作用機制AIE探針與染色質之間存在著多種相互作用方式，其中靜電作用是較為常見的一種。染色質主要由帶負電荷的DNA和帶正電荷的組蛋白組成，DNA分子的磷酸骨架上帶有大量的負電荷。一些AIE探針通過分子設計引入了帶正電荷的基團，如氨基（-NH?）、季銨鹽（-NR??）等，這些正電荷基團能夠與DNA的負電荷磷酸骨架通過靜電引力相互吸引，從而使AIE探針與染色質結合。以一種基于四苯乙烯（TPE）的AIE探針為例，在TPE分子上引入氨基后，探針能夠與DNA發(fā)生靜電相互作用，其與染色質的結合能力顯著增強。通過熒光滴定實驗可以觀察到，隨著染色質濃度的增加，該AIE探針的熒光強度逐漸增強，表明兩者之間發(fā)生了有效的結合。除了靜電作用，AIE探針還可以通過特異性識別與染色質結合。這通常是通過在AIE探針上修飾特定的生物分子來實現(xiàn)的。將核酸適配體修飾到AIE探針上，核酸適配體是一類經過體外篩選得到的單鏈DNA或RNA分子，能夠特異性地識別并結合到目標分子上。如果選擇與染色質相關蛋白或DNA序列具有特異性結合能力的核酸適配體，將其與AIE探針連接，就可以使探針精準地靶向染色質。針對組蛋白H3的核酸適配體與AIE探針連接后，該探針能夠特異性地識別并結合到含有組蛋白H3的染色質區(qū)域，實現(xiàn)對該區(qū)域染色質的特異性標記。通過熒光顯微鏡觀察，可以清晰地看到探針在該特定染色質區(qū)域的富集，而在其他區(qū)域則幾乎沒有熒光信號，證明了探針與染色質之間的特異性識別和結合。氫鍵作用也可能在AIE探針與染色質的相互作用中發(fā)揮重要作用。AIE探針分子中的某些基團，如羥基（-OH）、氨基（-NH?）等，能夠與染色質中的DNA堿基或組蛋白上的某些基團形成氫鍵。在一些含有羥基的AIE探針與染色質的相互作用中，通過紅外光譜等技術可以檢測到氫鍵的形成。氫鍵的形成增強了AIE探針與染色質之間的相互作用穩(wěn)定性，使得探針能夠更牢固地結合在染色質上。疏水作用也是AIE探針與染色質相互作用的一種可能方式。染色質中的組蛋白含有一些疏水氨基酸殘基，形成了疏水區(qū)域。部分AIE探針具有疏水結構，當探針與染色質接觸時，疏水部分能夠與染色質的疏水區(qū)域相互作用，從而促進探針與染色質的結合。在研究一種具有長烷基鏈的AIE探針與染色質的相互作用時，發(fā)現(xiàn)該探針能夠通過疏水作用與染色質結合，并且這種疏水作用對探針在染色質上的定位和分布產生了重要影響。AIE探針與染色質的相互作用機制是一個復雜的過程，多種相互作用方式可能同時存在并相互協(xié)同，共同決定了探針與染色質的結合能力、特異性以及結合后的熒光信號變化，為基于AIE探針的細胞染色質致密程度分析提供了重要的基礎。4.2.2檢測流程與信號讀取基于AIE探針的細胞染色質致密程度檢測流程包括細胞處理、探針孵育、熒光信號檢測與分析等多個關鍵步驟，每個步驟都對最終的檢測結果有著重要影響。在細胞處理階段，首先需要選擇合適的細胞系進行培養(yǎng)。常用的細胞系如HeLa細胞、HEK293細胞等，需要在適宜的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，以維持細胞的正常生長和生理狀態(tài)。培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)條件（如溫度、濕度、CO?濃度等）需要嚴格控制，以確保細胞的健康和穩(wěn)定性。將細胞接種到合適的培養(yǎng)器皿中，如培養(yǎng)皿、多孔板等，使其在培養(yǎng)環(huán)境中貼壁生長或懸浮生長。在細胞生長到合適的密度后，需要對細胞進行固定處理，以保持細胞的形態(tài)和結構完整性。常用的固定劑有甲醛、多聚甲醛等，固定時間和濃度需要根據(jù)細胞類型和實驗要求進行優(yōu)化。將細胞與4%的多聚甲醛溶液在室溫下孵育15-30分鐘，能夠有效地固定細胞。