宏基因組二代測序技術(shù)在血液病患者感染病原診斷中的應(yīng)用中國專家共識（2023年版）解讀精準(zhǔn)診斷，守護(hù)血液健康目錄第一章第二章第三章共識背景與概述技術(shù)原理與優(yōu)勢血液病應(yīng)用指南目錄第四章第五章第六章診斷標(biāo)準(zhǔn)與操作規(guī)范臨床應(yīng)用與挑戰(zhàn)總結(jié)與未來展望共識背景與概述1.血液病患者感染現(xiàn)狀血液病患者因免疫功能低下，感染并發(fā)癥發(fā)生率高且臨床表現(xiàn)不典型，傳統(tǒng)病原檢測方法陽性率低、耗時長，亟需更高效的診斷技術(shù)。宏基因組二代測序（mNGS）具有廣譜病原覆蓋、高通量特點，可顯著提高病原檢出率，為精準(zhǔn)抗感染治療提供依據(jù)?，F(xiàn)有指南對mNGS在血液病感染中的應(yīng)用缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，本共識旨在規(guī)范技術(shù)流程、結(jié)果解讀及臨床適用范圍。由血液科、感染科、檢驗科專家聯(lián)合制定，確保共識的全面性與實操性。mNGS技術(shù)優(yōu)勢臨床需求驅(qū)動多學(xué)科協(xié)作必要性制定背景與目的涵蓋樣本采集、核酸提取、文庫構(gòu)建、測序及生物信息分析全流程標(biāo)準(zhǔn)化建議，強(qiáng)調(diào)質(zhì)量控制關(guān)鍵節(jié)點。技術(shù)原理與流程明確推薦用于不明原因發(fā)熱、重癥感染、免疫抑制患者及傳統(tǒng)檢測陰性但臨床高度懷疑感染的病例。適應(yīng)癥與禁忌癥提出病原優(yōu)先級排序（如排除定植菌）、閾值設(shè)定（reads數(shù)/基因組覆蓋度）及與臨床表現(xiàn)結(jié)合的綜合判斷方法。結(jié)果解讀原則指出技術(shù)成本高、生信分析復(fù)雜等不足，建議聯(lián)合傳統(tǒng)檢測（如培養(yǎng)、PCR）以提高準(zhǔn)確性。局限性及應(yīng)對核心內(nèi)容框架補(bǔ)充血液病患者常見病原體（如真菌、病毒）的mNGS檢測效能分析，尤其強(qiáng)調(diào)罕見病原體的診斷價值。新增病原譜數(shù)據(jù)針對兒童血液病患者提出樣本量調(diào)整、病原數(shù)據(jù)庫優(yōu)化等差異化方案。兒科特殊人群建議將耐藥基因分析納入共識，指導(dǎo)臨床在檢出病原的同時預(yù)測耐藥性，優(yōu)化治療方案。耐藥基因檢測擴(kuò)展新增經(jīng)濟(jì)學(xué)分析，建議根據(jù)感染嚴(yán)重程度分層使用mNGS，避免資源浪費(fèi)。成本效益評估版本更新關(guān)鍵點技術(shù)原理與優(yōu)勢2.高通量分析通過并行測序技術(shù)對數(shù)百萬條DNA片段進(jìn)行測序，結(jié)合生物信息學(xué)算法實現(xiàn)病原體基因組的高效拼接和注釋。無偏倚檢測直接從臨床樣本中提取全部微生物核酸，無需預(yù)培養(yǎng)或靶向擴(kuò)增，可同時檢測細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲等所有病原體。動態(tài)范圍廣可檢測低至0.1%的病原體序列，對苛養(yǎng)菌、罕見病原體及混合感染具有更高檢出率。溯源追蹤基于單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析可實現(xiàn)院內(nèi)感染暴發(fā)的病原體同源性追蹤。耐藥基因分析通過全基因組覆蓋能力同步檢測耐藥基因突變（如結(jié)核分枝桿菌rpoB基因突變），指導(dǎo)精準(zhǔn)用藥。宏基因組測序基本機(jī)制Illumina平臺提供150-300bp讀長，原始堿基準(zhǔn)確率>99.9%，適合耐藥突變檢測。短讀長高精度快速檢測周期微量樣本需求多組學(xué)整合從樣本處理到報告生成可壓縮至24-48小時，顯著快于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法。