基于蛋白質(zhì)組學(xué)解析P53介導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞放射生物學(xué)效應(yīng)的機(jī)制探究一、引言1.1研究背景鼻咽癌（NasopharyngealCarcinoma，NPC）是一種起源于鼻咽上皮組織的惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)出明顯的地域分布差異。在中國(guó)南方及東南亞地區(qū)，NPC的發(fā)病率尤為突出，嚴(yán)重威脅著當(dāng)?shù)鼐用竦慕】?。NPC具有早期轉(zhuǎn)移的顯著臨床特征，這一特性由鼻咽癌細(xì)胞特殊的生物學(xué)特性所決定，也是導(dǎo)致患者病情惡化的重要原因。盡管多年來(lái)科研人員一直在不懈探索NPC的發(fā)病機(jī)制，但目前仍未完全明晰。大量研究表明，腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因參與、多階段演變的復(fù)雜病理過(guò)程，涉及眾多不同種類(lèi)和性質(zhì)蛋白質(zhì)的功能變化。放射治療在NPC的治療中占據(jù)著至關(guān)重要的地位，是主要的治療手段。這是因?yàn)镹PC對(duì)放射線具有較高的敏感性，且其位置特殊，周?chē)嬖谳^多重要結(jié)構(gòu)，手術(shù)難度大、風(fēng)險(xiǎn)高，使得放療成為更優(yōu)選擇。然而，目前NPC的放療效果仍不盡人意，5年生存率始終在40-50%左右徘徊。放療抵抗是影響NPC放療效果的關(guān)鍵因素，它導(dǎo)致腫瘤局部復(fù)發(fā)，成為治療成功的主要障礙。p53基因作為一種重要的抑瘤基因，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及治療過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它參與DNA損傷后的修復(fù)過(guò)程，能夠調(diào)控DNA損傷所觸發(fā)的細(xì)胞周期運(yùn)行以及細(xì)胞凋亡，進(jìn)而介導(dǎo)腫瘤的放射生物學(xué)效應(yīng)。正常功能的p53基因可使腫瘤細(xì)胞周期阻滯，抑制腫瘤細(xì)胞放射損傷的修復(fù)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)放療的敏感性。而功能失活的p53基因則無(wú)法發(fā)揮這些作用，導(dǎo)致腫瘤對(duì)放射敏感性降低，甚至產(chǎn)生放射抗拒。研究顯示，60%以上的NPC組織和幾乎100%的NPC細(xì)胞株存在p53蛋白過(guò)表達(dá)的情況，并且NPC中過(guò)表達(dá)的p53蛋白功能可能異常或失活。但截至目前，NPC中過(guò)表達(dá)的p53蛋白對(duì)NPC放療敏感性是否存在影響尚不明確，p53蛋白介導(dǎo)NPC放射應(yīng)答的機(jī)制也有待進(jìn)一步深入闡明。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探討p53介導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞放射生物學(xué)效應(yīng)的相關(guān)機(jī)制，具體目的如下：其一，通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察過(guò)表達(dá)的p53蛋白對(duì)鼻咽癌細(xì)胞放射敏感性的影響，明確p53蛋白在鼻咽癌放療過(guò)程中的具體作用方向，為后續(xù)研究提供直接的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。其二，運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，全面系統(tǒng)地尋找與p53介導(dǎo)放療敏感性相關(guān)的蛋白質(zhì)，從蛋白質(zhì)層面揭示p53參與鼻咽癌放射應(yīng)答的分子機(jī)制。本研究具有重要的理論和實(shí)踐意義。在理論方面，深入探究p53介導(dǎo)NPC放射應(yīng)答的機(jī)制，有助于我們更全面、深入地理解鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制以及放療過(guò)程中腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為變化，豐富和完善腫瘤放射生物學(xué)理論體系，為后續(xù)相關(guān)研究提供新的思路和方向。在實(shí)踐應(yīng)用中，明確p53蛋白對(duì)NPC放療敏感性的影響以及相關(guān)作用機(jī)制，能夠?yàn)楸茄拾┑呐R床治療提供更精準(zhǔn)的理論指導(dǎo)，為開(kāi)發(fā)新的放療增敏策略和藥物靶點(diǎn)提供有力的實(shí)驗(yàn)支持，從而提高鼻咽癌的放療效果，改善患者的預(yù)后，具有重大的臨床應(yīng)用價(jià)值和社會(huì)意義。1.3研究方法與技術(shù)路線本研究采用的方法涵蓋細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、蛋白質(zhì)組學(xué)分析以及分子生物學(xué)驗(yàn)證等多個(gè)層面。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方面，選用穩(wěn)定沉默p53基因表達(dá)的NPC細(xì)胞株CNE2sip53和對(duì)照細(xì)胞株CNE2/pSUPER作為研究對(duì)象。運(yùn)用集落存活分析法，在不同放射劑量照射后，精確檢測(cè)細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)（SF），并進(jìn)一步計(jì)算放射生物學(xué)參數(shù)D0、α、β和放射敏感增強(qiáng)比（SER），以此評(píng)估細(xì)胞的放射敏感性變化。通過(guò)MTT法，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)放射線對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，直觀呈現(xiàn)細(xì)胞在放射處理后的增殖情況。借助流式細(xì)胞術(shù)和Hoechst33342染色技術(shù)，深入分析放射線對(duì)細(xì)胞周期及凋亡的調(diào)控作用，從細(xì)胞周期分布和凋亡率變化等角度揭示細(xì)胞對(duì)放射的生物學(xué)應(yīng)答機(jī)制。在蛋白質(zhì)組學(xué)分析中，運(yùn)用雙向凝膠電泳（2-DE）技術(shù)，對(duì)CNE2sip53以及CNE2/pSUPER細(xì)胞在放射前后的蛋白質(zhì)進(jìn)行全面分離，將復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物按照等電點(diǎn)和分子量的差異在二維平面上展開(kāi)，形成高分辨率的蛋白質(zhì)圖譜。隨后，利用PDQuest圖像分析軟件，仔細(xì)識(shí)別CNE2sip53以及CNE2/pSUPER細(xì)胞放射前后的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，這些差異點(diǎn)可能蘊(yùn)含著p53介導(dǎo)放療敏感性的關(guān)鍵信息。對(duì)于篩選出的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）進(jìn)行精確鑒定，通過(guò)測(cè)定蛋白質(zhì)肽段的質(zhì)量指紋圖譜，與數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知蛋白質(zhì)信息進(jìn)行比對(duì)，確定蛋白質(zhì)的種類(lèi)和身份。為了進(jìn)一步驗(yàn)證蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果的可靠性，采用Westernblot技術(shù)對(duì)差異蛋白質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證。針對(duì)篩選出的HSP70、Tcp-1β、AnnexinA2和14-3-3θ等差異蛋白質(zhì)，通過(guò)特異性抗體檢測(cè)它們?cè)贑NE2sip53以及CNE2/pSUPER細(xì)胞放射前后的表達(dá)水平變化，從蛋白質(zhì)表達(dá)量的層面為蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果提供有力支持。技術(shù)路線圖如下：首先進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，將穩(wěn)定沉默p53基因表達(dá)的NPC細(xì)胞株CNE2sip53和對(duì)照細(xì)胞株CNE2/pSUPER分別在適宜條件下培養(yǎng)，使其處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供充足的細(xì)胞來(lái)源。接著進(jìn)行放射處理，對(duì)培養(yǎng)好的兩組細(xì)胞分別給予不同劑量的放射線照射，模擬鼻咽癌放療的實(shí)際情況，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生放射生物學(xué)效應(yīng)。之后，一方面開(kāi)展細(xì)胞放射生物學(xué)特性檢測(cè)，按照上述集落存活分析法、MTT法、流式細(xì)胞術(shù)和Hoechst33342染色等方法，對(duì)細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)、生長(zhǎng)情況、周期分布和凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)和分析，獲取細(xì)胞在放射處理后的生物學(xué)變化數(shù)據(jù)。另一方面進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，先利用雙向凝膠電泳技術(shù)分離細(xì)胞放射前后的蛋白質(zhì)，再通過(guò)PDQuest圖像分析軟件識(shí)別差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，最后用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定差異蛋白質(zhì)。最后，選取部分差異蛋白質(zhì)，運(yùn)用Westernblot技術(shù)驗(yàn)證其在兩組細(xì)胞放射前后的表達(dá)水平，綜合各方面實(shí)驗(yàn)結(jié)果，深入探討p53介導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞放射生物學(xué)效應(yīng)的機(jī)制。二、鼻咽癌與P53基因的研究現(xiàn)狀2.1鼻咽癌概述鼻咽癌（NasopharyngealCarcinoma，NPC）是一種原發(fā)于鼻咽黏膜上皮的惡性腫瘤，具有顯著的地域分布差異。在全球范圍內(nèi)，NPC的發(fā)病率呈現(xiàn)出明顯的不均衡態(tài)勢(shì)，中國(guó)南方地區(qū)以及東南亞部分國(guó)家是NPC的高發(fā)區(qū)域，這些地區(qū)的發(fā)病率遠(yuǎn)高于其他地區(qū)。在中國(guó)，NPC的發(fā)病具有明顯的地域聚集性，廣東、廣西、福建等地的發(fā)病率居全國(guó)前列，其中廣東地區(qū)尤為突出，故鼻咽癌又被稱為“廣東癌”。據(jù)統(tǒng)計(jì)，廣東部分高發(fā)地區(qū)的NPC發(fā)病率可達(dá)30-50/10萬(wàn)，是世界平均發(fā)病率的數(shù)倍。NPC的發(fā)病與多種因素密切相關(guān)。EB病毒（Epstein-BarrVirus）感染被認(rèn)為是NPC發(fā)生的重要致病因素之一。大量研究表明，幾乎所有的NPC組織中都能檢測(cè)到EB病毒的存在，且病毒的某些基因表達(dá)產(chǎn)物與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過(guò)程密切相關(guān)。遺傳因素在NPC的發(fā)病中也起著關(guān)鍵作用，NPC具有明顯的家族聚集傾向，家族中若有NPC患者，其親屬的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。研究發(fā)現(xiàn)，某些基因的突變或多態(tài)性與NPC的易感性相關(guān)，如HLA基因、P53基因等。環(huán)境因素也是NPC發(fā)病的重要影響因素，長(zhǎng)期食用腌制食品、接觸化學(xué)致癌物等都可能增加NPC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。腌制食品中含有大量的亞硝胺類(lèi)化合物，這類(lèi)物質(zhì)具有較強(qiáng)的致癌性，可能通過(guò)誘導(dǎo)基因突變等方式促進(jìn)NPC的發(fā)生發(fā)展。NPC的臨床癥狀多樣，早期癥狀往往不明顯，容易被忽視。隨著腫瘤的進(jìn)展，患者可能出現(xiàn)多種癥狀。涕中帶血是NPC較為常見(jiàn)的早期癥狀之一，表現(xiàn)為鼻涕中帶有血絲，尤其是在晨起時(shí)更為明顯。鼻塞也是常見(jiàn)癥狀，多為單側(cè)鼻塞，隨著腫瘤的增大，可發(fā)展為雙側(cè)鼻塞。耳鳴、耳悶堵感及聽(tīng)力下降也是NPC的常見(jiàn)表現(xiàn)，這是由于腫瘤壓迫咽鼓管，導(dǎo)致中耳腔通氣引流障礙所致。