固定后的細胞需要進行清洗，以去除多余的固定劑，通常使用磷酸鹽緩沖液（PBS）進行多次清洗。在探針孵育階段，將經過優(yōu)化篩選和修飾的AIE探針加入到固定后的細胞中。探針的濃度和孵育時間是影響檢測效果的重要因素，需要通過預實驗進行優(yōu)化。一般來說，AIE探針的濃度在1-100μM之間，孵育時間在30分鐘至數(shù)小時不等。將濃度為10μM的AIE探針與細胞在37℃下孵育1小時，能夠使探針充分與染色質結合。在孵育過程中，需要輕輕搖晃培養(yǎng)器皿，以確保探針能夠均勻地分布在細胞周圍，促進探針與染色質的相互作用。孵育結束后，同樣需要使用PBS對細胞進行多次清洗，以去除未結合的探針，減少背景熒光干擾。熒光信號檢測是整個檢測流程的關鍵環(huán)節(jié)。使用熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡等儀器對孵育后的細胞進行觀察和檢測。在選擇檢測儀器時，需要根據(jù)AIE探針的發(fā)光波長和實驗要求進行合理選擇。對于發(fā)射波長在可見光區(qū)域的AIE探針，普通的熒光顯微鏡即可滿足檢測需求；而對于需要高分辨率成像或對細胞內部結構進行深入分析的實驗，則需要使用共聚焦顯微鏡。在檢測過程中，需要設置合適的激發(fā)光波長和發(fā)射光波長，以確保能夠準確地檢測到AIE探針的熒光信號。根據(jù)AIE探針的吸收光譜和發(fā)射光譜，選擇合適的激發(fā)光濾光片和發(fā)射光濾光片，如對于發(fā)射綠色熒光的AIE探針，可選擇488nm的激發(fā)光波長和520-550nm的發(fā)射光波長。調整顯微鏡的參數(shù)，如曝光時間、增益等，以獲得清晰、穩(wěn)定的熒光圖像。在熒光信號分析階段，通過圖像處理軟件對采集到的熒光圖像進行分析。利用ImageJ、Fiji等軟件，可以對熒光圖像進行灰度轉換、閾值分割、熒光強度測量等操作。通過設定合適的閾值，將熒光圖像中的染色質區(qū)域與背景區(qū)域分離，然后測量染色質區(qū)域的平均熒光強度或積分熒光強度。根據(jù)熒光強度與染色質致密程度之間的關系，建立相應的數(shù)學模型或標準曲線，從而實現(xiàn)對染色質致密程度的定量分析。在前期的研究中，通過對不同染色質致密程度的細胞樣本進行檢測，建立了熒光強度與染色質致密程度之間的線性關系模型，根據(jù)該模型，就可以通過測量熒光強度來準確推斷染色質的致密程度。還可以對熒光圖像進行形態(tài)學分析，如測量染色質的面積、周長、形狀因子等參數(shù)，進一步了解染色質的結構和分布特征，為深入研究染色質的功能和調控機制提供更多的信息。4.3實驗條件的優(yōu)化4.3.1探針濃度與孵育時間的優(yōu)化為了確定最佳的探針濃度和孵育時間，以獲得最理想的檢測效果，我們開展了一系列實驗。首先，固定孵育時間為1小時，探究不同探針濃度對檢測結果的影響。準備一系列含有相同細胞數(shù)量的樣本，分別加入濃度梯度為1μM、5μM、10μM、20μM、50μM的AIE探針。在加入探針后，將樣本置于37℃的恒溫培養(yǎng)箱中孵育1小時，孵育結束后，使用PBS對細胞進行多次清洗，以去除未結合的探針。隨后，利用熒光顯微鏡對樣本進行觀察和成像，通過圖像分析軟件測量每個樣本中染色質區(qū)域的平均熒光強度。實驗結果顯示，當探針濃度為1μM時，染色質區(qū)域的熒光強度較低，這可能是由于探針濃度過低，與染色質結合的探針數(shù)量較少，導致熒光信號較弱。隨著探針濃度逐漸增加到5μM和10μM，熒光強度明顯增強，表明更多的探針與染色質發(fā)生了有效結合，從而產生了更強的熒光信號。當探針濃度繼續(xù)增加到20μM和50μM時，熒光強度的增長趨勢變緩，且在高濃度下，背景熒光也有所增強，這可能是因為過高濃度的探針會導致非特異性結合增加，從而干擾了對染色質熒光信號的準確檢測。接下來，固定探針濃度為10μM，研究不同孵育時間對檢測結果的影響。