彈性蛋白仿生多肽的合成與性質(zhì)研究摘要利用固相合成法合成DD（VPGVG）2VPGDG(VGVAPG)2VPGDG(VPGVG)2DD、DD（VPGVG）6DD、DD（VPGVG）2VPGDG(VPGVG)2VPGDG(VPGVG)2DD三段彈性蛋白仿生多肽序列，質(zhì)譜檢測其是否符合目標序列，并對符合目標序列的多肽進行溶解度溫變性等性質(zhì)研究。關鍵詞彈性蛋白；仿生多肽；固相合成；質(zhì)譜；相變溫度；引言1.1彈性蛋白概述彈性蛋白是一種細胞外基質(zhì)蛋白，主要由成纖維細胞、大動脈平滑肌細胞和彈性軟骨的軟骨細胞等產(chǎn)生，可與微原纖維結合成彈性纖維，賦予所在組織和器官伸縮性與可逆變形能力。大動脈、皮膚等高活動性細胞中含有大量的彈性蛋白。彈性蛋白的可溶性前體稱為原彈性蛋白，在賴氨酰氧化酶的催化氧化下形成其特有的交聯(lián)結構而形成彈性蛋白\o"常德才,2008.12#91"ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>常德才</Author><Year>2008.12</Year><RecNum>91</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">1</style></DisplayText><record><rec-number>91</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="stvepxt9ozx0tye5adzppps5wtxpeasfx5vx">91</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">常德才</style></author></authors></contributors><titles><title><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">彈性蛋白在生物醫(yī)用材料中的應用</style></title></titles><dates><year>2008.12</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>1。在組織中，如動脈血管，彈性蛋白網(wǎng)絡支配低應變機械反應，能量的傳遞效率和形狀恢復率是關鍵參數(shù)。事實上，為了避免動脈壁疲勞和失效，這些功能可能取決于彈性蛋白的彈性，這可以阻止傳輸?shù)哪芰肯驘岬暮纳o"LeiHuang,Macromolecules2000,33,2989-2997#96"ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>LeiHuang</Author><Year>Macromolecules2000,33,2989-2997</Year><RecNum>96</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">2</style></DisplayText><record><rec-number>96</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="stvepxt9ozx0tye5adzppps5wtxpeasfx5vx">96</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author><styleface="normal"font="default"size="100%">LeiHuang,</style><styleface="normal"font="default"charset="128"size="100%">R.AndrewMcMillan,RobertP.Apkarian,BenhamPourdeyhimi,</style></author><author><styleface="normal"font="default"size="100%">VincentP.Conticello,</style><styleface="normal"font="default"charset="128"size="100%">andElliotL.Chaikof</style></author></authors></contributors><titles><title>GenerationofSyntheticElastin-MimeticSmallDiameterFibersandFiberNetworks</title></titles><dates><year>Macromolecules2000,33,2989-2997</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>2。彈性蛋白交聯(lián)度很高，水溶性很差，但其前體原彈性蛋白溶解度較好。原彈性蛋白含有700-760個氨基酸殘基，其中95％的氨基酸為甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸等非極性氨基酸。原彈性蛋白從細胞中分泌出來后包覆在細胞表面，在賴氨酰氧化酶的催化下氧化成有特殊交聯(lián)結構的彈性蛋白。彈性蛋白與微原纖維共同組成彈性纖維。由于彈性蛋白中的主要成分是甘、脯等氨基酸，形成的β-螺旋結構中，外部有較多的親水基團——甘氨酸，疏水基團包在螺旋結構內(nèi)部，使得彈性蛋白具有親水性、彈性和堅韌性；同時，彈性蛋白的特殊結構也使得它不溶于稀酸、堿、醇和鹽溶液，僅在一些極性溶劑中出現(xiàn)溶脹現(xiàn)象；彈性蛋白的熱穩(wěn)定性很好，熱分解過程發(fā)生在220℃～380℃；并且彈性蛋白還有很強的物理、化學和某些酶的耐受能力\o"Homebeck，ElastinandElastases，BocaRaton．,1989#92"ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Homebeck，ElastinandElastases，BocaRaton．