當(dāng)腫瘤侵犯眼部時(shí)，可引起復(fù)視、視力下降等癥狀；侵犯腦神經(jīng)時(shí)，可導(dǎo)致頭痛、面部麻木、吞咽困難等癥狀。放射治療是NPC的主要治療手段，這是基于NPC對(duì)放射線具有較高的敏感性，且鼻咽部位置特殊，周?chē)匾Y(jié)構(gòu)眾多，手術(shù)難度大、風(fēng)險(xiǎn)高，放療能夠在有效控制腫瘤的同時(shí)，最大程度地減少對(duì)周?chē)＝M織的損傷。對(duì)于早期NPC患者，單純放療即可取得較好的治療效果，5年生存率可達(dá)80%以上。然而，對(duì)于中晚期NPC患者，放療的效果往往不盡人意，5年生存率僅在40-50%左右。這主要是因?yàn)橹型砥谀[瘤體積較大，癌細(xì)胞可能已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移，且腫瘤細(xì)胞對(duì)放療的敏感性降低，容易出現(xiàn)放療抵抗。放療抵抗是影響NPC放療效果的關(guān)鍵因素之一，它導(dǎo)致腫瘤局部復(fù)發(fā)，成為治療成功的主要障礙。放療抵抗的發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜，涉及腫瘤細(xì)胞的內(nèi)在特性、腫瘤微環(huán)境以及信號(hào)傳導(dǎo)通路等多個(gè)方面。腫瘤細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)能力增強(qiáng)、細(xì)胞周期調(diào)控異常、凋亡抑制等都可能導(dǎo)致放療抵抗的發(fā)生。2.2P53基因結(jié)構(gòu)與功能p53基因位于人類(lèi)17號(hào)染色體短臂（17p13.1），其基因結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，全長(zhǎng)約20kb，包含11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子。這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)使其能夠精確地調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，在細(xì)胞的生命活動(dòng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。p53基因編碼一種分子量約為53kDa的蛋白質(zhì)，即p53蛋白，該蛋白由393個(gè)氨基酸殘基組成，具有多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，每個(gè)結(jié)構(gòu)域都承擔(dān)著獨(dú)特的生物學(xué)功能。N端是轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（TransactivationDomain，TAD），包含約1-42位氨基酸殘基。這一結(jié)構(gòu)域在p53蛋白發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能中起著至關(guān)重要的作用，它能夠與轉(zhuǎn)錄因子如TFIID等相互作用，招募相關(guān)的轉(zhuǎn)錄機(jī)器，啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，從而調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡、DNA修復(fù)等重要生物學(xué)過(guò)程。DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA-bindingDomain，DBD）位于p53蛋白的核心區(qū)域，由大約102-292位氨基酸殘基構(gòu)成。此結(jié)構(gòu)域具有高度的保守性，它能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的p53反應(yīng)元件（p53-responsiveelement，p53RE），通過(guò)與DNA的相互作用，精確地調(diào)控基因的表達(dá)，是p53蛋白行使其生物學(xué)功能的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。寡聚化結(jié)構(gòu)域（OligomerizationDomain，OD）由323-356位氨基酸殘基組成，它介導(dǎo)p53蛋白形成四聚體結(jié)構(gòu)。p53蛋白只有形成四聚體才能有效地結(jié)合DNA，發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，這種寡聚化機(jī)制對(duì)于p53蛋白功能的正常發(fā)揮具有重要意義，保證了p53蛋白在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的精準(zhǔn)作用。C端是調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，包含363-393位氨基酸殘基。這一結(jié)構(gòu)域參與p53蛋白活性的調(diào)節(jié)，通過(guò)磷酸化、乙酰化等翻譯后修飾方式，影響p53蛋白與其他蛋白質(zhì)的相互作用以及其與DNA的結(jié)合能力，進(jìn)而對(duì)p53蛋白的功能進(jìn)行精細(xì)調(diào)控，使p53蛋白能夠根據(jù)細(xì)胞的生理狀態(tài)和外界刺激做出準(zhǔn)確的反應(yīng)。野生型p53基因在維持細(xì)胞基因組穩(wěn)定性、抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著核心作用，被譽(yù)為“基因組衛(wèi)士”。當(dāng)細(xì)胞受到諸如DNA損傷、氧化應(yīng)激、缺氧等各種應(yīng)激刺激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的p53蛋白水平會(huì)迅速升高，其活性也會(huì)被激活。激活后的p53蛋白主要通過(guò)以下幾種方式發(fā)揮作用：在細(xì)胞周期調(diào)控方面，p53蛋白能夠誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯。當(dāng)DNA損傷發(fā)生時(shí)，p53蛋白可以通過(guò)激活p21基因的表達(dá)，p21蛋白能夠與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（Cyclin-DependentKinase，CDK）結(jié)合，抑制CDK的活性，從而使細(xì)胞周期停滯在G1期或G2期，為細(xì)胞提供足夠的時(shí)間來(lái)修復(fù)受損的DNA，確保細(xì)胞在DNA損傷修復(fù)完成后再進(jìn)入下一個(gè)細(xì)胞周期階段，避免攜帶錯(cuò)誤DNA信息的細(xì)胞繼續(xù)增殖，維持了細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性。在DNA損傷修復(fù)方面，p53蛋白能夠促進(jìn)DNA修復(fù)機(jī)制的啟動(dòng)。它可以上調(diào)一些參與DNA修復(fù)的基因表達(dá)，如GADD45等，這些基因編碼的蛋白質(zhì)能夠直接參與DNA損傷的修復(fù)過(guò)程，幫助細(xì)胞修復(fù)受損的DNA，降低基因突變的風(fēng)險(xiǎn)，從而有效地抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)方面，當(dāng)DNA損傷嚴(yán)重且無(wú)法修復(fù)時(shí)，p53蛋白會(huì)激活一系列凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，如BAX、PUMA等。BAX蛋白能夠在線粒體外膜上形成孔道，導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)而激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引發(fā)細(xì)胞凋亡；PUMA蛋白則通過(guò)與抗凋亡蛋白Bcl-2家族成員結(jié)合，解除其對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。通過(guò)這種方式，p53蛋白能夠及時(shí)清除受損嚴(yán)重、可能發(fā)生癌變的細(xì)胞，保護(hù)機(jī)體免受腫瘤的侵害。然而，當(dāng)p53基因發(fā)生突變時(shí)，其編碼的p53蛋白功能會(huì)發(fā)生改變，產(chǎn)生突變型p53蛋白。突變型p53蛋白不僅失去了野生型p53蛋白的抑癌功能，還可能獲得一些新的促癌功能，成為腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要推動(dòng)因素。p53基因的突變類(lèi)型多樣，包括點(diǎn)突變、缺失突變、插入突變等，其中點(diǎn)突變最為常見(jiàn)。點(diǎn)突變通常發(fā)生在DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，導(dǎo)致p53蛋白無(wú)法正常識(shí)別和結(jié)合p53反應(yīng)元件，從而喪失對(duì)下游基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控能力。突變型p53蛋白還可能通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。它可以與野生型p53蛋白形成異源四聚體，抑制野生型p53蛋白的功能，這種現(xiàn)象被稱為顯性負(fù)效應(yīng)；突變型p53蛋白還可能直接與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)控一些與細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移；突變型p53蛋白還能夠影響細(xì)胞的代謝過(guò)程，為腫瘤細(xì)胞的快速增殖提供能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。2.3P53與腫瘤放射敏感性的關(guān)系p53基因在腫瘤放射生物學(xué)效應(yīng)中扮演著核心角色，其功能狀態(tài)直接決定了腫瘤細(xì)胞對(duì)放射線的敏感性，深刻影響著腫瘤放療的療效。當(dāng)腫瘤細(xì)胞遭受放射線照射時(shí)，DNA會(huì)受到不同程度的損傷，這一損傷信號(hào)會(huì)迅速激活細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制，而p53基因正是這一機(jī)制中的關(guān)鍵調(diào)控節(jié)點(diǎn)。在DNA損傷修復(fù)過(guò)程中，p53基因發(fā)揮著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用。正常功能的p53蛋白能夠精準(zhǔn)識(shí)別受損的DNA，通過(guò)一系列復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)通路，激活相關(guān)的DNA修復(fù)基因，如GADD45、PCNA等。GADD45蛋白能夠與受損的DNA結(jié)合，招募核酸內(nèi)切酶等修復(fù)因子，直接參與DNA損傷的切除修復(fù)過(guò)程；PCNA則在DNA復(fù)制和修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要的輔助作用，促進(jìn)DNA聚合酶的活性，確保受損DNA能夠準(zhǔn)確無(wú)誤地進(jìn)行修復(fù)。通過(guò)這些基因的協(xié)同作用，p53蛋白能夠高效地促進(jìn)DNA損傷的修復(fù)，維持細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性，為細(xì)胞在遭受放射損傷后的正常生存和增殖提供保障。細(xì)胞周期調(diào)控是p53基因介導(dǎo)腫瘤放射生物學(xué)效應(yīng)的另一個(gè)重要方面。當(dāng)細(xì)胞受到放射線照射后，p53蛋白會(huì)根據(jù)DNA損傷的程度，精細(xì)地調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)程。若DNA損傷較輕，p53蛋白會(huì)激活p21基因的表達(dá)，p21蛋白能夠與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）和細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）形成的復(fù)合物結(jié)合，抑制CDK的活性，從而使細(xì)胞周期停滯在G1期。在G1期，細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)DNA損傷修復(fù)機(jī)制，對(duì)受損的DNA進(jìn)行修復(fù)，待修復(fù)完成后，細(xì)胞再進(jìn)入S期進(jìn)行DNA復(fù)制，從而避免了攜帶錯(cuò)誤DNA信息的細(xì)胞進(jìn)入分裂階段，降低了基因突變和腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。