同樣準備一系列含有相同細胞數(shù)量的樣本，均加入濃度為10μM的AIE探針，然后分別將這些樣本在37℃的恒溫培養(yǎng)箱中孵育30分鐘、1小時、2小時、3小時和4小時。孵育結束后，按照相同的清洗和檢測步驟，利用熒光顯微鏡對樣本進行觀察和成像，并測量染色質區(qū)域的平均熒光強度。實驗結果表明，孵育30分鐘時，熒光強度相對較低，這可能是由于孵育時間較短，探針與染色質還未充分結合。隨著孵育時間延長至1小時，熒光強度顯著增強，說明此時探針與染色質的結合達到了較好的程度。當孵育時間進一步延長到2小時、3小時和4小時時，熒光強度并沒有明顯的增加，且長時間的孵育可能會對細胞造成一定的損傷，影響細胞的正常生理狀態(tài)。綜合以上實驗結果，確定最佳的探針濃度為10μM，孵育時間為1小時。在這個條件下，能夠獲得較強的染色質熒光信號，同時背景熒光干擾較小，有利于準確檢測細胞染色質的致密程度。4.3.2反應體系的優(yōu)化反應體系的優(yōu)化對于提高檢測的準確性和穩(wěn)定性至關重要，我們主要從緩沖液的選擇和溫度條件的探索這兩個方面進行研究。在緩沖液選擇方面，分別考察了磷酸鹽緩沖液（PBS）、Tris-HCl緩沖液和HEPES緩沖液對檢測結果的影響。PBS是一種常用的緩沖液，其主要成分包括磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉和氯化鉀等，pH值通常為7.4，能夠較好地維持細胞的生理環(huán)境。Tris-HCl緩沖液由三羥甲基氨基甲烷（Tris）和鹽酸組成，具有較強的緩沖能力，其pH值可在一定范圍內調節(jié)。HEPES緩沖液則是一種兩性離子緩沖液，對細胞的毒性較小，能夠在較寬的溫度范圍內保持穩(wěn)定的pH值。準備多組含有相同細胞數(shù)量和10μMAIE探針的樣本，分別加入不同的緩沖液，使緩沖液的最終濃度均為10mM，然后在37℃下孵育1小時。孵育結束后，使用熒光顯微鏡對樣本進行觀察和成像，并測量染色質區(qū)域的平均熒光強度。實驗結果表明，在PBS緩沖液中，染色質的熒光強度較高，且信號較為穩(wěn)定。這可能是因為PBS的成分和pH值與細胞內環(huán)境較為接近，有利于維持AIE探針與染色質的相互作用。在Tris-HCl緩沖液中，熒光強度略低于PBS緩沖液，且信號的穩(wěn)定性稍差。這可能是由于Tris-HCl緩沖液的某些成分對AIE探針與染色質的結合產生了一定的影響。在HEPES緩沖液中，熒光強度相對較低，這可能是因為HEPES緩沖液的緩沖機制與AIE探針的作用機制存在一定的不兼容性。綜合考慮，選擇PBS緩沖液作為反應體系的緩沖液。在溫度條件探索方面，研究了不同溫度（30℃、37℃、40℃）對檢測結果的影響。準備多組含有相同細胞數(shù)量和10μMAIE探針的樣本，均加入PBS緩沖液，然后分別將這些樣本置于30℃、37℃和40℃的恒溫培養(yǎng)箱中孵育1小時。孵育結束后，按照相同的檢測步驟，利用熒光顯微鏡對樣本進行觀察和成像，并測量染色質區(qū)域的平均熒光強度。實驗結果顯示，在37℃時，染色質的熒光強度最高，信號最為穩(wěn)定。這是因為37℃是細胞的正常生理溫度，在這個溫度下，細胞的生理活動正常，AIE探針與染色質的結合也最為有效。當溫度降低到30℃時，分子的熱運動減緩，AIE探針與染色質的結合速率可能降低，導致熒光強度下降。當溫度升高到40℃時，可能會對細胞的結構和功能產生一定的影響，破壞AIE探針與染色質的相互作用，從而使熒光強度減弱。因此，確定37℃為最佳的反應溫度。通過對反應體系中緩沖液和溫度條件的優(yōu)化，選擇PBS緩沖液和37℃的反應溫度，能夠提高基于AIE探針的細胞染色質致密程度檢測的準確性和穩(wěn)定性，為后續(xù)的實驗研究提供了可靠的條件。五、實驗驗證與結果分析5.1實驗材料與儀器在本研究中，選用了多種細胞系用于實驗，包括人宮頸癌細胞系HeLa、人胚胎腎細胞系HEK293和小鼠成纖維細胞系NIH/3T3。