</Author><Year>1989</Year><RecNum>92</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">3</style></DisplayText><record><rec-number>92</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="stvepxt9ozx0tye5adzppps5wtxpeasfx5vx">92</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author><styleface="normal"font="default"size="100%">Robert</style><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">，WilliamHomebeck，ElastinandElastases，BocaRaton．</style></author><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">CRCPress，；2：169</style></author></authors></contributors><titles></titles><dates><year><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">1989</style></year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>3。1.2彈性蛋白的應用1.彈性蛋白基生物醫(yī)用材料：彈性蛋白良好的彈性和具有穩(wěn)定性的交聯(lián)結構，這些使其成為組織工程中令人期待的材料。彈性蛋白能夠在體外研究中改變血管平滑肌細胞的增殖、遷移和分化，并能有效減少細胞增殖引起動脈損傷的炎癥反應\o"KarnikSK，BrookeBS，Bayes—GenisAS，eta1．,2003；30：411#94"ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>KarnikSK，BrookeBS，Bayes—GenisAS，eta1．</Author><Year>2003；30：411</Year><RecNum>94</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">4</style></DisplayText><record><rec-number>94</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="stvepxt9ozx0tye5adzppps5wtxpeasfx5vx">94</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author><styleface="normal"font="default"size="100%">KarnikSK</style><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">，BrookeBS，Bayes—GenisAS，eta1．</style></author></authors></contributors><titles><title><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">Developmerit，Acriticalroleforelastinsiginvascularmorphogenesisanddisease．</style></title></titles><dates><year><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">2003；30：411</style></year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>4。由此，彈性蛋白受到了組織工程的關注，并出現(xiàn)了相關應用。其中包括具有良好生物相容性，能防血栓的彈性蛋白支架材料\o"ul．,2004；25：5227#95"ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>ul．</Author><Year>2004；25：5227</Year><RecNum>95</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">5</style></DisplayText><record><rec-number>95</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="stvepxt9ozx0tye5adzppps5wtxpeasfx5vx">95</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author><styleface="normal"font="default"size="100%">LuQJ</style><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">，GsnesanK，Simionescu</style><styleface="normal"font="default"size="100%">DT</style><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">，</style><styleface="normal"font="default"size="100%">erul</style><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">．</style></author></authors></contributors><titles><title><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">Biomaterials，Novelpo</style><styleface="normal"font="default"size="100%">ro</style><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">usaorticelastinandcollagenscaffoldsfortissueengineering．