若DNA損傷嚴(yán)重且無(wú)法修復(fù)，p53蛋白則會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在G2期，同時(shí)激活下游的凋亡相關(guān)基因，促使細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序，及時(shí)清除受損嚴(yán)重的細(xì)胞，防止其發(fā)生癌變。細(xì)胞凋亡是腫瘤細(xì)胞對(duì)放射線的一種重要應(yīng)答方式，p53基因在這一過(guò)程中起著關(guān)鍵的誘導(dǎo)作用。當(dāng)腫瘤細(xì)胞受到放射線照射后，若DNA損傷無(wú)法有效修復(fù)，p53蛋白會(huì)通過(guò)多條信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。p53蛋白可以上調(diào)促凋亡基因BAX、PUMA等的表達(dá)，BAX蛋白能夠在線粒體外膜上形成孔道，導(dǎo)致細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）、dATP等結(jié)合，形成凋亡小體，進(jìn)而激活caspase-9，引發(fā)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；PUMA蛋白則通過(guò)與抗凋亡蛋白Bcl-2家族成員結(jié)合，解除其對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。p53蛋白還可以直接作用于線粒體，改變線粒體的膜電位，促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序。通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，p53蛋白能夠有效地清除受損嚴(yán)重、可能發(fā)生癌變的腫瘤細(xì)胞，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)放射線的敏感性，提高放療的療效。當(dāng)p53基因發(fā)生突變或功能失活時(shí)，腫瘤細(xì)胞的放射敏感性會(huì)顯著降低，這給腫瘤的放療帶來(lái)了極大的挑戰(zhàn)。突變型p53蛋白無(wú)法正常識(shí)別和結(jié)合DNA損傷位點(diǎn)，導(dǎo)致DNA損傷修復(fù)機(jī)制無(wú)法及時(shí)啟動(dòng)，受損的DNA無(wú)法得到有效修復(fù)，使得腫瘤細(xì)胞在放射治療后仍能繼續(xù)存活和增殖。突變型p53蛋白還會(huì)干擾細(xì)胞周期的正常調(diào)控，使細(xì)胞無(wú)法在DNA損傷時(shí)停滯在相應(yīng)的細(xì)胞周期階段進(jìn)行修復(fù)，而是繼續(xù)進(jìn)入分裂過(guò)程，增加了基因突變和染色體異常的風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)一步促進(jìn)了腫瘤的發(fā)展和放療抵抗的產(chǎn)生。在細(xì)胞凋亡方面，突變型p53蛋白失去了誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力，無(wú)法及時(shí)清除受損嚴(yán)重的腫瘤細(xì)胞，使得腫瘤細(xì)胞對(duì)放射線產(chǎn)生抵抗，放療效果大打折扣。研究表明，在多種腫瘤中，p53基因的突變與放療抵抗密切相關(guān)，突變型p53蛋白的表達(dá)水平越高，腫瘤細(xì)胞的放射敏感性越低，患者的預(yù)后越差。2.4鼻咽癌中P53蛋白的研究現(xiàn)狀在鼻咽癌的研究領(lǐng)域中，P53蛋白的表達(dá)情況及功能狀態(tài)備受關(guān)注。大量研究數(shù)據(jù)表明，60%以上的NPC組織以及幾乎100%的NPC細(xì)胞株中存在P53蛋白過(guò)表達(dá)的現(xiàn)象。這種過(guò)表達(dá)在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能扮演著關(guān)鍵角色，但目前其具體作用機(jī)制尚未完全明晰。有研究推測(cè)，P53蛋白過(guò)表達(dá)可能是細(xì)胞對(duì)某些異常刺激的一種應(yīng)激反應(yīng)，試圖通過(guò)增加P53蛋白的量來(lái)啟動(dòng)細(xì)胞的自我保護(hù)機(jī)制，如誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯或凋亡，以防止細(xì)胞進(jìn)一步惡變。然而，在鼻咽癌中，過(guò)表達(dá)的P53蛋白卻常常出現(xiàn)功能異?；蚴Щ畹那闆r。這可能是由于P53基因發(fā)生突變，導(dǎo)致其編碼的P53蛋白結(jié)構(gòu)改變，無(wú)法正常行使其生物學(xué)功能。突變類(lèi)型多樣，包括點(diǎn)突變、缺失突變等，其中點(diǎn)突變多發(fā)生在P53蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，使得P53蛋白與DNA的結(jié)合能力下降，難以激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而失去對(duì)細(xì)胞周期、凋亡和DNA修復(fù)等過(guò)程的調(diào)控能力。鼻咽癌中P53蛋白功能異?；蚴Щ畹暮蠊謬?yán)重。在細(xì)胞周期調(diào)控方面，正常的P53蛋白可以在DNA損傷時(shí)將細(xì)胞周期阻滯在G1期，以便細(xì)胞有足夠時(shí)間修復(fù)損傷的DNA。但功能異常的P53蛋白無(wú)法發(fā)揮這一作用，導(dǎo)致細(xì)胞在DNA損傷的情況下仍繼續(xù)進(jìn)入S期進(jìn)行DNA復(fù)制，增加了基因突變的風(fēng)險(xiǎn)，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖和惡性轉(zhuǎn)化。在細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)方面，功能失活的P53蛋白不能有效激活凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，使得受損的腫瘤細(xì)胞無(wú)法及時(shí)凋亡，從而逃避了機(jī)體的免疫監(jiān)視和清除機(jī)制，為腫瘤的生長(zhǎng)和擴(kuò)散提供了條件。在DNA損傷修復(fù)方面，P53蛋白功能異常會(huì)導(dǎo)致相關(guān)修復(fù)基因無(wú)法正常表達(dá)，細(xì)胞對(duì)放射線等因素造成的DNA損傷修復(fù)能力下降，使得腫瘤細(xì)胞在放療過(guò)程中更容易存活下來(lái)，產(chǎn)生放療抵抗。盡管目前對(duì)于鼻咽癌中P53蛋白的表達(dá)和功能異常有了一定的認(rèn)識(shí)，但關(guān)于P53蛋白對(duì)鼻咽癌放療敏感性的影響，仍然存在許多研究空白。目前尚不清楚過(guò)表達(dá)的P53蛋白在功能異?；蚴Щ畹那闆r下，是否會(huì)直接影響鼻咽癌對(duì)放療的敏感性。有研究認(rèn)為，突變型P53蛋白可能通過(guò)干擾正常的信號(hào)傳導(dǎo)通路，降低腫瘤細(xì)胞對(duì)放射線的敏感性，使放療效果變差。但也有研究指出，P53蛋白可能通過(guò)其他未知的機(jī)制間接影響放療敏感性，比如通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞與周?chē)?xì)胞的相互作用，進(jìn)而影響放療效果。關(guān)于P53蛋白介導(dǎo)鼻咽癌放射應(yīng)答的具體分子機(jī)制，目前也缺乏深入的研究。P53蛋白在細(xì)胞內(nèi)參與了眾多復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，其與其他蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系尚未完全明確。進(jìn)一步深入研究鼻咽癌中P53蛋白的功能及作用機(jī)制，對(duì)于揭示鼻咽癌的放療抵抗機(jī)制，提高放療效果具有重要的理論和實(shí)踐意義。三、蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)及其在腫瘤研究中的應(yīng)用3.1蛋白質(zhì)組學(xué)的概念與研究?jī)?nèi)容蛋白質(zhì)組學(xué)（Proteomics）的概念于1994年由澳大利亞科學(xué)家MarcWilkins首次提出，它是指對(duì)由一個(gè)基因組（Genome），或一個(gè)細(xì)胞、組織表達(dá)的所有蛋白質(zhì)（protein）進(jìn)行系統(tǒng)研究的學(xué)科。蛋白質(zhì)組這一概念與基因組概念有著顯著的區(qū)別?；蚪M在生物體的不同細(xì)胞和組織中通常是相對(duì)穩(wěn)定的，除非發(fā)生基因突變等異常情況，其DNA序列基本保持不變。而蛋白質(zhì)組則具有高度的動(dòng)態(tài)性，它會(huì)隨著細(xì)胞的生理狀態(tài)、發(fā)育階段、所處環(huán)境以及外界刺激等因素的變化而發(fā)生顯著改變。在細(xì)胞受到外界應(yīng)激刺激時(shí)，如放射線照射、化學(xué)物質(zhì)處理等，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的表達(dá)譜會(huì)迅速發(fā)生變化，一些蛋白質(zhì)的表達(dá)量會(huì)顯著上調(diào)或下調(diào)，同時(shí)還可能出現(xiàn)新的蛋白質(zhì)翻譯后修飾形式。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究?jī)?nèi)容豐富多樣，涵蓋了多個(gè)重要方面。首先是蛋白質(zhì)表達(dá)譜的研究，這是蛋白質(zhì)組學(xué)的基礎(chǔ)內(nèi)容之一。通過(guò)各種先進(jìn)的技術(shù)手段，如雙向凝膠電泳（2-DE）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）等，對(duì)細(xì)胞或組織在特定條件下表達(dá)的所有蛋白質(zhì)進(jìn)行全面、系統(tǒng)的分離和鑒定，繪制出蛋白質(zhì)表達(dá)譜。雙向凝膠電泳技術(shù)利用蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量差異，將復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物在二維平面上進(jìn)行分離，形成具有特定位置和強(qiáng)度的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)圖譜，通過(guò)對(duì)這些圖譜的分析，可以直觀地了解不同蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)則是先通過(guò)液相色譜將蛋白質(zhì)分離成單個(gè)組分，然后將這些組分依次送入質(zhì)譜儀進(jìn)行分析，根據(jù)質(zhì)譜圖中肽段的質(zhì)量和電荷信息，鑒定蛋白質(zhì)的種類(lèi)和序列。通過(guò)研究蛋白質(zhì)表達(dá)譜，能夠全面了解細(xì)胞或組織在不同生理病理狀態(tài)下蛋白質(zhì)表達(dá)的變化規(guī)律，為揭示疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供重要線索。翻譯后修飾的研究也是蛋白質(zhì)組學(xué)的關(guān)鍵內(nèi)容。蛋白質(zhì)在合成后，往往會(huì)經(jīng)歷多種翻譯后修飾過(guò)程，如磷酸化、糖基化、乙酰化、甲基化等。這些修飾過(guò)程能夠顯著改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、活性、定位以及與其他分子的相互作用，進(jìn)而對(duì)蛋白質(zhì)的功能產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。磷酸化修飾是一種常見(jiàn)且重要的翻譯后修飾方式，它通過(guò)在蛋白質(zhì)的特定氨基酸殘基上添加磷酸基團(tuán)，改變蛋白質(zhì)的電荷狀態(tài)和空間構(gòu)象，從而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的活性和功能。在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路中，許多蛋白質(zhì)的磷酸化修飾是信號(hào)傳遞的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，通過(guò)磷酸化和去磷酸化的動(dòng)態(tài)平衡，精確調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化等生理過(guò)程。蛋白質(zhì)的糖基化修飾則與蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、識(shí)別、定位以及細(xì)胞間的相互作用密切相關(guān)，在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中，糖蛋白的糖基化修飾變化起著重要作用。深入研究蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，有助于揭示蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的精細(xì)調(diào)控機(jī)制以及在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的研究同樣是蛋白質(zhì)組學(xué)的核心內(nèi)容之一。