僅需1ml腦脊液或200μL血漿即可完成檢測，適用于重癥患者。支持DNA/RNA共檢測，可同步發(fā)現(xiàn)活動性RNA病毒（如流感病毒、SARS-CoV-2）。二代測序技術(shù)特點感染病原診斷優(yōu)勢直接檢測不可培養(yǎng)病原體（如諾卡菌、巴爾通體）及抗生素治療后死菌殘留DNA。突破培養(yǎng)限制對阿米巴原蟲、微孢子蟲等傳統(tǒng)方法易漏檢的病原體具有獨(dú)特優(yōu)勢。罕見病原體識別通過耐藥基因譜分析（如mecA、KPC基因）優(yōu)化抗菌藥物選擇，減少廣譜抗生素濫用。指導(dǎo)精準(zhǔn)治療血液病應(yīng)用指南3.免疫抑制狀態(tài)非典型臨床表現(xiàn)傳統(tǒng)檢測局限性混合感染高發(fā)血液病患者因化療或造血干細(xì)胞移植導(dǎo)致中性粒細(xì)胞缺乏，T/B細(xì)胞功能受損，易發(fā)生細(xì)菌、真菌及病毒感染。感染癥狀常被原發(fā)病掩蓋，如發(fā)熱可能為唯一表現(xiàn)，且病原體分布廣（如曲霉、CMV、耐藥菌等）。血培養(yǎng)陽性率不足20%，且耗時長達(dá)3-5天，難以滿足快速診斷需求。約30%患者存在多重病原體共感染，需同時覆蓋細(xì)菌、真菌、病毒及寄生蟲檢測。血液病患者感染特征不明原因發(fā)熱對于粒細(xì)胞缺乏伴發(fā)熱且經(jīng)驗性治療無效者，推薦48小時內(nèi)啟動mNGS檢測以明確病原。重癥感染疑似病例如膿毒癥、肺部浸潤影進(jìn)展迅速者，優(yōu)先選擇支氣管肺泡灌洗液或組織樣本送檢。特殊人群異基因造血干細(xì)胞移植后出現(xiàn)GVHD合并感染患者，需聯(lián)合mNGS與血清學(xué)檢測提高診斷率。適用場景與適應(yīng)癥標(biāo)本選擇優(yōu)先級技術(shù)互補(bǔ)性臨床-實驗室溝通報告時效性優(yōu)化血液樣本適用于血流感染，局灶感染應(yīng)采集病灶部位（如腦脊液、肺組織）；建議多部位同步送檢。建立多學(xué)科團(tuán)隊（MDT），確保檢測結(jié)果與患者癥狀、影像學(xué)動態(tài)關(guān)聯(lián)解讀。mNGS陽性結(jié)果需結(jié)合PCR、抗原檢測或培養(yǎng)驗證，排除定植菌干擾。實驗室需在24-48小時內(nèi)反饋初步報告，重點標(biāo)注高置信度病原體及耐藥基因。診斷流程整合策略診斷標(biāo)準(zhǔn)與操作規(guī)范4.輸入標(biāo)題樣本類型選擇無菌采集原則血液樣本需嚴(yán)格無菌操作，避免環(huán)境或皮膚定植菌污染，推薦使用專用血培養(yǎng)瓶或核酸保存管，采集后立即送檢以減少核酸降解。記錄樣本采集時間、體積及溶血程度，同步檢測人源DNA含量（如β-actin基因）以評估樣本質(zhì)量。樣本需在4℃保存（不超過24小時）或-80℃長期保存，運(yùn)輸過程中需使用干冰或?qū)Ｓ美滏溤O(shè)備，確保核酸穩(wěn)定性。優(yōu)先選擇感染部位直接樣本（如肺泡灌洗液、腦脊液），血液樣本需結(jié)合臨床判斷，避免因低病原載量導(dǎo)致假陰性。質(zhì)量控制指標(biāo)運(yùn)輸與保存條件樣本采集處理要求去宿主序列處理采用生物信息學(xué)工具（如Bowtie2）過濾人源序列，提高病原序列占比，閾值設(shè)定需平衡敏感性與特異性。數(shù)據(jù)庫匹配優(yōu)化聯(lián)合使用多病原數(shù)據(jù)庫（如NCBIRefSeq、自定義臨床病原庫），定期更新以覆蓋罕見病原體，降低假陽性風(fēng)險。閾值設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)序列數(shù)（RPM）、基因組覆蓋度等指標(biāo)動態(tài)調(diào)整陽性閾值，血液病樣本可適當(dāng)降低閾值以檢測低載量病原。數(shù)據(jù)分析方法要點臨床相關(guān)性評估結(jié)合患者免疫狀態(tài)、感染部位及癥狀，區(qū)分定植菌與致病菌，如曲霉菌在肺部檢出需結(jié)合影像學(xué)確認(rèn)。