</style></title></titles><dates><year><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">2004；25：5227</style></year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>5。但這種支架材料強度不足，由此產(chǎn)生了彈性蛋白-膠原蛋白聯(lián)合支架材料，彌補了彈性蛋白支架材料強度不足的問題。此外，還有通過聚二惡烷酮增強了材料力學性能的彈性蛋白-聚二惡烷酮支架，這種材料的機械性能與動脈組織相近，常常用于組織重建通過\o"CP，,Biomed．Mater，2006；1：72#97"ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>CP，</Author><Year>Biomed．Mater，2006；1：72</Year><RecNum>97</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">6</style></DisplayText><record><rec-number>97</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="stvepxt9ozx0tye5adzppps5wtxpeasfx5vx">97</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author><styleface="normal"font="default"size="100%">SellSA</style><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">，McClureMJ，BarnesCP，</style></author></authors></contributors><titles><title><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">Electrospunpolydioxanone—elastinblend：potentialforbioresorbablevasculargrafts．</style></title></titles><dates><year><styleface="normal"font="default"size="100%">Biomed</style><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">．Mater，2006；1：72</style></year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>6。2.彈性蛋白水解產(chǎn)物基生物醫(yī)用材料：將不溶性的彈性蛋白用80％乙醇和1mol／LNa0H處理可得κ-elastin，用草酸處理可得α-e1astin。κ-elastin和α-elastin是彈性蛋白的可溶形式，盡管與彈性蛋白本身的結構不同，但其仍然保持了一些主要的物理化學性能，如可以凝聚到原纖維上、調(diào)節(jié)動脈平滑肌細胞的遷移和增殖速率等。因此，可溶性的彈性蛋白水解產(chǎn)物材料也獲得了較大的發(fā)展。例如，將膠原蛋白、明膠、α-elastin電紡制成組織工程支架，該材料隨著溶液給料速率的增加，呈現(xiàn)出偽彈性波動型形態(tài)，細胞培養(yǎng)結果顯示：此支架能夠支持人體胚胎腭突間充質(zhì)細胞的黏附和增殖\o"MR．,Biomaterials，2005；26(3O)：5999#98"ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>MR．</Author><Year>Biomaterials，2005；26(3O)：5999</Year><RecNum>98</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">7</style></DisplayText><record><rec-number>98</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="stvepxt9ozx0tye5adzppps5wtxpeasfx5vx">98</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author><styleface="normal"font="default"size="100%">LiMY</style><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">，MondrinosMJ，GandhiMR．</style></author></authors></contributors><titles><title>Electrospunproteinfibersasmatricesfortissueenginering</title></titles><dates><year><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">Biomaterials，2005；26(3O)：5999</style></year></dates><urls></urls></record></Cite><Cite><Author>MR．</Author><Year>Biomaterials，2005；26(3O)：5999</Year><RecNum>98</RecNum><record><rec-number>98</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="stvepxt9ozx0tye5adzppps5wtxpeasfx5vx">98</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author><styleface="normal"font="default"size="100%">LiMY</style><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">，MondrinosMJ，GandhiMR．