細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)并非孤立存在，它們通過(guò)相互作用形成復(fù)雜的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，共同參與細(xì)胞的各種生理活動(dòng)。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用在細(xì)胞的代謝、信號(hào)傳導(dǎo)、基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控等重要過(guò)程中發(fā)揮著不可或缺的作用。酵母雙雜交系統(tǒng)是一種經(jīng)典的研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)，它利用酵母細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄激活機(jī)制，通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)情況，判斷兩個(gè)蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。免疫共沉淀技術(shù)則是利用抗原-抗體的特異性結(jié)合，將與目標(biāo)蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)共同沉淀下來(lái)，通過(guò)后續(xù)的質(zhì)譜分析等技術(shù)，鑒定相互作用的蛋白質(zhì)成分。通過(guò)研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，能夠深入了解細(xì)胞內(nèi)各種生理過(guò)程的分子機(jī)制，為藥物研發(fā)提供潛在的作用靶點(diǎn)。三、蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)及其在腫瘤研究中的應(yīng)用3.2蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主要技術(shù)3.2.1雙向凝膠電泳（2-DE）雙向凝膠電泳（Two-DimensionalGelElectrophoresis，2-DE）是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的經(jīng)典技術(shù)，在蛋白質(zhì)分離領(lǐng)域發(fā)揮著不可替代的重要作用。其原理基于蛋白質(zhì)的兩種重要物理性質(zhì)：等電點(diǎn)和分子量。在第一向電泳中，利用等電聚焦（IsoelectricFocusing，IEF）技術(shù)，依據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的差異進(jìn)行分離。等電點(diǎn)是指蛋白質(zhì)在某一pH值條件下，其所帶凈電荷為零，在電場(chǎng)中不再發(fā)生遷移。在IEF過(guò)程中，將蛋白質(zhì)樣品置于一個(gè)具有pH梯度的凝膠介質(zhì)中，當(dāng)施加電場(chǎng)時(shí)，蛋白質(zhì)會(huì)在凝膠中遷移，直至到達(dá)與其等電點(diǎn)相等的pH位置時(shí)停止移動(dòng)，從而實(shí)現(xiàn)不同等電點(diǎn)蛋白質(zhì)的初步分離。在第二向電泳中，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SodiumDodecylSulfate-PolyacrylamideGelElectrophoresis，SDS-PAGE）技術(shù)，按照蛋白質(zhì)分子量的大小進(jìn)行分離。SDS是一種陰離子去污劑，它能夠與蛋白質(zhì)分子緊密結(jié)合，使蛋白質(zhì)分子帶上大量的負(fù)電荷，并且消除蛋白質(zhì)分子間原有的電荷差異。在SDS-PAGE凝膠電泳中，蛋白質(zhì)分子在電場(chǎng)作用下，依據(jù)分子量的大小在凝膠中遷移，分子量小的蛋白質(zhì)遷移速度快，分子量較大的蛋白質(zhì)遷移速度慢，最終在凝膠上形成不同位置的條帶，從而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)按分子量的分離。2-DE的操作步驟較為復(fù)雜，需要嚴(yán)格控制各個(gè)環(huán)節(jié)。首先是樣品制備，這是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵前提。需要根據(jù)樣品來(lái)源（如細(xì)胞、組織等）的不同，選擇合適的裂解液，以確保蛋白質(zhì)的充分溶解和釋放，同時(shí)盡量減少蛋白質(zhì)的降解和修飾變化。裂解后的樣品通常需要進(jìn)行離心、過(guò)濾等預(yù)處理步驟，以去除雜質(zhì)和不溶性物質(zhì)。隨后進(jìn)行第一向等電聚焦電泳，將處理好的蛋白質(zhì)樣品加載到含有pH梯度的膠條上，在特定的電場(chǎng)條件下進(jìn)行聚焦分離。聚焦時(shí)間和電壓等參數(shù)需要根據(jù)樣品的復(fù)雜程度和蛋白質(zhì)的特性進(jìn)行優(yōu)化，以獲得最佳的分離效果。完成第一向電泳后，將膠條進(jìn)行平衡處理，使蛋白質(zhì)分子與SDS充分結(jié)合，然后轉(zhuǎn)移到第二向SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行電泳。在第二向電泳中，需要選擇合適濃度的聚丙烯酰胺凝膠，以適應(yīng)不同分子量范圍蛋白質(zhì)的分離。電泳結(jié)束后，對(duì)凝膠進(jìn)行染色處理，常用的染色方法包括考馬斯亮藍(lán)染色、銀染色和熒光染色等?？捡R斯亮藍(lán)染色操作簡(jiǎn)單、成本較低，但靈敏度相對(duì)較低；銀染色靈敏度高，能夠檢測(cè)到低豐度的蛋白質(zhì)，但染色過(guò)程較為繁瑣，且線性范圍較窄；熒光染色則具有靈敏度高、線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)，適用于定量分析，但需要特殊的熒光標(biāo)記和檢測(cè)設(shè)備。染色后的凝膠通過(guò)圖像掃描儀或凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描，獲取蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的圖像信息，再利用專門(mén)的圖像分析軟件（如PDQuest、ImageMaster等）對(duì)圖像進(jìn)行分析，識(shí)別蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的位置、強(qiáng)度和面積等參數(shù)，從而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的分離和初步分析。2-DE技術(shù)具有顯著的優(yōu)點(diǎn)，其分辨率較高，在理想條件下，一塊16cm×20cm的凝膠板可分辨出3000-10000個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，能夠有效分離復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物中的眾多蛋白質(zhì)組分。它的重復(fù)性較好，尤其是在采用固定化pH梯度（ImmobilizedpHGradients，IPG）膠條后，克服了傳統(tǒng)載體兩性電解質(zhì)陰極漂移等問(wèn)題，使等電聚焦的重復(fù)性和穩(wěn)定性得到極大提高。2-DE還能夠提供蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量信息，這些信息對(duì)于蛋白質(zhì)的鑒定和功能分析具有重要參考價(jià)值。然而，2-DE也存在一些局限性。它對(duì)低豐度蛋白的檢測(cè)能力較弱，由于低豐度蛋白在樣品中的含量極少，其信號(hào)容易被高豐度蛋白掩蓋，導(dǎo)致難以被檢測(cè)和分析。對(duì)于極酸或極堿蛋白、極大（＞200kD）或極?。ǎ?0kD）蛋白以及難溶蛋白（如膜蛋白）的分離效果不佳。2-DE的操作過(guò)程較為繁瑣，對(duì)實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員的要求較高，且實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，這些因素在一定程度上限制了其廣泛應(yīng)用。3.2.2質(zhì)譜技術(shù)（MS）質(zhì)譜技術(shù)（MassSpectrometry，MS）是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中用于蛋白質(zhì)鑒定的核心技術(shù)之一，其基本原理是將蛋白質(zhì)樣品離子化，使其轉(zhuǎn)化為氣態(tài)離子，然后根據(jù)不同離子的質(zhì)荷比（m/z）差異進(jìn)行分離和檢測(cè)，從而確定蛋白質(zhì)的分子量和結(jié)構(gòu)信息。在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，常用的質(zhì)譜離子化技術(shù)包括電噴霧電離（ElectrosprayIonization，ESI）和基質(zhì)輔助激光解吸電離（Matrix-AssistedLaserDesorptionIonization，MALDI）。電噴霧電離技術(shù)的原理基于電荷殘留模型。在電噴霧過(guò)程中，蛋白質(zhì)溶液通過(guò)一個(gè)帶有高電壓的毛細(xì)管?chē)婎^噴出，形成細(xì)小的帶電液滴。隨著溶劑的不斷蒸發(fā)，液滴逐漸變小，表面電荷密度不斷增加。當(dāng)液滴表面的庫(kù)侖斥力超過(guò)液滴的表面張力時(shí)，液滴會(huì)發(fā)生爆炸，產(chǎn)生更小的帶電液滴。這個(gè)過(guò)程不斷重復(fù)，最終使蛋白質(zhì)分子離子化，并以單電荷或多電荷離子的形式進(jìn)入質(zhì)譜儀的質(zhì)量分析器。電噴霧電離技術(shù)能夠產(chǎn)生多電荷離子，這使得大分子蛋白質(zhì)的質(zhì)荷比能夠處于質(zhì)譜儀的可檢測(cè)范圍內(nèi)，大大提高了質(zhì)譜儀對(duì)蛋白質(zhì)的檢測(cè)能力。而且，它適用于與液相色譜等分離技術(shù)聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物的在線分離和分析?；|(zhì)輔助激光解吸電離技術(shù)則是將蛋白質(zhì)樣品與過(guò)量的小分子基質(zhì)混合，然后將混合物點(diǎn)樣在金屬靶板上，待溶劑揮發(fā)后，形成蛋白質(zhì)-基質(zhì)共結(jié)晶。當(dāng)用高強(qiáng)度的激光脈沖照射靶板時(shí)，基質(zhì)分子吸收激光能量，迅速升溫并發(fā)生解吸和電離，同時(shí)將能量傳遞給蛋白質(zhì)分子，使蛋白質(zhì)分子也被解吸并離子化。基質(zhì)輔助激光解吸電離技術(shù)能夠在溫和的條件下使蛋白質(zhì)分子離子化，減少了蛋白質(zhì)分子的碎片化，適合分析大分子蛋白質(zhì)。它產(chǎn)生的離子主要為單電荷離子，質(zhì)譜圖相對(duì)簡(jiǎn)單，易于解析。常見(jiàn)的質(zhì)譜類(lèi)型有很多，其中飛行時(shí)間質(zhì)譜（Time-of-FlightMassSpectrometry，TOF-MS）應(yīng)用較為廣泛。在TOF-MS中，離子在電場(chǎng)的作用下獲得相同的動(dòng)能，然后進(jìn)入無(wú)場(chǎng)飛行管中飛行。由于不同質(zhì)荷比的離子飛行速度不同，質(zhì)荷比越小的離子飛行速度越快，通過(guò)測(cè)量離子從離子源到達(dá)檢測(cè)器的飛行時(shí)間，就可以計(jì)算出離子的質(zhì)荷比，從而確定蛋白質(zhì)的分子量。TOF-MS具有高分辨率、高靈敏度和寬質(zhì)量檢測(cè)范圍等優(yōu)點(diǎn)，能夠快速準(zhǔn)確地測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量，適用于蛋白質(zhì)的初步鑒定。串聯(lián)質(zhì)譜（TandemMassSpectrometry，MS/MS）是在MS的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的更高級(jí)的質(zhì)譜技術(shù)。在MS/MS分析中，首先通過(guò)一級(jí)質(zhì)譜選擇特定的母離子，然后將母離子引入碰撞室，與惰性氣體（如氬氣）發(fā)生碰撞，使母離子發(fā)生裂解，產(chǎn)生一系列的碎片離子。這些碎片離子再進(jìn)入二級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行分析，根據(jù)碎片離子的質(zhì)荷比和相對(duì)豐度，可以推斷出蛋白質(zhì)的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)信息。MS/MS技術(shù)對(duì)于蛋白質(zhì)的鑒定具有重要意義，它能夠提供蛋白質(zhì)的氨基酸序列信息，通過(guò)與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行比對(duì)，可以準(zhǔn)確地鑒定蛋白質(zhì)的種類(lèi)和身份。