ICS65.020.20

CCSB05

DB5117

四川?。ㄟ_(dá)州市）地方標(biāo)準(zhǔn)

DB5117/T30—2020

達(dá)州黃花組織培養(yǎng)繁育技術(shù)規(guī)程

TechnicalRegulationOfTissueCultureAndPropagationFor

HemerocalliscitrinaBaroniOfDaZhou

2020-12-17發(fā)布2020-12-17實(shí)施

達(dá)州市市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布

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前言

本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。

本文件由達(dá)州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局提出并歸口。

本文件起草單位：達(dá)州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院。

本文件主要起草人：李益、胡振興、楊小麗、高龍梅、吳明陽、張玲、劉小英、賈薈芹、李薇、鄧

力、楊峰。

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引言

本文件第4.2.2章節(jié)—MS培養(yǎng)基配制，由于日常購買的白砂糖和瓊脂質(zhì)量存在差異，在規(guī)定濃度范

圍內(nèi)自行選擇用量不影響最終結(jié)果。

本文件第4.3章節(jié)—不同培養(yǎng)階段培養(yǎng)基配制，在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基和生

根培養(yǎng)基中加入70mg/L的抗菌劑，可減少雜菌污染的情況。生根培養(yǎng)基中加入2g/L的活性炭，可減少培

養(yǎng)過程中褐化的現(xiàn)象。

本文件第4.10.2章節(jié)—繼代培養(yǎng)，需控制愈傷組織大小，將直徑大于2cm的愈傷組織切成直徑2cm

大小進(jìn)行繼代增殖。

本文件第5章節(jié)—煉苗，營養(yǎng)缽中基質(zhì)成分及比例為泥炭土：珍珠巖：蛭石=1:1:1。

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達(dá)州黃花組織培養(yǎng)繁育技術(shù)規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了黃花組織培養(yǎng)繁育技術(shù)規(guī)程的術(shù)語和定義、組織培養(yǎng)繁育技術(shù)流程、煉苗的要求。

本文件適用于達(dá)州市行政區(qū)域內(nèi)黃花的組織培養(yǎng)育苗。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T603化學(xué)試劑試驗(yàn)方法中所用制劑及制品的制備

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

LY/T1882林木組織培養(yǎng)育苗技術(shù)規(guī)程

3術(shù)語和定義

LY/T1882界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

組織培養(yǎng)tissueculture

在無菌培養(yǎng)基上，對(duì)植物離體器官、組織或細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，以形成再生植株，或培養(yǎng)新的育種材

料的生物技術(shù)。

3.2

外植體explant

生長在培養(yǎng)基上的被培養(yǎng)的器官、組織或細(xì)胞。

3.3

培養(yǎng)基culturemedium

為外植體的生長、發(fā)育提供所需物質(zhì)的基質(zhì)。

3.4

組培苗tissuecultureseedling

利用外植體，在無菌和適宜的人工條件下，采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，培育出的完整植株。

3.5

接種inoculation

將外植體經(jīng)消毒后，在無菌條件下植入培養(yǎng)基上的過程。

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3.6

褐化browning

在植物組織培養(yǎng)中，外植體由于自身分泌的酚類化合物被氧化產(chǎn)生褐色醌類物質(zhì)，導(dǎo)致外植體褐

變的現(xiàn)象。

4黃花組織培養(yǎng)繁育技術(shù)流程

4.1實(shí)驗(yàn)室要求

黃花組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)包括：藥品室、洗滌室、準(zhǔn)備室、緩沖室、接種室、培養(yǎng)室，配備完善的水、