</style></author></authors></contributors><titles><title>Electrospunproteinfibersasmatricesfortissueenginering</title></titles><dates><year><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">Biomaterials，2005；26(3O)：5999</style></year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>7\o"MR．,Biomaterials，2005；26(3O)：5999#98"。1.3類彈性蛋白概述類彈性蛋白多肽(ELPs)是一種以彈性蛋白結構為模板通過基因工程技術重組的蛋白質(zhì)聚合物,它源自于原彈性蛋白的疏水區(qū)域\o"張光亞，陳智山，李紅春，黃凱宗,2011.4.8.#99"ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>張光亞，陳智山，李紅春，黃凱宗</Author><Year>2011.4.8.</Year><RecNum>99</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">8</style></DisplayText><record><rec-number>99</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="stvepxt9ozx0tye5adzppps5wtxpeasfx5vx">99</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">張光亞，陳智山，李紅春，黃凱宗</style></author></authors></contributors><titles><title><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">類彈性蛋白多肽的分子動力學研究</style></title><secondary-title><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">計算機與應用化學</style></secondary-title></titles><periodical><full-title>計算機與應用化學</full-title></periodical><dates><year>2011.4.8.</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>8。類彈性蛋白多肽由五肽重復序列單元(VPGXG)n組成(X可以是除了脯氨酸以外的任意一種氨基酸)\o"陳榕英,2011,18(1):085～088#100"ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>陳榕英</Author><Year>2011,18(1):085～088</Year><RecNum>100</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">9</style></DisplayText><record><rec-number>100</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="stvepxt9ozx0tye5adzppps5wtxpeasfx5vx">100</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">陳榕英,徐希明,余江南</style></author></authors></contributors><titles><title><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">類彈性蛋白聚合物(ELPs)水凝膠的藥物控釋研究進展</style></title><secondary-title><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">藥物生物技術PharmaceuticalBiotechnology</style></secondary-title></titles><periodical><full-title>藥物生物技術PharmaceuticalBiotechnology</full-title></periodical><number></number><dates><year><styleface="normal"font="default"size="100%">2011,18(1):085</style><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">～088</style></year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>9。類彈性蛋白擁有以下特殊的性質(zhì)：當處于低溫條件時，類彈性蛋白多肽在水溶液中具有比較好的溶解性質(zhì)，且隨著該溶液溫度的升高，類彈性蛋白多肽的溶解性質(zhì)會降低。當該溶液達到一個臨界溫度的時候，類彈性蛋白多肽會變成聚合狀態(tài)，從而在溶液中析出，這個溫度被稱為相變溫度，并且這個過程具有可逆性質(zhì)，當溫度重新回到相變溫度之下后，類彈性蛋白多肽又會重新溶解在溶液中。這種特殊的性質(zhì)可能是由于類彈性蛋白多肽的二級結構——β-螺旋。在分子尺度上，隨著溫度來到相變溫度之上后，類彈性蛋白多肽會發(fā)生構象轉(zhuǎn)變，即相變溫度之下的部分無序構象β-螺旋的鏈間交聯(lián)度逐漸升高，轉(zhuǎn)變成了鏈間β-折疊結構，進一步導致了不同類彈性蛋白多肽鏈之間的交聯(lián)\o"AluriS,2009,61:940.