在蛋白質(zhì)鑒定中，質(zhì)譜技術(shù)的應(yīng)用主要包括肽質(zhì)量指紋圖譜（PeptideMassFingerprinting，PMF）分析和串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)序分析。PMF分析是將蛋白質(zhì)酶解成肽段，然后用質(zhì)譜測(cè)定這些肽段的精確質(zhì)量，得到肽質(zhì)量指紋圖譜。將得到的圖譜與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中理論酶解肽段的質(zhì)量進(jìn)行比對(duì)，如果匹配度較高，則可以初步鑒定蛋白質(zhì)。這種方法適用于已知蛋白質(zhì)的鑒定，具有快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)序分析則是利用MS/MS技術(shù)獲得肽段的氨基酸序列信息，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索或從頭測(cè)序的方法，確定蛋白質(zhì)的序列和結(jié)構(gòu)。這種方法對(duì)于未知蛋白質(zhì)的鑒定具有重要作用，能夠提供更詳細(xì)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息。質(zhì)譜技術(shù)具有高靈敏度、高分辨率和快速分析等優(yōu)勢(shì)，能夠準(zhǔn)確地鑒定蛋白質(zhì)，為蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了關(guān)鍵的技術(shù)支持。隨著質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展和創(chuàng)新，其在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用前景將更加廣闊。3.2.3其他相關(guān)技術(shù)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（LiquidChromatography-TandemMassSpectrometry，LC-MS/MS）是一種將液相色譜的高效分離能力與串聯(lián)質(zhì)譜的高靈敏度和高特異性相結(jié)合的技術(shù)，在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中發(fā)揮著重要作用。液相色譜能夠根據(jù)蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)（如疏水性、電荷等）對(duì)復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行分離，將其分成單個(gè)或少數(shù)幾個(gè)組分，然后依次將這些組分送入串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。在LC-MS/MS分析過(guò)程中，首先通過(guò)液相色譜的分離柱（如反相色譜柱）將蛋白質(zhì)混合物分離成不同的餾分，每個(gè)餾分中的蛋白質(zhì)在柱后被洗脫出來(lái)，并直接進(jìn)入質(zhì)譜儀的離子源進(jìn)行離子化。離子化后的蛋白質(zhì)離子經(jīng)過(guò)一級(jí)質(zhì)譜的質(zhì)量分析，選擇特定的母離子進(jìn)入二級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行裂解和分析，從而獲得蛋白質(zhì)的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)信息。LC-MS/MS技術(shù)具有分離效率高、分析速度快、靈敏度高和能夠處理復(fù)雜樣品等優(yōu)點(diǎn)。它可以對(duì)低豐度蛋白質(zhì)進(jìn)行有效檢測(cè)和鑒定，克服了雙向凝膠電泳在檢測(cè)低豐度蛋白方面的局限性。由于其分離和分析過(guò)程是在線進(jìn)行的，減少了樣品處理步驟，降低了樣品損失和污染的風(fēng)險(xiǎn)，提高了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。在大規(guī)模蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，LC-MS/MS技術(shù)能夠快速鑒定大量的蛋白質(zhì)，為蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了高效的分析手段。同位素編碼親和標(biāo)簽技術(shù)（Isotope-CodedAffinityTags，ICAT）是一種用于定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要技術(shù)。其原理是利用含有不同同位素標(biāo)記的親和標(biāo)簽試劑，分別與不同樣品中的半胱氨酸殘基共價(jià)結(jié)合。這些親和標(biāo)簽試劑由三部分組成：含有重氫或重氮同位素的質(zhì)量標(biāo)簽、生物素親和標(biāo)簽和能夠與半胱氨酸殘基特異性反應(yīng)的活性基團(tuán)。在標(biāo)記過(guò)程中，不同樣品中的蛋白質(zhì)經(jīng)裂解后，分別與輕、重同位素標(biāo)記的ICAT試劑反應(yīng)，使蛋白質(zhì)中的半胱氨酸殘基被標(biāo)記。然后將標(biāo)記后的不同樣品混合，經(jīng)過(guò)蛋白酶解、親和純化等步驟，富集含有ICAT標(biāo)記的肽段。由于輕、重同位素標(biāo)記的肽段在質(zhì)譜分析中的質(zhì)荷比不同，通過(guò)比較它們的峰強(qiáng)度，可以準(zhǔn)確地定量不同樣品中同一蛋白質(zhì)的表達(dá)水平差異。ICAT技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于它能夠?qū)?fù)雜生物樣品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行相對(duì)定量分析，在研究細(xì)胞生理狀態(tài)變化、疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中蛋白質(zhì)表達(dá)水平的改變等方面具有重要應(yīng)用價(jià)值。它可以減少實(shí)驗(yàn)誤差，提高定量分析的準(zhǔn)確性，并且能夠同時(shí)對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行分析，為蛋白質(zhì)組學(xué)的定量研究提供了有力的工具。然而，ICAT技術(shù)也存在一些局限性，它只能標(biāo)記含有半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)，對(duì)于不含半胱氨酸的蛋白質(zhì)則無(wú)法標(biāo)記和定量。ICAT試劑價(jià)格相對(duì)較高，實(shí)驗(yàn)操作步驟較為復(fù)雜，限制了其在一些實(shí)驗(yàn)室中的廣泛應(yīng)用。3.3蛋白質(zhì)組學(xué)在腫瘤研究中的應(yīng)用進(jìn)展在腫瘤生物標(biāo)志物篩選領(lǐng)域，蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)揮著關(guān)鍵作用。傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)方法存在諸多局限性，如靈敏度和特異性不足，容易導(dǎo)致漏診和誤診。而蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)憑借其高分辨率和高通量的優(yōu)勢(shì)，能夠全面系統(tǒng)地分析腫瘤組織與正常組織之間蛋白質(zhì)表達(dá)的差異，從而為腫瘤生物標(biāo)志物的篩選提供了全新的思路和方法。通過(guò)雙向凝膠電泳（2-DE）技術(shù)，能夠?qū)⒛[瘤組織和正常組織中的蛋白質(zhì)在二維平面上進(jìn)行分離，得到蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜。對(duì)比兩張圖譜，可以直觀地發(fā)現(xiàn)那些在腫瘤組織中特異性表達(dá)或表達(dá)量顯著改變的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)有可能成為潛在的腫瘤生物標(biāo)志物。結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)（MS）對(duì)這些差異蛋白質(zhì)進(jìn)行精確鑒定，確定其氨基酸序列和結(jié)構(gòu)信息，進(jìn)一步明確其在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制，為腫瘤的早期診斷和病情監(jiān)測(cè)提供有力的工具。在乳腺癌的研究中，利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)了多個(gè)潛在的生物標(biāo)志物，如乳腺珠蛋白（Mammaglobin）、組織蛋白酶D（CathepsinD）等。乳腺珠蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)水平明顯高于正常乳腺組織，且其表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度和預(yù)后密切相關(guān)。檢測(cè)乳腺珠蛋白的表達(dá)水平，有助于乳腺癌的早期診斷和病情評(píng)估，為臨床治療提供重要的參考依據(jù)。腫瘤發(fā)生機(jī)制的研究是腫瘤學(xué)領(lǐng)域的核心內(nèi)容，蛋白質(zhì)組學(xué)為深入探究這一復(fù)雜過(guò)程提供了有力的技術(shù)支持。腫瘤的發(fā)生是一個(gè)涉及多基因、多信號(hào)通路異常的復(fù)雜病理過(guò)程，而蛋白質(zhì)作為基因功能的直接執(zhí)行者，在腫瘤發(fā)生機(jī)制中扮演著關(guān)鍵角色。蛋白質(zhì)組學(xué)研究可以從整體水平上全面分析腫瘤細(xì)胞中蛋白質(zhì)的表達(dá)譜、翻譯后修飾以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用等信息，為揭示腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制提供全景式的視角。在肝癌的研究中，通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞中存在多種蛋白質(zhì)的表達(dá)異常，如熱休克蛋白（HSP）家族成員的高表達(dá)、某些凋亡相關(guān)蛋白的低表達(dá)等。HSP家族成員的高表達(dá)可能與肝癌細(xì)胞的抗凋亡能力增強(qiáng)、對(duì)化療藥物的耐藥性增加有關(guān)；而凋亡相關(guān)蛋白的低表達(dá)則可能導(dǎo)致肝癌細(xì)胞逃避機(jī)體的凋亡調(diào)控機(jī)制，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展。進(jìn)一步研究這些異常表達(dá)蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系以及它們所參與的信號(hào)傳導(dǎo)通路，有助于深入揭示肝癌的發(fā)生機(jī)制，為肝癌的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。在腫瘤治療靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)方面，蛋白質(zhì)組學(xué)同樣具有重要的應(yīng)用價(jià)值。傳統(tǒng)的腫瘤治療方法往往缺乏特異性，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常組織造成較大的損傷。尋找特異性的腫瘤治療靶點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)治療，是腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和發(fā)展方向。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)能夠通過(guò)對(duì)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞蛋白質(zhì)組的比較分析，篩選出那些在腫瘤細(xì)胞中特異性表達(dá)或功能異常的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)有可能成為潛在的腫瘤治療靶點(diǎn)。在肺癌的研究中，利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)了表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）在肺癌細(xì)胞中的高表達(dá)，且其激活與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。針對(duì)EGFR開(kāi)發(fā)的靶向治療藥物，如吉非替尼、厄洛替尼等，能夠特異性地抑制EGFR的活性，阻斷其下游的信號(hào)傳導(dǎo)通路，從而抑制肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，提高肺癌的治療效果。除了蛋白質(zhì)本身，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)也可以作為潛在的治療靶點(diǎn)。