層級(jí)三素養(yǎng)整合?詮釋?xiě)?yīng)用素養(yǎng)科學(xué)思維與科學(xué)探究——PCR技術(shù)及應(yīng)用(選用)一、重疊延伸PCR技術(shù)重疊延伸PCR技術(shù)是采用具有互補(bǔ)末端的引物,使PCR產(chǎn)物形成了重疊鏈,從而在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過(guò)重疊鏈的延伸,將不同來(lái)源的擴(kuò)增片段重疊拼接起來(lái)的技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)目前主要有兩個(gè)應(yīng)用方向:基因定點(diǎn)突變、構(gòu)建融合基因?！纠?】

(2025·山東濟(jì)寧模擬)融合PCR技術(shù)采用具有互補(bǔ)末端的引物,形成具有重疊鏈的PCR產(chǎn)物,通過(guò)PCR產(chǎn)物重疊鏈的延伸,從而將不同來(lái)源的任意DNA片段連接起來(lái)。其原理如圖所示,據(jù)圖分析,下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是(

)A.上述過(guò)程中使用的引物P2和P3的堿基需要完全互補(bǔ)配對(duì)B.設(shè)計(jì)引物的目的是能夠從其3'端開(kāi)始連接脫氧核苷酸C.融合PCR的第一步兩條鏈重疊部位可互為另一條鏈的引物D.若融合PCR的第二步獲得128個(gè)融合基因,理論上該過(guò)程消耗了254個(gè)引物A解析

題述過(guò)程中使用的引物P2和P3的堿基不需要完全互補(bǔ)配對(duì),只需要部分堿基互補(bǔ)配對(duì)即可,A項(xiàng)錯(cuò)誤。引物與DNA模板鏈結(jié)合后,能夠從其3'端開(kāi)始連接脫氧核苷酸,開(kāi)始子鏈的合成,B項(xiàng)正確。結(jié)合圖示可知,融合PCR的第一步兩條鏈重疊部位互補(bǔ)配對(duì),可互為另一條鏈的引物,C項(xiàng)正確。若融合PCR的第二步獲得了128個(gè)融合基因,引物數(shù)目和新合成的子鏈數(shù)目相同,即該過(guò)程消耗了128×2-2=254(個(gè))引物,D項(xiàng)正確?！纠?】

重疊延伸PCR技術(shù)是一項(xiàng)重要的基因定點(diǎn)突變技術(shù),其主要設(shè)計(jì)思路是用具有互補(bǔ)配對(duì)片段的引物(如圖中的引物2和3,突起處代表與模板鏈不能互補(bǔ)的突變位點(diǎn)),分別進(jìn)行PCR,獲得有重疊鏈的兩種DNA片段,再在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過(guò)重疊鏈的延伸獲得想要的目的基因。水蛭素是一種蛋白質(zhì),可用于預(yù)防和治療血栓。某科研團(tuán)隊(duì)運(yùn)用重疊延伸PCR技術(shù)在水蛭素基因中的特定位點(diǎn)引入特定突變,使水蛭素第47位的天冬酰胺(密碼子為AAC、AAU)替換為賴(lài)氨酸(密碼子為AAA、AAG),從而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如圖所示。(1)若擬突變位點(diǎn)的堿基對(duì)為A—T,則需要讓其突變?yōu)?/p>

才能達(dá)到目的。引物2的突變位點(diǎn)(突起處)應(yīng)設(shè)計(jì)為

(假設(shè)引物為單鏈DNA)。

(2)在第一階段獲得兩種具有重疊片段DNA的過(guò)程中,引物1、引物2組成的反應(yīng)系統(tǒng)和引物3、引物4組成的反應(yīng)系統(tǒng)中均進(jìn)行一次復(fù)制,共產(chǎn)生____種DNA分子。該階段必須將引物1、2和引物3、4置于不同反應(yīng)系統(tǒng)中,這是因?yàn)?/p>

。

(3)利用重疊延伸PCR技術(shù)還可以將兩個(gè)不同來(lái)源的DNA片段拼接起來(lái)。有人想利用該技術(shù)把基因M和N拼接在一起,設(shè)計(jì)基因M的引物M1、M2,基因N的引物N1、N2。在設(shè)計(jì)這4種引物時(shí),特別要注意的問(wèn)題是

。

T—A或C—GA或G3

引物2和3中存在互補(bǔ)配對(duì)片段,置于同一反應(yīng)系統(tǒng)時(shí)它們會(huì)發(fā)生結(jié)合而失去作用M1、M2中的一種引物與N1、N2中的一種引物必須具有互補(bǔ)配對(duì)的片段