#101"ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>AluriS</Author><Year>2009,61:940.</Year><RecNum>101</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">10</style></DisplayText><record><rec-number>101</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="stvepxt9ozx0tye5adzppps5wtxpeasfx5vx">101</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>AluriS,JanibSM,MackayJA.</author></authors></contributors><titles><title>Environmentallyresponsivepeptidesasanticancerdrugcarriers[J].</title><secondary-title>AdvancedDrugDeliveryReviews</secondary-title></titles><periodical><full-title>AdvancedDrugDeliveryReviews</full-title></periodical><dates><year><styleface="normal"font="default"size="100%">2009,61:940</style><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">.</style></year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>10。Urry從振動熵的形成及疏水性聚集兩方面來闡述(GVGVP)n的相變機理。在(GVGVP)n疏水區(qū)域內(nèi)有序體運動鏈節(jié)會產(chǎn)生相互作用,由于疏水區(qū)域內(nèi)部運動鏈的阻尼作用,疏水性區(qū)域聚集會引起振動熵的上升,疏水性區(qū)域聚集的發(fā)生是伴隨著蛋白疏水部位共振,而溫度在一定范圍內(nèi)上升時有助于疏水作用加強。在相變發(fā)生時,增加溫度會使在水環(huán)境中的聚合物有序性得到加強，而包圍在疏水性殘基的有序水分子變成無序狀態(tài),此時疏水性基團將與水溶液相分離,結果在整個變化過程中是趨于無序性的,這與熱力學第二定律相吻合\o"UrryDW,2002,357:169-184#102"ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>UrryDW</Author><Year>2002,357:169-184</Year><RecNum>102</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">11</style></DisplayText><record><rec-number>102</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="stvepxt9ozx0tye5adzppps5wtxpeasfx5vx">102</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>UrryDW,HugelT,SeitzM,etal.</author></authors></contributors><titles><title>Elastin:arepresentativeidealproteinelastomer</title><secondary-title>TheRoyalSociety.</secondary-title></titles><periodical><full-title>TheRoyalSociety.</full-title></periodical><dates><year>2002,357:169-184</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>11。此外，類彈性蛋白多肽還擁有很多優(yōu)點：1、類彈性蛋白多肽的相變溫度可以通過控制鏈段長度、氨基酸組成和序列在0攝氏度到100攝氏度之間調(diào)節(jié)，因此可以用于藥物裝運或者是蛋白質(zhì)的純化\o"RaucherD,2008,5(3):#103"ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>RaucherD</Author><Year>2008,5(3):</Year><RecNum>103</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">12</style></DisplayText><record><rec-number>103</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="stvepxt9ozx0tye5adzppps5wtxpeasfx5vx">103</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>RaucherD,MassodiI,BidwellGL.</author><author>353.</author></authors></contributors><titles><title>Thermallytargeteddeliveryofchemotherapeuticsandanti-cancerpeptidesbyelastinlikepolypeptide[J].</title><secondary-title>ExpertOpinDrugDeliv.</secondary-title></titles><periodical><full-title>ExpertOpinDrugDeliv.