ICS65.020.20

CCSB05

15

內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)

DB15/T2484—2021

胡蘿卜小孢子培養(yǎng)技術(shù)規(guī)程

Technicalcodeofpracticeformicrosporecultureofcarrot

2021-12-25發(fā)布2022-01-25實(shí)施

內(nèi)蒙古自治區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布

DB15/T2484—2021

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起

草。

本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧廳提出。

本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)果蔬標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（SAM/TC25）歸口。

本文件起草單位：內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院。

本文件主要起草人：王葆生、陳源閩、劉曉蕊、廉勇、劉湘萍、張艷萍、朱春俠。

I

DB15/T2484—2021

胡蘿卜小孢子培養(yǎng)技術(shù)規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了胡蘿卜小孢子培養(yǎng)技術(shù)的操作流程。

本文件適用于胡蘿卜的小孢子培養(yǎng)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

NY/T2306花卉種苗組培快繁技術(shù)規(guī)程

3術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

小孢子microspore

高等植物生活史中雄配子體發(fā)育過(guò)程中短暫而重要的階段，是減數(shù)分裂后四分體釋放出的單倍性

單細(xì)胞。

小孢子培養(yǎng)microsporeculture

采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，把發(fā)育到一定階段的小孢子，通過(guò)無(wú)菌操作技術(shù)接種在人工培養(yǎng)基上，誘

導(dǎo)形成愈傷組織或胚狀體，進(jìn)而形成完整植株的一種培養(yǎng)方式。

單倍體haploid

體細(xì)胞中含有本物種配子染色體數(shù)目的個(gè)體。

4試劑

超純水

應(yīng)符合GB/T6682中規(guī)定的三級(jí)超純水。

1

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藥品

消毒試劑：乙醇，氯化汞。

無(wú)機(jī)試劑：硝酸銨，硝酸鉀，硫酸銨，氯化鈣、硝酸鈣，硫酸鎂，磷酸二氫鉀，磷酸二氫鈉，碘

化鉀，硼酸，硫酸錳，硫酸鋅，鉬酸鈉，硫酸銅，氯化鈷，硫酸亞鐵，EDTA二鈉鹽。

有機(jī)試劑：肌醇，煙酸，鹽酸吡哆醇、鹽酸硫胺素、甘氨酸，葉酸，生物素，谷氨酰胺，絲氨

酸，谷胱甘肽。

生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑：2,4-D，6-BA。

其他試劑：瓊脂，活性炭，蔗糖。

所有藥品等級(jí)均為分析純。

5儀器設(shè)備

純水儀，萬(wàn)分之一分析天平，pH計(jì)，移液槍?zhuān)銣嘏囵B(yǎng)箱，電磁爐，超凈工作臺(tái)，高壓滅菌鍋，離

心機(jī)，光學(xué)顯微鏡。

6培養(yǎng)基配制滅菌與分裝

小孢子培養(yǎng)各階段使用商品化的B5、NLN、MS和1/2MS基本培養(yǎng)基，具體成分及含量見(jiàn)附錄A。按培

養(yǎng)基說(shuō)明書(shū)用量加入基本培養(yǎng)基、根據(jù)附錄A的用量加入除瓊脂外的其它成分，待培養(yǎng)基內(nèi)所有組分充

分溶解后，調(diào)pH值至5.8，定容，按附錄A的用量加入瓊脂粉，分別制成分離培養(yǎng)基、誘導(dǎo)培養(yǎng)基、分化

培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基。

將配制好的培養(yǎng)基分裝至三角瓶中封口后進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，滅菌應(yīng)符合NY/T2306的規(guī)定。滅菌

結(jié)束后，待培養(yǎng)基溫度降至55℃～60℃時(shí)，在超凈工作臺(tái)中將分離培養(yǎng)基、誘導(dǎo)培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基