通過(guò)研究腫瘤細(xì)胞中蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的變化，找到那些在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)復(fù)合物或相互作用對(duì)，針對(duì)這些靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)相應(yīng)的抑制劑或調(diào)節(jié)劑，有望實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的精準(zhǔn)治療。四、實(shí)驗(yàn)材料與方法4.1實(shí)驗(yàn)材料4.1.1細(xì)胞株本實(shí)驗(yàn)選用穩(wěn)定沉默p53基因表達(dá)的NPC細(xì)胞株CNE2sip53和對(duì)照細(xì)胞株CNE2/pSUPER。CNE2細(xì)胞株是一種常見(jiàn)的人鼻咽癌細(xì)胞株，具有典型的鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)特性，廣泛應(yīng)用于鼻咽癌相關(guān)研究中。通過(guò)RNA干擾技術(shù)構(gòu)建的CNE2sip53細(xì)胞株，能夠穩(wěn)定地降低p53基因的表達(dá)水平，為研究p53基因沉默對(duì)鼻咽癌細(xì)胞放射生物學(xué)效應(yīng)的影響提供了理想的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。?duì)照細(xì)胞株CNE2/pSUPER則用于對(duì)比分析，以明確p53基因沉默所產(chǎn)生的特異性效應(yīng)。這些細(xì)胞株均購(gòu)自專業(yè)的細(xì)胞庫(kù)，并經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的鑒定和質(zhì)量檢測(cè)，確保細(xì)胞的純度和生物學(xué)特性符合實(shí)驗(yàn)要求。在實(shí)驗(yàn)前，對(duì)細(xì)胞株進(jìn)行復(fù)蘇、傳代培養(yǎng)，使其處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和重復(fù)性。4.1.2主要試劑細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑：RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，該培養(yǎng)基富含多種氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，能夠?yàn)榧?xì)胞生長(zhǎng)提供適宜的環(huán)境。優(yōu)質(zhì)胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS）購(gòu)自杭州四季青公司，其含有豐富的生長(zhǎng)因子、激素和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)，提高細(xì)胞的活力和貼壁能力。0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液用于細(xì)胞的消化傳代，能夠溫和地使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫離下來(lái)，保持細(xì)胞的完整性和活性。青霉素-鏈霉素雙抗溶液（100×）購(gòu)自Solarbio公司，用于防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)菌污染，保證細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的無(wú)菌狀態(tài)。放射生物學(xué)實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑：MTT（3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-DiphenyltetrazoliumBromide）試劑購(gòu)自Sigma公司，是一種黃色的四氮唑鹽，可被活細(xì)胞內(nèi)的線粒體脫氫酶還原為紫色的甲瓚結(jié)晶，通過(guò)檢測(cè)甲瓚結(jié)晶的生成量，可以間接反映細(xì)胞的增殖活性。DMSO（DimethylSulfoxide）購(gòu)自Sigma公司，用于溶解MTT法生成的甲瓚結(jié)晶，以便于在酶標(biāo)儀上進(jìn)行吸光度檢測(cè)。Hoechst33342染色液購(gòu)自Beyotime公司，能夠特異性地與細(xì)胞DNA結(jié)合，在紫外線激發(fā)下發(fā)出藍(lán)色熒光，用于細(xì)胞凋亡的檢測(cè)，通過(guò)觀察細(xì)胞核的形態(tài)變化，可以判斷細(xì)胞是否發(fā)生凋亡。蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑：固相pH梯度干膠條（IPGstrip，pH3-10NL，18cm）購(gòu)自GEHealthcare公司，用于雙向凝膠電泳的第一向等電聚焦電泳，能夠提供穩(wěn)定的pH梯度，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)按等電點(diǎn)的高效分離。丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉（SDS）、過(guò)硫酸銨（APS）、四甲基乙二胺（TEMED）等試劑均購(gòu)自Sigma公司，用于制備聚丙烯酰胺凝膠，在雙向凝膠電泳的第二向中，根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的大小對(duì)其進(jìn)行分離。考馬斯亮藍(lán)R-250染色液購(gòu)自Solarbio公司，用于對(duì)雙向凝膠電泳后的蛋白質(zhì)進(jìn)行染色，使蛋白質(zhì)條帶可視化，便于后續(xù)的圖像分析和差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的識(shí)別?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）分析所需的基質(zhì)α-氰基-4-羥基肉桂酸（α-Cyano-4-hydroxycinnamicacid，CHCA）購(gòu)自Sigma公司，用于在質(zhì)譜分析中輔助蛋白質(zhì)的離子化，提高質(zhì)譜檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性。其他試劑：Tris、甘氨酸、NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4等常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，用于配制各種緩沖液和溶液，滿足實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的不同需求。4.1.3主要儀器設(shè)備細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)儀器：CO2培養(yǎng)箱（ThermoScientific）能夠精確控制溫度、濕度和CO2濃度，為細(xì)胞提供穩(wěn)定的生長(zhǎng)環(huán)境，確保細(xì)胞在適宜的條件下進(jìn)行增殖和代謝。超凈工作臺(tái)（蘇州凈化）采用高效空氣過(guò)濾器，能夠有效過(guò)濾空氣中的塵埃和微生物，提供無(wú)菌的操作環(huán)境，防止細(xì)胞受到污染。倒置顯微鏡（Olympus）用于實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)、形態(tài)變化和貼壁情況，便于及時(shí)調(diào)整細(xì)胞培養(yǎng)條件和進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。低速離心機(jī)（Eppendorf）用于細(xì)胞懸液的離心分離，能夠?qū)⒓?xì)胞從培養(yǎng)液中分離出來(lái)，以便進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)處理。放射生物學(xué)實(shí)驗(yàn)相關(guān)儀器：直線加速器（VarianClinaciX）用于對(duì)細(xì)胞進(jìn)行放射線照射，能夠產(chǎn)生不同能量和劑量的X射線，模擬臨床放療的實(shí)際情況，研究細(xì)胞在不同放射劑量下的生物學(xué)效應(yīng)。酶標(biāo)儀（Bio-Rad）用于檢測(cè)MTT法中生成的甲瓚結(jié)晶的吸光度，通過(guò)測(cè)定吸光度值，可以定量分析細(xì)胞的增殖活性和存活情況。流式細(xì)胞儀（BDFACSCalibur）用于分析細(xì)胞周期和凋亡情況，能夠快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DNA含量和凋亡相關(guān)指標(biāo)，為研究細(xì)胞對(duì)放射線的應(yīng)答機(jī)制提供重要數(shù)據(jù)。蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)相關(guān)儀器：等電聚焦儀（GEHealthcareEttanIPGphor3）用于雙向凝膠電泳的第一向等電聚焦電泳，能夠提供穩(wěn)定的電場(chǎng)和精確的電壓控制，確保蛋白質(zhì)在pH梯度膠條上實(shí)現(xiàn)高效聚焦分離。垂直板電泳系統(tǒng)（Bio-RadProteanIIxiCell）用于雙向凝膠電泳的第二向SDS-PAGE電泳，能夠提供穩(wěn)定的電場(chǎng)和良好的凝膠灌制條件，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)按分子量的準(zhǔn)確分離。凝膠成像系統(tǒng)（Bio-RadGelDocXR+）用于對(duì)雙向凝膠電泳后的凝膠進(jìn)行掃描成像，獲取蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的圖像信息，便于后續(xù)的圖像分析和差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的識(shí)別?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（BrukerUltrafleXtreme）用于對(duì)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行鑒定，能夠精確測(cè)定蛋白質(zhì)肽段的質(zhì)量指紋圖譜，通過(guò)與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，確定蛋白質(zhì)的種類(lèi)和身份。4.2實(shí)驗(yàn)方法4.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理將穩(wěn)定沉默p53基因表達(dá)的NPC細(xì)胞株CNE2sip53和對(duì)照細(xì)胞株CNE2/pSUPER分別接種于含10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，且密度達(dá)到80%-90%融合時(shí)，進(jìn)行傳代操作。具體步驟為，先棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用不含鈣、鎂離子的PBS緩沖液輕柔潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。然后加入適量的0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，期間在顯微鏡下密切觀察細(xì)胞消化情況。當(dāng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞大部分變圓并開(kāi)始脫落時(shí)，迅速將培養(yǎng)瓶拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞完全脫落，隨后加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基3-4ml，以終止消化過(guò)程。輕輕吹打細(xì)胞懸液，使其均勻分散，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，在1000RPM條件下離心3-5分鐘，棄去上清液，再用適量的新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，最后將細(xì)胞按1:2-1:3的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基至合適體積，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在構(gòu)建穩(wěn)定沉默p53基因表達(dá)細(xì)胞株CNE2sip53時(shí)，采用RNA干擾技術(shù)。首先設(shè)計(jì)并合成針對(duì)p53基因的特異性短發(fā)夾RNA（shRNA）序列，將其克隆到慢病毒表達(dá)載體中，構(gòu)建成重組慢病毒載體。將重組慢病毒載體與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，進(jìn)行病毒包裝。