</full-title></periodical><dates><year>2008,5(3):</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>12，并且可以通過基因工程技術控制聚合物的鏈段長度、序列和組成比可改變聚合物的物理化學、生物和材料性質(zhì),從而形成一系列ELPs,可以獲得在室溫下可溶、在生理條件下原位自組裝成刺激響應性水凝膠的蛋白質(zhì)聚合物；2、類彈性蛋白多肽可以通過大腸桿菌來進行生物合成，這種方法制備得到的類彈性蛋白多肽的純化過程過程簡單，生產(chǎn)成本較低，并且可以控制類彈性蛋白多肽的分子量；3、類彈性蛋白多肽還具有可生物降解性、生物相容性和低免疫原性，況且，由于類彈性蛋白多肽是大分子，也可以作為被動靶向的載藥系統(tǒng)，這些性質(zhì)有利于類彈性蛋白多肽在體內(nèi)的運輸、作用和降解，使類彈性蛋白多肽在生物醫(yī)學的領域具有十分廣闊的應用前景。1.4類彈性蛋白多肽的應用類彈性蛋白多肽在一定溫度下的溶液-凝膠相變特點使它成為理想的控制藥物釋放的載體。1、對溫度敏感的類彈性蛋白-藥物的結合物：類彈性蛋白多肽的特殊性質(zhì)讓它具有了對溫度敏感的特性，而控制類彈性蛋白多肽的相變溫度在人體可接受的治療溫度范圍之間也使它在醫(yī)學治療腫瘤方面有很多研究。類彈性蛋白-阿霉素結合物可以顯著降低多耐藥腫瘤細胞P-糖蛋白轉(zhuǎn)運體耐藥機制的作用，以增強阿霉素對腫瘤細胞的毒性。而加熱后的類彈性蛋白可以更深入地滲透進腫瘤內(nèi)部，充分展示了溫度敏感的類彈性蛋白在醫(yī)學治療的巨大前景。2、多肽-類彈性蛋白融合蛋白：室溫下呈溶解狀態(tài)的可凝膠化的多肽-類彈性蛋白融合蛋白可在生理溫度的刺激下聚集凝膠，形成凝膠狀的藥物貯庫，并且能隨著該類彈性蛋白融合蛋白的解聚而慢慢清除，延長了藥物釋放，增強了關節(jié)疾病的治療效果。多肽-類彈性蛋白融合蛋白可以防止藥物發(fā)生嚴重的副反應，避免了免疫抑制的出現(xiàn)。3、環(huán)境敏感型高分子水凝膠：環(huán)境敏感型高分子水凝膠是一類很有前途的材料，可用于微驅(qū)動、傳感器和細胞-材料相互作用的控制?？赏ㄟ^化學反應（例如，具有可電離、氧化還原或光活性基團的聚電解質(zhì)）、離子交換現(xiàn)象、相變和由pH、離子強度引起的“有序無序”轉(zhuǎn)變而發(fā)生體積變化的各種類彈性蛋白多肽等的聚合物水凝膠。這類聚合物水凝膠通過物理化學引起的溶脹變化產(chǎn)生作用力，從而改變凝膠-溶劑之間的相互作用。這些水凝膠的生產(chǎn)能力有可能滿足新興技術領域?qū)ξ?zhí)行器材料的需求，如機器人技術和微機械系統(tǒng)（MEMS）?；蚬こ蘀LP聚合物可以通過精確間隔的反應基團進行化學交聯(lián)，從而產(chǎn)生具有“可調(diào)”物理性能的熱響應水凝膠。水凝膠的結構差異與組成ELP配方的參數(shù)（如分子量、溶液濃度和賴氨酸含量）直接相關。在低溫下，ELP水凝膠本質(zhì)上是完全彈性的，通過擴展的ELP片段和化學交聯(lián)反應形成的功能性分子間交聯(lián)來傳遞力。隨著溫度的升高，凝膠收縮、脫水，縮合多肽段之間的分子間相互作用產(chǎn)生粘滯摩擦能\o"KimberlyTrabbic-Carlson,2003,4,572-580#105"ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>KimberlyTrabbic-Carlson</Author><Year>2003,4,572-580</Year><RecNum>105</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">13</style></DisplayText><record><rec-number>105</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="stvepxt9ozx0tye5adzppps5wtxpeasfx5vx">105</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>KimberlyTrabbic-Carlson,LoriA.Setton,andAshutoshChilkoti</author></authors></contributors><titles><title>SwellingandMechanicalBehaviorsofChemicallyCross-LinkedHydrogelsofElastin-likePolypeptides</title><secondary-title>Biomacromolecules</secondary-title></titles><periodical><full-title>Biomacromolecules</full-title></periodical><dates><year>2003,4,572-580</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>13。4、類彈性蛋白多肽及其共聚物自組裝：類彈性蛋白多肽的序列可以通過化學合成技術而實現(xiàn)精確控制，從而滿足不同的設計需求，還可以加入非天然氨基酸進行進一步的功能化修飾。金屬離子和特定配體之間的相互作用，可以用于調(diào)控多肽的自組裝，從而制備性質(zhì)可控的多肽仿生材料。Chmielewski等人設計了兩種膠原多肽HisCol和IdaCol，它們中間都包含(Pro-Hyp-Gly)9序列，以保證其形成三重螺旋結構\o"Pires,2011,133(37):14469-14471.1#106"ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Pires</Author><Year>2011,133(37):14469-14471.1</Year><RecNum>106</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">14</style></DisplayText><record><rec-number>106</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="stvepxt9ozx0tye5adzppps5wtxpeasfx5vx">106</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Pires,M.M.,Przybyla,D.E.,RubertPerez,C.M.,Chmielewski,J.