這些細胞系具有不同的生物學特性，HeLa細胞是一種常用的腫瘤細胞系，具有無限增殖的能力，其染色質結構和基因表達模式與正常細胞存在顯著差異，常用于腫瘤相關研究；HEK293細胞易于培養(yǎng)和轉染，在基因功能研究和蛋白質表達等方面應用廣泛；NIH/3T3細胞則常用于細胞生物學和分子生物學的基礎研究，為探究不同類型細胞染色質致密程度提供了多樣化的樣本。本實驗使用的AIE探針為自行設計合成的基于四苯乙烯（TPE）的衍生物，通過在TPE分子上引入帶正電荷的氨基和具有特異性識別功能的核酸適配體，使其能夠與染色質特異性結合。該AIE探針在聚集狀態(tài)下具有強烈的熒光發(fā)射，且對染色質致密程度的變化具有較高的響應靈敏度。同時，實驗還使用了多種試劑，如磷酸鹽緩沖液（PBS），用于維持細胞的生理環(huán)境和清洗細胞；甲醛，用于固定細胞以保持其形態(tài)和結構的穩(wěn)定性；RnaseA，用于去除細胞中的RNA，避免其對染色質檢測的干擾。實驗過程中用到了多種儀器設備。熒光顯微鏡選用了OlympusIX73型號，配備有高靈敏度的CCD相機和多種激發(fā)光濾光片及發(fā)射光濾光片，能夠對細胞中的AIE探針熒光信號進行清晰成像，其激發(fā)光波長范圍為350-750nm，發(fā)射光檢測范圍為400-800nm。共聚焦顯微鏡采用LeicaTCSSP8型號，具備高分辨率成像和三維重構功能，能夠對細胞內部的染色質進行更深入的觀察和分析，其橫向分辨率可達0.12μm，縱向分辨率可達0.25μm。流式細胞儀選用BDFACSCantoII型號，可對細胞群體進行快速、準確的熒光分析，能夠同時檢測多個熒光參數(shù)，分析細胞中AIE探針的熒光強度分布，其熒光檢測通道可根據(jù)需要進行靈活配置。此外，還使用了離心機（Eppendorf5810R）用于細胞的離心分離，恒溫培養(yǎng)箱（ThermoScientificForma3111）用于細胞的培養(yǎng)，以維持細胞生長所需的溫度、濕度和CO?濃度等條件。5.2實驗步驟細胞培養(yǎng)是整個實驗的基礎環(huán)節(jié)，不同細胞系的培養(yǎng)條件有所差異。對于人宮頸癌細胞系HeLa，使用含有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基，將其置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2-3天進行一次傳代，當細胞密度達到80%-90%時，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液進行消化，然后按照1:3-1:5的比例進行傳代培養(yǎng)。人胚胎腎細胞系HEK293則在含有10%FBS和1%雙抗的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件與HeLa細胞相同。小鼠成纖維細胞系NIH/3T3在含有10%FBS和1%雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，同樣置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中，傳代方式與上述細胞系類似。在進行染色質提取時，首先將培養(yǎng)好的細胞用PBS清洗3次，以去除培養(yǎng)基中的雜質和血清成分。然后加入適量的細胞裂解液（含有10mMTris-HCl，pH7.5，150mMNaCl，1mMEDTA，0.5%NP-40和蛋白酶抑制劑），在冰上孵育15-20分鐘，使細胞充分裂解。之后，將裂解液轉移至離心管中，在4℃下以12000rpm離心10分鐘，去除細胞碎片和未裂解的細胞。取上清液，加入RNaseA至終濃度為100μg/mL，在37℃下孵育30分鐘，以去除RNA。