耐藥基因注釋對檢測到的耐藥基因（如blaKPC、mecA）需注釋臨床意義，避免過度解讀非表達(dá)型耐藥基因。多病原協(xié)同分析對混合感染病例需優(yōu)先排序病原體貢獻(xiàn)度，如CMV與細(xì)菌共檢出時評估各自致病權(quán)重。報告格式統(tǒng)一明確標(biāo)注檢測限、置信度及局限性，避免非專業(yè)術(shù)語，推薦分級報告（確診/疑似/定植）。結(jié)果解讀標(biāo)準(zhǔn)化臨床應(yīng)用與挑戰(zhàn)5.質(zhì)量控制關(guān)鍵要素確保樣本采集的規(guī)范性和時效性，避免因操作不當(dāng)導(dǎo)致病原體降解或污染，建議采用無菌容器并在規(guī)定時間內(nèi)送檢，以提高檢測準(zhǔn)確性。樣本采集標(biāo)準(zhǔn)化針對血液樣本中病原體載量低的特點，需優(yōu)化核酸提取方法（如增加裂解步驟或使用高效提取試劑盒），以提升病原體核酸的捕獲率。核酸提取效率優(yōu)化建立嚴(yán)格的生物信息學(xué)分析流程，包括去宿主序列、去除背景噪音、數(shù)據(jù)庫匹配等環(huán)節(jié)，避免假陽性或假陰性結(jié)果，確保數(shù)據(jù)可靠性。生信分析流程嚴(yán)謹(jǐn)性1234對于血液病患者免疫功能低下導(dǎo)致的低病原載量，建議采用高靈敏度測序平臺或靶向富集技術(shù)（如探針捕獲）以提高檢出率。通過優(yōu)化去宿主序列算法（如基于人源基因組比對剔除）或選擇性裂解宿主細(xì)胞，減少宿主核酸對病原檢測的干擾。在生信分析中整合耐藥基因數(shù)據(jù)庫（如CARD、ARDB），并對檢測到的病原體進(jìn)行耐藥基因注釋，輔助臨床精準(zhǔn)用藥。嚴(yán)格實驗室分區(qū)操作（如PCR前/后區(qū)域分離）、陰性對照設(shè)置及環(huán)境監(jiān)測，避免交叉污染導(dǎo)致的假陽性結(jié)果。低病原載量問題污染控制措施耐藥基因漏檢宿主背景干擾常見問題解決方案縮短診斷時間成本綜合診斷價值技術(shù)普及瓶頸相比傳統(tǒng)培養(yǎng)方法（耗時3-7天），mNGS可在24-48小時內(nèi)提供病原體信息，減少經(jīng)驗性抗生素使用時長及住院費(fèi)用。mNGS可一次性檢測細(xì)菌、真菌、病毒及罕見病原體，尤其適用于傳統(tǒng)檢測陰性的疑難病例，降低反復(fù)檢查的累積成本。當(dāng)前設(shè)備投入、試劑成本及數(shù)據(jù)分析人力需求較高，需通過標(biāo)準(zhǔn)化流程推廣和規(guī)?；瘷z測降低單次檢測費(fèi)用。成本與效益評估總結(jié)與未來展望6.優(yōu)先適用人群推薦用于粒細(xì)胞缺乏伴發(fā)熱、疑似侵襲性真菌感染及常規(guī)檢測陰性的疑難病例，尤其適用于免疫功能嚴(yán)重受損的血液病患者。標(biāo)本采集標(biāo)準(zhǔn)化強(qiáng)調(diào)無菌體液（如血液、腦脊液）為首選樣本類型，需規(guī)范采集流程以避免污染，并明確送檢時間應(yīng)控制在2小時內(nèi)。結(jié)果解讀多學(xué)科協(xié)作要求結(jié)合臨床背景、傳統(tǒng)檢測和宿主因素綜合判讀，避免過度依賴單一技術(shù)，建議由感染科、血液科和微生物專家共同參與診斷決策。專家共識核心推薦耐藥基因檢測探索mNGS在血流感染中同步檢測病原體耐藥基因的可行性，指導(dǎo)精準(zhǔn)抗微生物治療。宿主反應(yīng)分析開發(fā)基于mNGS數(shù)據(jù)的宿主免疫應(yīng)答標(biāo)志物（如炎癥因子相關(guān)轉(zhuǎn)錄本），輔助鑒別定植與感染。成本效益優(yōu)化研究靶向富集測序（如探針捕獲技術(shù)）在保持敏感性的前提下降低檢測成本的方案。研究發(fā)展方向分級診療體系建議三級醫(yī)院建立區(qū)域性mNGS檢測中心，基層機(jī)構(gòu)通過