</author></authors></contributors><titles><title>Metal-mediatedtandemcoassemblyofcollagenpeptidesintobandedmicrostructures[J].</title><secondary-title>JAmChemSoc.</secondary-title></titles><periodical><full-title>JAmChemSoc.</full-title></periodical><dates><year>2011,133(37):14469-14471.1</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>14(圖1)。HisCol多肽的N和C末端都含有兩個組氨酸，而IdaCol多肽的N和C末端都含有亞氨基二乙酸側(cè)鏈修飾的賴氨酸。兩個膠原多肽的混合物，在二價金屬離子Ni2+、Zn2+或Cu2+的誘導下，可自組裝形成納米尺寸的花瓣狀結構。不同于二價金屬離子，鑭系離子具有發(fā)光壽命長、毒性低、線性發(fā)射和光化學穩(wěn)定性高等優(yōu)良性質(zhì)。2016年，我們課題組首次構建了一種膠原多肽,可以由鑭系離子介導其自組裝形成納米材料\o"He,2016,22(б):1914-1917.#107"ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>He</Author><Year>2016,22(б):1914-1917.</Year><RecNum>107</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">15</style></DisplayText><record><rec-number>107</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="stvepxt9ozx0tye5adzppps5wtxpeasfx5vx">107</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>He,M.,Wang,L.,Wu,J.,Xiao,J.</author></authors></contributors><titles><title>Ln(3+)-MediatedSelf-AssemblyofaCollagenPeptideintoLuminescentBandedHelicalNanoropes[J].</title><secondary-title>Chemistry.</secondary-title></titles><periodical><full-title>Chemistry.</full-title></periodical><dates><year><styleface="normal"font="default"size="100%">2016,22(</style><styleface="normal"font="default"charset="204"size="100%">б):1914-1917.</style></year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>15(圖2)。該膠原多肽的兩端各包括兩個天冬氨酸，可以作為鑭系離子的配體。該膠原多肽在鑭系離子存在的條件下，首尾相連，自組裝形成螺旋納米繩結構，并具有天然膠原特征性的周期排列。這個可逆的自組裝體系對鑭系離子特異，其它二價金屬離子對它沒有調(diào)控能力。鑭系離子不僅作為一個生物相容性良好的外來調(diào)控介質(zhì)，而且賦予這個材料良好的光學性能。該新型膠原多肽仿生材料具有精致的納米結構和發(fā)光性能，它在細胞成像、醫(yī)學診斷和組織培養(yǎng)領域的應用具有巨大潛力本項目也將其作為研究的重點。圖1圖2實驗過程2.1材料N，N-二甲基甲酰胺（Dimethylformamide，DMF）、異丙醇（isopropanol）、二氯甲烷（Dichloridemethyl，DCM）購自天津大茂化學試劑廠，乙醚購自天津二廠，三氟乙酸、TIS、DIEA、哌啶購自百靈威（北京），合成所用氨基酸以及HBTU購自上海吉爾生化公司，HOBt購自韶遠化學科技（上海）。2.2多肽合成多肽是利用2-氯三苯甲基氯樹脂以0.1mmol規(guī)模合成。我們使用Fmoc氨基酸(4eq.)、DIEA(6eq.)、HBTU(4eq.)和HOBt(4eq.)通過雙偶聯(lián)方法進行氨基酸的逐步偶聯(lián)（3h）。在每個偶聯(lián)反應后，將上述反應混合物用DMF(3×3.5mL)和DCM(3×3.5mL)交替洗滌三次，然后加入20％哌啶(DMF溶液)以除去Fmoc保護基團。顯色試劑(2％乙醛/DMF溶液，2％四氯苯醌/DMF溶液)用于檢測每個循環(huán)的偶聯(lián)反應和Fmoc脫帽反應的完成。將TFA/H2O(95:5)切割液倒入到注射器中振蕩切割樹脂上的多肽。然后將反應液滴入到冰乙醚中，使目標多肽沉淀，并將多肽沉淀在冰乙醚中再懸浮，超聲處理和離心后收集。多肽樣品溶于20%乙腈/水溶液后通過C18柱進行高效液相色譜(HPLC)分離純化，并進一步利用質(zhì)譜鑒定。多肽合成步驟的細節(jié)優(yōu)化1.基質(zhì)樹脂可以選用胺樹脂或者氯樹脂，胺樹脂需要在活化以后進行脫帽反應才能和氨基酸反應，而氯樹脂可以在活化后直接使用。2.加入已經(jīng)處理完畢的氨基酸反應后，應使用適量DMF涮洗PC管，使氨基酸盡可能地轉(zhuǎn)移到反應體系中。3.反應過程必須控制好反應物溶液的量，如果反應過程中溶劑不足，很容易在反應過程中被鼓入的氣體吹干，導致反應不夠充分；如果溶劑過多，液面高于油浴，反應體系溫度不足，反應速率進一步降低，進而影響產(chǎn)率。4.在進行脫帽反應和氨基酸連接反應的間隔洗滌時，需要在DMF洗滌和DCM洗滌之間加一步異丙醇洗滌，便于進一步洗滌干凈殘余反應物，并減少DMF殘余。5.在進行脫帽反應和氨基酸連接反應的間隔洗滌時，也要用溶劑將反應管內(nèi)壁沖洗干凈。用DCM洗滌時要格外注意不要把樹脂濺到合成管內(nèi)壁。