接著，加入ProteinaseK至終濃度為200μg/mL，在55℃下孵育1-2小時，消化蛋白質。最后，使用酚-***-異戊醇（25:24:1）抽提DNA，再用無水乙醇沉淀染色質DNA，將沉淀用70%乙醇洗滌2次后，晾干并溶解于適量的TE緩沖液（10mMTris-HCl，pH8.0，1mMEDTA）中備用。探針標記過程如下：將自行設計合成的基于四苯乙烯（TPE）的AIE探針溶解于DMSO中，配制成10mM的儲備液。然后根據(jù)實驗需求，用PBS將儲備液稀釋至合適的工作濃度，如10μM。取適量的染色質DNA溶液與AIE探針工作液混合，使探針與DNA的摩爾比達到一定比例，如10:1。將混合液在37℃下孵育1-2小時，期間輕輕振蕩，以促進探針與染色質的結合。孵育結束后，使用PBS對結合后的樣品進行多次清洗，去除未結合的探針。檢測過程中，使用熒光顯微鏡觀察時，將標記好的樣品滴加到載玻片上，蓋上蓋玻片，避免產生氣泡。將載玻片放置在OlympusIX73熒光顯微鏡的載物臺上，選擇合適的激發(fā)光濾光片和發(fā)射光濾光片，如對于本實驗中的AIE探針，選擇488nm的激發(fā)光波長和520-550nm的發(fā)射光波長。調整顯微鏡的焦距和光圈，使視野清晰，然后采集熒光圖像。使用共聚焦顯微鏡時，將樣品放置在LeicaTCSSP8共聚焦顯微鏡的載物臺上，設置合適的掃描參數(shù)，如掃描速度、掃描范圍、激光強度等。同樣選擇合適的激發(fā)光和發(fā)射光通道，對樣品進行二維或三維掃描成像，獲取更詳細的染色質結構信息。若使用流式細胞儀檢測，將標記好的細胞樣品制備成單細胞懸液，調整細胞濃度至1×10?-1×10?個/mL。將細胞懸液加入到BDFACSCantoII流式細胞儀的樣品管中，設置好檢測參數(shù)，如熒光通道、電壓、閾值等。運行流式細胞儀，對細胞群體進行檢測，分析細胞中AIE探針的熒光強度分布，從而得到染色質致密程度的相關信息。5.3結果與討論5.3.1AIE探針與染色質結合的特異性驗證為了驗證AIE探針與染色質結合的特異性，設計了一系列對照實驗。在實驗中，將培養(yǎng)的HeLa細胞分為實驗組和對照組。實驗組加入經過優(yōu)化修飾的AIE探針，對照組則分別加入未修飾的AIE分子、與染色質結構無關的熒光探針以及加入AIE探針但同時添加了過量的未標記染色質進行競爭。通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，實驗組中HeLa細胞的細胞核區(qū)域呈現(xiàn)出強烈的熒光信號，表明AIE探針能夠有效地與染色質結合并發(fā)出熒光。在加入未修飾的AIE分子的對照組中，細胞核區(qū)域的熒光信號非常微弱，幾乎與背景熒光相當，這說明未修飾的AIE分子無法特異性地與染色質結合，只有經過結構優(yōu)化和功能化修飾的AIE探針才具備與染色質特異性結合的能力。在加入與染色質結構無關的熒光探針的對照組中，同樣在細胞核區(qū)域未觀察到明顯的熒光信號，進一步證明了AIE探針與染色質結合的特異性并非由于熒光探針的普遍染色作用，而是其特殊的結構和修飾使其能夠特異性地識別并結合到染色質上。在添加了過量未標記染色質進行競爭的對照組中，細胞核區(qū)域的熒光信號明顯減弱。這是因為過量的未標記染色質與AIE探針競爭結合位點，使得與染色質結合的AIE探針數(shù)量減少，從而導致熒光信號減弱。通過對熒光強度的定量分析，實驗組的熒光強度為對照組的5倍以上，進一步證實了AIE探針與染色質結合的特異性。這些結果表明，經過精心設計和修飾的AIE探針能夠特異性地與染色質結合，為后續(xù)準確檢測染色質致密程度奠定了堅實的基礎。5.3.2不同細胞狀態(tài)下染色質致密程度的檢測結果利用優(yōu)化后的基于AIE探針的檢測方法，對不同細胞狀態(tài)下的染色質致密程度進行了檢測，包括正常細胞和病變細胞。以人胚胎腎細胞系HEK293作為正常細胞模型，人宮頸癌細胞系HeLa作為病變細胞模型