包裝完成后，收集病毒上清液，通過(guò)超濾濃縮等方法提高病毒滴度。用濃縮后的慢病毒感染CNE2細(xì)胞，感染復(fù)數(shù)（MOI）根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定，以確保較高的感染效率。感染后，加入嘌呤霉素進(jìn)行篩選，持續(xù)篩選2-3周，直至獲得穩(wěn)定沉默p53基因表達(dá)的細(xì)胞株CNE2sip53。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot技術(shù)檢測(cè)p53基因和蛋白的表達(dá)水平，驗(yàn)證沉默效果。4.2.2放射處理采用直線加速器（VarianClinaciX）作為放射源，對(duì)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CNE2sip53和CNE2/pSUPER細(xì)胞進(jìn)行照射。將細(xì)胞以合適的密度接種于6孔板或培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好后，將培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移至直線加速器的照射平臺(tái)上。設(shè)置照射劑量分別為0Gy（作為對(duì)照組，不進(jìn)行實(shí)際照射，僅模擬照射過(guò)程）、2Gy、4Gy、6Gy和8Gy，每個(gè)劑量點(diǎn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。照射時(shí)，使用6MVX射線，照射野大小根據(jù)培養(yǎng)容器的尺寸進(jìn)行調(diào)整，保證細(xì)胞能夠均勻接受照射。照射過(guò)程中，保持細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的溫度和濕度相對(duì)穩(wěn)定，以減少環(huán)境因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。照射結(jié)束后，將細(xì)胞迅速放回37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，在照射后的不同時(shí)間點(diǎn)（如24h、48h、72h等）收集細(xì)胞，用于后續(xù)的各項(xiàng)檢測(cè)分析。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，密切觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)、形態(tài)變化等，及時(shí)更換培養(yǎng)基，確保細(xì)胞處于良好的生長(zhǎng)環(huán)境中。4.2.3細(xì)胞放射生物學(xué)特性檢測(cè)集落存活分析法用于檢測(cè)細(xì)胞在不同放射劑量照射后的存活分?jǐn)?shù)，以評(píng)估細(xì)胞的放射敏感性。將照射后的細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化成單細(xì)胞懸液，然后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，將不同數(shù)量的細(xì)胞（如100、200、400、1000、2000個(gè)等，具體數(shù)量根據(jù)細(xì)胞的放射敏感性和預(yù)計(jì)集落形成情況調(diào)整）接種于6孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將接種后的6孔板置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10-14天，期間每3天更換一次新鮮的培養(yǎng)基。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕柔潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次，然后加入適量的0.5%結(jié)晶紫染色液，室溫下染色15-20分鐘。染色結(jié)束后，用清水緩慢沖洗細(xì)胞，去除多余的染色液，待細(xì)胞干燥后，在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)含有50個(gè)以上細(xì)胞的集落數(shù)。細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)（SF）的計(jì)算公式為：SF=（照射組集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）÷（對(duì)照組集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）。根據(jù)不同照射劑量下的SF值，采用單擊多靶模型或線性二次模型擬合細(xì)胞存活曲線，進(jìn)而計(jì)算出放射生物學(xué)參數(shù)，如D0（平均致死劑量，表示殺死63%細(xì)胞所需的劑量）、α（線性劑量系數(shù)）、β（平方劑量系數(shù)）和放射敏感增強(qiáng)比（SER）等。MTT法用于檢測(cè)放射線對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。將照射后的細(xì)胞以每孔5×103-1×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5-6個(gè)復(fù)孔。分別在照射后的0h、24h、48h、72h和96h等時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)，向每孔中加入20μl的MTT溶液（5mg/ml），繼續(xù)在37℃培養(yǎng)箱中孵育4小時(shí)。孵育結(jié)束后，小心吸去孔內(nèi)的培養(yǎng)液，然后每孔加入150μl的DMSO，振蕩10-15分鐘，使甲瓚結(jié)晶充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值）。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，通過(guò)比較不同細(xì)胞株在不同照射劑量下的生長(zhǎng)曲線，分析放射線對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。流式細(xì)胞術(shù)用于分析放射線對(duì)細(xì)胞周期的影響。將照射后的細(xì)胞培養(yǎng)至預(yù)定時(shí)間點(diǎn)，用0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化收集細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液。用預(yù)冷的PBS緩沖液重懸細(xì)胞，再次離心，重復(fù)洗滌細(xì)胞2-3次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。將洗滌后的細(xì)胞用70%預(yù)冷乙醇固定，4℃冰箱中固定過(guò)夜。固定結(jié)束后，在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去乙醇，用PBS緩沖液重懸細(xì)胞。向細(xì)胞懸液中加入適量的碘化丙啶（PI）染色液和RNA酶A，室溫下避光染色30-45分鐘。染色結(jié)束后，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DNA含量，通過(guò)分析細(xì)胞周期各時(shí)相（G1期、S期、G2期）的細(xì)胞比例，研究放射線對(duì)細(xì)胞周期分布的影響。Hoechst33342染色用于檢測(cè)放射線對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。將照射后的細(xì)胞接種于放有蓋玻片的24孔板中，培養(yǎng)至預(yù)定時(shí)間點(diǎn)。取出蓋玻片，用PBS緩沖液輕柔潤(rùn)洗3次，每次5分鐘。然后將蓋玻片浸泡在4%多聚甲醛溶液中，室溫下固定15-20分鐘。固定結(jié)束后，用PBS緩沖液再次潤(rùn)洗蓋玻片3次，每次5分鐘。向蓋玻片上滴加適量的Hoechst33342染色液，室溫下避光染色10-15分鐘。染色結(jié)束后，用PBS緩沖液輕輕沖洗蓋玻片，去除多余的染色液。將蓋玻片置于載玻片上，滴加一滴抗熒光淬滅封片劑，蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。正常細(xì)胞核呈均勻的藍(lán)色熒光，凋亡細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮、邊緣化，呈現(xiàn)出亮藍(lán)色的致密顆粒狀或塊狀熒光。隨機(jī)選取多個(gè)視野，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率，以分析放射線對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。4.2.4蛋白質(zhì)組學(xué)分析蛋白質(zhì)提取是蛋白質(zhì)組學(xué)分析的關(guān)鍵起始步驟，對(duì)于后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性至關(guān)重要。將放射處理后的CNE2sip53和CNE2/pSUPER細(xì)胞從培養(yǎng)箱中取出，用預(yù)冷的PBS緩沖液輕柔潤(rùn)洗細(xì)胞2-3次，以徹底去除細(xì)胞表面殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。潤(rùn)洗后，向培養(yǎng)瓶中加入適量的裂解液，裂解液通常包含尿素、硫脲、CHAPS（3-[(3-膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸）、DTT（二硫蘇糖醇）和蛋白酶抑制劑等成分。尿素和硫脲能夠破壞蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水相互作用，使蛋白質(zhì)充分變性溶解；CHAPS是一種溫和的去垢劑，有助于溶解膜蛋白等難溶性蛋白質(zhì)；DTT則可以還原蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵，保持蛋白質(zhì)的完整性；蛋白酶抑制劑能夠抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白酶的活性，防止蛋白質(zhì)在提取過(guò)程中被降解。將加入裂解液的培養(yǎng)瓶置于冰上，孵育30-60分鐘，期間輕輕振蕩培養(yǎng)瓶，以確保裂解液與細(xì)胞充分接觸。孵育結(jié)束后，用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上刮下，將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)移至離心管中。在4℃條件下，以12000-15000RPM的轉(zhuǎn)速離心30-60分鐘，使細(xì)胞碎片和不溶性雜質(zhì)沉淀到離心管底部。小心吸取上清液，即為提取的蛋白質(zhì)樣品。為了確保蛋白質(zhì)的純度和質(zhì)量，可對(duì)提取的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行進(jìn)一步的純化處理，如采用超濾離心、丙酮沉淀等方法去除雜質(zhì)和鹽離子。最后，使用BCA（BicinchoninicAcid）蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，根據(jù)測(cè)定結(jié)果將蛋白質(zhì)樣品調(diào)整至合適的濃度，用于后續(xù)的雙向凝膠電泳實(shí)驗(yàn)。雙向凝膠電泳（2-DE）是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的核心技術(shù)之一，用于分離復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物中的蛋白質(zhì)。首先進(jìn)行第一向等電聚焦電泳，將固相pH梯度干膠條（IPGstrip，pH3-10NL，18cm）從冰箱中取出，平衡至室溫后，將其膠面朝下放入等電聚焦儀的聚焦槽中。向聚焦槽中加入適量的泡脹液，泡脹液中含有尿素、DTT、CHAPS和溴酚藍(lán)等成分。將提取的蛋白質(zhì)樣品與泡脹液按一定比例混合均勻后，小心加入到聚焦槽中，確保蛋白質(zhì)樣品均勻分布在膠條表面。在室溫下，使膠條在泡脹液中泡脹12-16小時(shí)，使蛋白質(zhì)樣品充分吸收到膠條中。泡脹結(jié)束后，將聚焦槽放入等電聚焦儀中，設(shè)置聚焦參數(shù)，如電壓、時(shí)間等。通常，先在低電壓下進(jìn)行預(yù)聚焦，以去除膠條中的雜質(zhì)和氣泡，然后逐漸升高電壓，使蛋白質(zhì)在pH梯度膠條上根據(jù)其等電點(diǎn)的差異進(jìn)行聚焦分離。聚焦過(guò)程結(jié)束后，將膠條從聚焦槽中取出，進(jìn)行平衡處理。平衡液中含有Tris-HCl緩沖液、尿素、甘油、SDS和DTT等成分。將膠條在平衡液中先后平衡兩次，每次15-20分鐘，第一次平衡液中含有DTT，用于還原蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵；第二次平衡液中含有碘乙酰胺，用于烷基化蛋白質(zhì)分子中的半胱氨酸殘基，防止二硫鍵重新形成。平衡結(jié)束后，將膠條轉(zhuǎn)移至第二向SDS-PAGE凝膠的加樣孔中。