因為被DCM沖到合成管內(nèi)壁后會在抽干過程中粘在內(nèi)壁上。6.隨著多肽鏈的長度增加，氨基酸連接反應時間需要適當加長（氨基酸每連接五個，反應時間增加20%）。7.在脫帽反應和氨基酸連接反應結束后，需要用濾紙擦凈合成管管口，避免被溶劑蒸汽裹挾的反應物殘留在管口，在下一步反應的時候落入合成管，造成污染。8.顯色劑中和四氯苯醌有關的部分都要現(xiàn)用現(xiàn)配，使用前再進行混合分裝，不可過夜使用。如果顯色反應不夠明顯，可以微熱靜置幾分鐘。如果顯色反應依然不滿足要求，則需再次進行反應。2.3質(zhì)譜檢測取少量樣品裝在小PC管里，溶于200μL水中，進行質(zhì)譜檢測，確定其序列是否為所需序列。對符合目標序列的多肽進行相變能力檢測。多肽自組裝能力檢測2.3.1多肽自組裝概述多肽可以在鑭系金屬離子介導下自組裝形成納米材料。產(chǎn)品多肽的兩末端都分別包括兩個天冬氨酸（D）作為鑭系金屬離子的配體。彈性多肽在鑭系金屬離子存在下，首尾相連，自組裝形成納米結構。自組裝材料具有良好的光學性能和細胞粘附特性，這種新型的彈性多肽自組裝體系可以很好地模擬天然彈性蛋白的結構、組裝和功能。2.3.2緩沖溶液的配制配制50mL20mmol/L濃度的HEPES(羥乙基哌嗪乙硫磺酸)緩沖溶液，用15mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)緩沖溶液的pH=7.4。2.3.2樣品溶液的制備在PC管中配制編號為1、2、3、4的硝酸鑭溶液（用HEPES緩沖溶液溶解）各2mL，它們的濃度依次為500mg/mL、200mg/mL、100mg/mL和50mg/mL；再在PC管中配制編號為1、2、3、4的多肽樣品溶液（用HEPES緩沖溶液溶解）各1mL,它們的濃度依次為50mg/mL、20mg/mL、10mg/mL和5mg/mL。放在搖床上充分振搖溶解，使得所有溶液都澄清透明，且對比沒有透明度差別為止。將兩種溶液相同編號對應等體積混合，充分混合，觀察是否有沉淀產(chǎn)生。如果都沒有沉淀產(chǎn)生，將濃度最高的一份混合溶液加熱至50℃后再觀察。實驗結果與分析3.1多肽產(chǎn)品的質(zhì)譜分析結果由圖1可知：序列DD（VPGVG）2VPGDG(VGVAPG)2VPGDG(VPGVG)2DD的多肽相對分子質(zhì)量應該在3880左右，但是質(zhì)譜檢測結果的分子離子峰只有3471.33，說明這個序列合成失敗，不滿足進一步檢測的要求。而由圖2和圖3可知：序列DD（VPGVG）6DD和DD（VPGVG）2VPGDG(VPGVG)2VPGDG(VPGVG)2DD的相對分子質(zhì)量分別在3777和3808左右，與質(zhì)譜中分子離子峰在3777.48和3808.45吻合，說明DD（VPGVG）6DD和DD（VPGVG）2VPGDG(VPGVG)2VPGDG(VPGVG)2DD兩條多肽合成成功，滿足進一步檢測其性能的要求。溶劑峰溶劑峰圖3-1DD（VPGVG）2VPGDG(VGVAPG)2VPGDG(VPGVG)2DD序列質(zhì)譜檢測圖3-2DD（VPGVG）2VPGDG(VGVAPG)2VPGDG(VPGVG)2DD序列質(zhì)譜檢測圖4DD（VPGVG）6DD序列質(zhì)譜檢測圖5DD（VPGVG）2VPGDG(VPGVG)2VPGDG(VPGVG)2DD序列質(zhì)譜檢測3.2多肽的性能測試結果將兩份合成成功，滿足測試要求的多肽產(chǎn)品按照多肽相變能力檢測方法進行制樣檢測，兩份產(chǎn)品的樣品-硝酸鑭全濃度混合溶液均不產(chǎn)生沉淀，加熱至50℃后依然都不產(chǎn)生沉淀。在離心機中（2℃，12000r,6min）離心后依然無法觀察到沉淀，說明樣品無法滿足在人體可適應溫度下發(fā)生自組裝反應的要求，這兩種序列設計不滿足要求。小結與展望本項目制備的DD（VPGVG）2VPGDG(VPGVG)2VPGDG(VPGVG)2DD和DD（VPGVG）6DD兩種序列沒能在適宜的溫度下發(fā)生組裝，這有可能是序列設計本身的問題導致的。一種可能是在設計的過程中，為了兼顧彈性蛋白質(zhì)的序列特征，以及分散介質(zhì)和反應物質(zhì)的溶解能力，序列中選擇了大量的疏水性氨基酸(纈氨酸V、丙氨酸A)。這可能會導致多肽親水能力較弱，在水中分散后仍以分子形式為主要存在形體，難以利用靜電作用與鑭離子結合實現(xiàn)自組裝反應。另一種可能是設計的多肽等電點較低，在pH值較高的情況下才能使羧基電離，有利于與鑭正離子結合實現(xiàn)自組裝反應，但是pH值過高（pH>9）會導致鑭離子沉淀。因此，自組裝體系的適用pH區(qū)間較小，也會導致自組裝反應難以進行。針對本次出現(xiàn)的情況，可以調(diào)整氨基酸序列，插入更多的極性強，易給出質(zhì)子并攜帶負電荷的氨基酸如天冬氨酸（D）或者谷氨酸（E），增強其更強的配位結合能力與親水性，提高自組裝的成功率。也可以選用其他靜電作用性強的重金屬離子，比如其他稀土金屬元素。還可以嘗試進行改性處理，比如讓多肽的螺旋結構包覆磁性材料納米粒子，形成包覆溶解物，用磁性輔助實現(xiàn)自組裝反應等。致謝一年的創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)經(jīng)歷在這個季節(jié)即將劃上一個句號，而于我的人生卻只是一個逗號，我將面對又一次征程的開始。在論文即將付梓之際，思緒萬千，心情久久不能平靜。我的導師肖建喜教授，您治學嚴謹，學識淵博，思想深邃，視野雄闊，為我營造了一種良好的科研氛圍。從論文題目的選定到論文寫作的指導,經(jīng)由您悉心的點撥,再經(jīng)思考后的領悟,常常讓我茅塞頓開。朋輩導師孫秀霞老師和李佳楠師兄，也在我科研生活的細節(jié)中給予了我很多的幫助。我還要感謝我的父母，您們的支持是我努力前行最堅實的后盾。在論文即將完成之際，我的心情無法平靜，從開始進入課題到論文的順利完成，有多少可敬的師長、同學、朋友給了我無言的幫助，在這里請接受我誠摯謝意！同時也感謝學院為我提供良好的做畢業(yè)設計的環(huán)境。最后再一次感謝所有在畢業(yè)設計中曾經(jīng)幫助過我的良師益友和同學，以及在設計中被我引用或參考的論著的作者。參考文獻ADDINEN.REFLIST1. 常德才,彈性蛋白在生物醫(yī)用材料中的應用.2008.12.2. 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