分裝至培養(yǎng)皿中、生根培養(yǎng)基分裝至三角瓶中，自然冷卻。

7小孢子培養(yǎng)技術(shù)流程

采樣

選擇生長(zhǎng)勢(shì)好、無(wú)病蟲(chóng)害的健壯植株，于晴天上午取開(kāi)花后15d～25d的花序。剝?nèi)』ㄋ帀浩⑹?/p>

用1%醋酸洋紅染色，鏡檢篩選花粉母細(xì)胞處于單核期的花序。

外植體消毒

將花序用自來(lái)水沖洗10min，用剪刀將小花依次剪下，置于燒杯中，在超凈工作臺(tái)中依次用75%乙

醇50s、0.1%氯化汞4min消毒、無(wú)菌水沖洗6次，瀝干水分。

小孢子分離

將消毒后的小花轉(zhuǎn)入無(wú)菌研缽，加入1倍體積的分離培養(yǎng)基，用研棒輕研，液體經(jīng)400目篩過(guò)濾至10

mL離心管中，700r/min離心3min，去上清液，沉淀用1mL分離培養(yǎng)基懸浮。重復(fù)上述步驟2次后，將

懸浮液加入液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，將小孢子濃度調(diào)至1×105個(gè)·mL-1。吸取2ml移入固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。

誘導(dǎo)胚狀體

2

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將培養(yǎng)皿放入恒溫培養(yǎng)箱中33℃下暗培養(yǎng)2d，然后25℃下暗培養(yǎng)50d～120d至胚狀體產(chǎn)生。

胚狀體分化

當(dāng)小孢子分化出胚狀體時(shí)，將胚狀體接種于分化培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為光

照強(qiáng)度1500lx，16h·d-1，溫度26℃。培養(yǎng)30d左右可以形成小苗。

誘導(dǎo)生根

選取生長(zhǎng)健壯的離體再生苗移植到生根培養(yǎng)基上，每個(gè)三角瓶中放置2～3株。將培養(yǎng)瓶放至培養(yǎng)箱

中，培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度1500lx，16h·d-1，溫度26℃，培養(yǎng)2至4周直至小苗生出完整根系。

煉苗與移栽

將培養(yǎng)瓶放置于日光溫室中，打開(kāi)瓶蓋，加水至培養(yǎng)基上1cm，煉苗3d，然后將根部培養(yǎng)基清洗

干凈，栽種于裝有消毒育苗基質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)缽中，澆水后用塑料袋覆蓋保濕，7d后取掉塑料袋。溫度白天

控制在25℃±3℃，夜晚12℃±3℃。

8倍性鑒定

取幼苗根尖，采用根尖壓片法進(jìn)行壓片，在顯微鏡下觀察染色體數(shù)目，當(dāng)再生植株染色體數(shù)目為9

條時(shí)，證明該植株為單倍體。

3

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A

A

附錄A

（資料性）

培養(yǎng)基成分及用量

A.1商品基本培養(yǎng)基成分用量見(jiàn)表A.1。

表A.1商品基本培養(yǎng)基成分及用量表

單位為毫克每升

分離培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)基分化培養(yǎng)基生根培養(yǎng)基

培養(yǎng)基成分B5NLNMS1/2MS

KNO325001251900950

NH4NO3001650825

(NH4)2SO4134000

CaCl2·2H2O1500440220

Ca(NO3)2·4H2O050000

MgSO4122.0961.0418090

KH2PO4012517085

NaH2PO4130.44000

MnSO4·H2O1018.9422.322.3

H3BO33106.26.2

ZnSO4·7H2O2108.68.6

Na2MoO4·2H2O0.250.250.250.25

CuSO4·5H2O0.0250.0250.0250.025

CoCl2·6H2O0.0250.0250.0250.025

KI0.7500.830.83

FeSO4·7H2O27.827.827.827.8

Na2EDTA·2H2O37.337.337.337.3

肌醇100100100100

鹽酸硫胺素100.50.10.1

鹽酸吡哆醇10.50.50.5

煙酸150.50.5

甘氨酸0222

葉酸00.500

生物素00.0500

L-谷氨酰胺080000

L-絲氨酸010000

谷胱甘肽03000

4

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A.2培養(yǎng)基其他添加物成分及用量見(jiàn)表A.2。

表A.2培養(yǎng)基其它添加物成分及用量表

單位為克每升

分離培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)基分化培養(yǎng)基