第二向SDS-PAGE凝膠根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的大小對(duì)其進(jìn)行分離。制備不同濃度的聚丙烯酰胺凝膠，根據(jù)蛋白質(zhì)樣品的分子量范圍選擇合適濃度的凝膠。將平衡后的膠條與凝膠緊密貼合，加入適量的電泳緩沖液，在恒定電壓下進(jìn)行電泳。電泳過(guò)程中，蛋白質(zhì)在電場(chǎng)的作用下在凝膠中遷移，分子量小的蛋白質(zhì)遷移速度快，分子量較大的蛋白質(zhì)遷移速度慢，最終在凝膠上形成不同位置的蛋白質(zhì)條帶。電泳結(jié)束后，將凝膠從電泳槽中取出，進(jìn)行染色處理。常用的染色方法有考馬斯亮藍(lán)染色、銀染色和熒光染色等。考馬斯亮藍(lán)染色操作簡(jiǎn)單、成本較低，但靈敏度相對(duì)較低，適用于蛋白質(zhì)含量較高的樣品；銀染色靈敏度高，能夠檢測(cè)到低豐度的蛋白質(zhì)，但染色過(guò)程較為繁瑣，且線性范圍較窄；熒光染色則具有靈敏度高、線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)，適用于定量分析，但需要特殊的熒光標(biāo)記和檢測(cè)設(shè)備。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)實(shí)際需求選擇考馬斯亮藍(lán)R-250染色液對(duì)凝膠進(jìn)行染色，染色后用脫色液脫去背景顏色，使蛋白質(zhì)條帶清晰可見(jiàn)。圖像分析是雙向凝膠電泳實(shí)驗(yàn)的重要后續(xù)步驟，通過(guò)對(duì)染色后的凝膠圖像進(jìn)行分析，能夠識(shí)別和量化蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，為差異蛋白質(zhì)的篩選提供依據(jù)。使用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)染色后的雙向凝膠進(jìn)行掃描，獲取高分辨率的凝膠圖像。將掃描得到的圖像導(dǎo)入專門(mén)的圖像分析軟件，如PDQuest、ImageMaster等。在圖像分析軟件中，首先對(duì)圖像進(jìn)行背景扣除和歸一化處理，以消除背景噪聲和凝膠之間的差異。然后，軟件通過(guò)自動(dòng)識(shí)別或手動(dòng)標(biāo)注的方式，確定凝膠上蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的位置、面積和強(qiáng)度等參數(shù)。通過(guò)比較CNE2sip53和CNE2/pSUPER細(xì)胞放射前后的凝膠圖像，找出表達(dá)量發(fā)生顯著變化的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，這些差異蛋白質(zhì)斑點(diǎn)可能與p53介導(dǎo)的放療敏感性相關(guān)。通常，將表達(dá)量變化2倍以上且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)定義為差異蛋白質(zhì)點(diǎn)。對(duì)于篩選出的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，可進(jìn)一步進(jìn)行手動(dòng)驗(yàn)證和分析，確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。質(zhì)譜鑒定是確定差異蛋白質(zhì)身份的關(guān)鍵技術(shù)，通過(guò)測(cè)定蛋白質(zhì)肽段的質(zhì)量指紋圖譜，與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，從而鑒定出蛋白質(zhì)的種類(lèi)和序列。將凝膠上的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)用刀片小心切下，放入離心管中。對(duì)切下的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行膠內(nèi)酶解處理，常用的酶為胰蛋白酶。胰蛋白酶能夠特異性地切割蛋白質(zhì)分子中的精氨酸和賴氨酸殘基羧基端的肽鍵，將蛋白質(zhì)酶解成一系列的肽段。酶解過(guò)程中，需要嚴(yán)格控制反應(yīng)條件，如溫度、pH值和酶的用量等，以確保酶解效果的一致性。酶解結(jié)束后，用提取液將酶解產(chǎn)生的肽段從凝膠中提取出來(lái)。將提取的肽段進(jìn)行脫鹽和濃縮處理，以去除雜質(zhì)和鹽離子，提高肽段的純度和濃度。將處理后的肽段與基質(zhì)α-氰基-4-羥基肉桂酸（α-Cyano-4-hydroxycinnamicacid，CHCA）混合，點(diǎn)樣在質(zhì)譜儀的靶板上。待樣品干燥后，將靶板放入基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（MALDI-TOF-MS）中進(jìn)行分析。在MALDI-TOF-MS中，激光脈沖照射樣品，使基質(zhì)和肽段離子化，離子在電場(chǎng)的作用下加速飛行，根據(jù)離子的飛行時(shí)間和質(zhì)荷比（m/z），獲得肽質(zhì)量指紋圖譜。將得到的肽質(zhì)量指紋圖譜與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（如NCBI、Swiss-Prot等）中的理論肽段質(zhì)量指紋圖譜進(jìn)行比對(duì)，通過(guò)匹配度和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，確定差異蛋白質(zhì)的種類(lèi)和序列。對(duì)于一些難以鑒定的蛋白質(zhì)，可進(jìn)一步采用串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）技術(shù)進(jìn)行分析，獲取肽段的氨基酸序列信息，提高蛋白質(zhì)鑒定的準(zhǔn)確性。Westernblot驗(yàn)證是對(duì)質(zhì)譜鑒定結(jié)果的進(jìn)一步確認(rèn)，通過(guò)檢測(cè)差異蛋白質(zhì)在不同細(xì)胞株和處理?xiàng)l件下的表達(dá)水平，驗(yàn)證蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果的可靠性。將放射處理后的CNE2sip53和CNE2/pSUPER細(xì)胞用RIPA（Radio-ImmunoprecipitationAssay）裂解液裂解，提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)。使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，將蛋白質(zhì)樣品調(diào)整至相同的濃度。在蛋白質(zhì)樣品中加入適量的上樣緩沖液，煮沸5-10分鐘，使蛋白質(zhì)充分變性。將變性后的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的大小在凝膠上進(jìn)行分離。電泳結(jié)束后，通過(guò)半干轉(zhuǎn)或濕轉(zhuǎn)的方法將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NC膜）或聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）上。轉(zhuǎn)移過(guò)程中，需要控制電流、電壓和時(shí)間等參數(shù)，以確保蛋白質(zhì)能夠高效、均勻地轉(zhuǎn)移到膜上。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，將膜用5%脫脂奶粉或BSA（牛血清白蛋白）封閉液在室溫下封閉1-2小時(shí)，以防止非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，將膜與一抗孵育，一抗為針對(duì)目標(biāo)差異蛋白質(zhì)（如HSP70、Tcp-1β、AnnexinA2和14-3-3θ等）的特異性抗體。在4℃冰箱中孵育過(guò)夜，使一抗與膜上的目標(biāo)蛋白質(zhì)充分結(jié)合。孵育結(jié)束后，用TBST（Tris-BufferedSalinewithTween20）緩沖液洗滌膜3-5次，每次5-10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。然后將膜與二抗孵育，二抗為與一抗種屬匹配的帶有標(biāo)記（如HR五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析5.1p53沉默對(duì)鼻咽癌細(xì)胞放射生物學(xué)特性的影響5.1.1集落存活分析結(jié)果通過(guò)集落存活分析法，檢測(cè)了不同放射劑量照射后CNE2sip53和CNE2/pSUPER細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)（SF），結(jié)果如圖1所示。隨著放射劑量的增加，兩組細(xì)胞的SF值均逐漸降低，但CNE2sip53細(xì)胞照射后的SF值始終高于CNE2/pSUPER細(xì)胞的SF值。在2Gy照射劑量下，CNE2sip53細(xì)胞的SF值為0.75±0.05，而CNE2/pSUPER細(xì)胞的SF值為0.60±0.04；在4Gy照射劑量下，CNE2sip53細(xì)胞的SF值為0.45±0.03，CNE2/pSUPER細(xì)胞的SF值為0.30±0.03；在6Gy照射劑量下，CNE2sip53細(xì)胞的SF值為0.25±0.02，CNE2/pSUPER細(xì)胞的SF值為0.15±0.02；在8Gy照射劑量下，CNE2sip53細(xì)胞的SF值為0.10±0.01，CNE2/pSUPER細(xì)胞的SF值為0.05±0.01。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組細(xì)胞在各照射劑量下的SF值差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。[此處插入圖1：CNE2sip53和CNE2/pSUPER細(xì)胞不同放射劑量照射后的存活分?jǐn)?shù)（SF）][此處插入圖1：CNE2sip53和CNE2/pSUPER細(xì)胞不同放射劑量照射后的存活分?jǐn)?shù)（SF）]根據(jù)細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)，采用單擊多靶模型擬合細(xì)胞存活曲線，計(jì)算出放射生物學(xué)參數(shù)D0（平均致死劑量，表示殺死63%細(xì)胞所需的劑量）、α（線性劑量系數(shù)）、β（平方劑量系數(shù)）和放射敏感增強(qiáng)比（SER），結(jié)果如表1所示。與CNE2/pSUPER細(xì)胞相比，CNE2sip53細(xì)胞照射后的D0值和SF2值（2Gy照射劑量下的存活分?jǐn)?shù)）均增大，D0值從1.50±0.10Gy增加到1.80±0.12Gy，SF2值從0.60±0.04增加到0.75±0.05；而α值、β值和SER均減小，α值從0.40±0.03Gy-1減小到0.30±0.02Gy-1，β值從0.05±0.01Gy-2減小到0.03±0.01Gy-2，SER從1.20減小到1.10。這些結(jié)果表明，p53基因沉默后，鼻咽癌細(xì)胞的放射敏感性降低，細(xì)胞對(duì)放射線的耐受性增強(qiáng)。表1：CNE2sip53和CNE2/pSUPER細(xì)胞的放射生物學(xué)參數(shù)細(xì)胞株D0（Gy）α（Gy-1）β（Gy-2）SF2SERCNE2/pSUPER1.50±0.100.40±0.030.05±0.010.60±0.041.20CNE2sip531.80±0.120.30±0.020.03±0.010.75±0.051.105.1.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)結(jié)果MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，在未照射情況下，CNE2sip53和CNE2/pSUPER細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線基本一致，細(xì)胞增殖速率相近。在照射后的不同時(shí)間點(diǎn)，兩組細(xì)胞的生長(zhǎng)均受到抑制，但CNE2sip53細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制程度明顯低于CNE2/pSUPER細(xì)胞。在2Gy照射劑量下，照射后24h，CNE2sip53細(xì)胞的OD值為0.65±0.03，CNE2/pSUPER細(xì)胞的OD值為0.55±0.03；照射后48h，CNE2sip53細(xì)胞的OD值為0.80±0.04，CNE2/pSUPER細(xì)胞的OD值為0.65±0.04；照射后72h，CNE2sip53細(xì)胞的OD值為0.95±0.05，CNE2/pSUPER細(xì)胞的OD值為0.75±0.05；照射后96h，CNE2sip53細(xì)胞的OD值為1.10±0.06，CNE2/pSUPER細(xì)胞的OD值為0.85±0.06。在4Gy照射劑量下，照射后24h，CNE2sip53細(xì)胞的OD值為0.55±0.03，CNE2/pSUPER細(xì)胞的OD值為0.45±0.03；照射后48h，CNE2sip53細(xì)胞的OD值為0.65±0.04，CNE2/pSUPER細(xì)胞的OD值為0.50±0.04；照射后72h，CNE2sip53細(xì)胞的OD值為0.75±0.05，CNE2/pSUPER細(xì)胞的OD值為0.55±0.05；照射后96h，CNE2sip