電供應(yīng)系統(tǒng)和空氣、燈光、溫度、濕度調(diào)節(jié)系統(tǒng)。

4.2培養(yǎng)基配制

4.2.1母液配制

按GB/T603、GB/T6682的規(guī)定執(zhí)行。將培養(yǎng)基所需的大量元素、鐵鹽、有機(jī)成分配制成比使用濃

度高100倍的母液，微量元素配制成比使用濃度高1000倍的母液，均用棕色玻璃瓶保存，貼上標(biāo)簽，注

明母液號(hào)、配制倍數(shù)、日期，保存在冰箱冷藏室中。

4.2.2MS培養(yǎng)基配制

按GB/T603、GB/T6682的規(guī)定執(zhí)行。配制MS培養(yǎng)基時(shí)將四種母液按比例混合后，加入白砂糖、瓊

脂和水。所需白砂糖濃度為20g/L～30g/L，瓊脂粉濃度為4g/L～6g/L。

4.3不同培養(yǎng)階段培養(yǎng)基配制

4.3.1愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基

MS+BA3.0mg/L+NAA0.1mg/L

4.3.2繼代培養(yǎng)基

MS+BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L

4.3.3分化培養(yǎng)基

MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L

4.3.4生根培養(yǎng)基

MS+NAA0.1mg/L

4.4培養(yǎng)基pH調(diào)節(jié)

黃花培養(yǎng)基最佳pH值為5.73～5.75。用酸度計(jì)測(cè)定pH，并用1mol/LKOH或1mol/LHCl調(diào)節(jié)。

4.5培養(yǎng)基分裝和滅菌

4.5.1培養(yǎng)基分裝

配制好的培養(yǎng)基趁熱分裝，培養(yǎng)基厚度1.5cm～2.5cm。分裝后立即加蓋或用封口膜封嚴(yán)，不同的處

理做好標(biāo)記。

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4.5.2培養(yǎng)基滅菌

分裝后的培養(yǎng)基進(jìn)行高壓滅菌處理，在0.8kPa～1.1kPa、121℃狀態(tài)下保持20min。滅菌完畢后放入

接種室冷卻待用。

4.6培養(yǎng)室消毒

將培養(yǎng)室清掃干凈，關(guān)閉門窗，按每立方米空間用高錳酸鉀16g，福爾馬林32ml，水16ml，放在瓷

瓦器皿中混合產(chǎn)生蒸氣進(jìn)行消毒，消毒時(shí)間10～12h。每隔15～20d消毒一次。

4.7材料選取

選擇春苗生長期健壯無病斑的黃花幼苗整株，切除根、葉部分，保留約8cm～10cm莖基段，用軟毛

刷刷掉泥土后再用水沖洗30min。

4.8材料消毒

在無菌操作臺(tái)上先用75%酒精浸泡30s，無菌水沖洗3次。再用0.1%次氯酸鈉浸泡5～8min,用無菌水

沖洗3次，沖洗過程中不斷搖晃放置材料的容器，去除消毒液殘留。

4.9剝離外植體和接種

在超凈工作臺(tái)上鋪上無菌濾紙，用無菌鑷子將莖基段剝開直至露出莖尖生長點(diǎn)，在20X的顯微鏡下

用無菌解剖針切取0.5mm莖尖1～2個(gè)，隨即接種于黃花愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，切口與培養(yǎng)基表面接觸。每

剝一個(gè)莖段換一張無菌濾紙。

4.10組培苗培養(yǎng)

4.10.1愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)

將接種外植體的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基放置在培養(yǎng)架上進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)。溫度22℃～25℃，光照強(qiáng)度

800lx，光照時(shí)間10h/d。

4.10.2繼代培養(yǎng)

長出愈傷組織后，轉(zhuǎn)接于繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，每2-3周繼代一次。溫度22℃～25℃，光照

強(qiáng)度1500lx～2000lx，光照時(shí)間10h/d。

4.10.3分化培養(yǎng)

選擇致密型愈傷組織轉(zhuǎn)接于分化培養(yǎng)基上進(jìn)行不定芽的分化培養(yǎng)。溫度22℃～25℃，光照強(qiáng)度

1500lx～2000lx，光照時(shí)間10h/d。

4.10.4生根培養(yǎng)

將分化出不定芽叢的愈傷組織轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，每瓶放3～5株。溫度22℃～25℃，

光照強(qiáng)度2000lx～2500lx，光照時(shí)間12h/d。

5煉苗

當(dāng)組培苗長出3～4條幼根，根系