【歸納拓展】(1)基因定點(diǎn)突變,該技術(shù)要使用四種引物?？疾閮?nèi)容可涉及與突變位點(diǎn)配對(duì)的引物設(shè)計(jì)情況、兩個(gè)階段引物的選擇、擴(kuò)增體系及產(chǎn)物等。解答此技術(shù)相關(guān)問(wèn)題時(shí)可結(jié)合題圖依據(jù)以下原則:引物2和3的突起處代表與模板鏈不能互補(bǔ)的突變位點(diǎn),而這兩條引物有部分堿基(包括突變位點(diǎn))是可以互補(bǔ)的。因此,分別利用引物1和2、引物3和4進(jìn)行PCR后,得到的DNA片段可以通過(guò)引物2和3互補(bǔ)的堿基雜交在一起,再在DNA聚合酶的作用下延伸,就能成為一條完整的DNA片段。最后,用引物1和4進(jìn)行擴(kuò)增得到含有突變位點(diǎn)的DNA片段。通過(guò)測(cè)序可以檢驗(yàn)定點(diǎn)突變是否成功。(2)構(gòu)建融合基因,重疊延伸PCR還可以用于兩個(gè)或兩個(gè)以上異源基因DNA片段的拼接。引物上含有末端互補(bǔ)序列,通過(guò)PCR產(chǎn)生的兩個(gè)DNA片段可通過(guò)引物延伸進(jìn)行剪接和擴(kuò)增,從而獲得重組體,與定點(diǎn)突變不同的是待融合基因的PCR產(chǎn)物來(lái)自?xún)蓚€(gè)不同的基因,通過(guò)引物在兩種PCR產(chǎn)物中產(chǎn)生互相重疊的鏈而獲得融合基因。二、反向PCR技術(shù)反向PCR技術(shù)是用反向的互補(bǔ)引物來(lái)擴(kuò)增兩引物以外的DNA片段,對(duì)某個(gè)已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增?！纠?】

(2025·安徽蕪湖二模)反向PCR是一種通過(guò)已知序列設(shè)計(jì)引物對(duì)未知序列進(jìn)行擴(kuò)增的技術(shù),其過(guò)程如下圖所示。下列敘述錯(cuò)誤的是(

)注:引物分別與鄰近的DNA鏈互補(bǔ)配對(duì)。A.反向PCR應(yīng)選擇引物1和引物4進(jìn)行PCR擴(kuò)增B.設(shè)計(jì)的引物不宜過(guò)短,否則擴(kuò)增的特異性會(huì)下降C.PCR產(chǎn)物是包含已知序列和所有未知序列的環(huán)狀DNA分子D.整個(gè)過(guò)程需用到限制酶、DNA連接酶和耐高溫的DNA聚合酶C解析

DNA子鏈合成的方向?yàn)?'端到3'端,因此要通過(guò)已知序列設(shè)計(jì)引物對(duì)未知序列進(jìn)行擴(kuò)增應(yīng)選擇引物1和引物4進(jìn)行PCR擴(kuò)增,A項(xiàng)正確。設(shè)計(jì)的引物不宜過(guò)短,否則擴(kuò)增的特異性會(huì)下降,B項(xiàng)正確。PCR產(chǎn)物是包含所有已知序列和未知序列的鏈狀DNA分子,擴(kuò)增產(chǎn)物還需要經(jīng)過(guò)限制酶切割后再用DNA連接酶連接才能形成環(huán)狀,C項(xiàng)錯(cuò)誤。整個(gè)過(guò)程需用到限制酶、DNA連接酶和耐高溫的DNA聚合酶,D項(xiàng)正確。三、不對(duì)稱(chēng)PCR正常的PCR反應(yīng)需要一對(duì)相對(duì)配置的引物同時(shí)擴(kuò)增的兩條模板鏈。如果只加入一條引物,那么將會(huì)只擴(kuò)增一條模板鏈。像這種加入一條引物擴(kuò)增的PCR反應(yīng)叫作不對(duì)稱(chēng)PCR。【例4】

(2025·江蘇揚(yáng)州模擬)不對(duì)稱(chēng)PCR是一種常見(jiàn)的單鏈DNA探針制備方法,其原理是反應(yīng)體系中加入一對(duì)數(shù)量不相等的引物,數(shù)量較少的為限制性引物,數(shù)量較多的為非限制性引物。假設(shè)體系中模板DNA數(shù)量為a,在PCR反應(yīng)的早期10個(gè)循環(huán)中,擴(kuò)增產(chǎn)物是雙鏈DNA,限制性引物耗盡,非限制性引物繼續(xù)引導(dǎo)合成大量目標(biāo)DNA單鏈。下列說(shuō)法正確的是(

)A.若B鏈為所需的DNA探針,則非限制性引物應(yīng)選用引物ⅣB.兩種引物與模板鏈結(jié)合時(shí),需將溫度控制在72℃左右C.如果總共進(jìn)行25次循環(huán),最終獲得的單鏈DNA探針數(shù)為15×210a個(gè)D.因?yàn)殡p鏈DNA和單鏈DNA的長(zhǎng)度相同,不能通過(guò)電泳方法將其分離C解析

由于DNA聚合酶只能從3'端延伸DNA鏈,引物Ⅱ和Ⅲ不能作為擴(kuò)增探針序列的引物,據(jù)題干信息可知,數(shù)量較多的非限制性引物將引導(dǎo)合成大量目標(biāo)DNA單鏈,若B鏈為所需的DNA分子探針,即目標(biāo)DNA單鏈,則非限制性引物應(yīng)選用引物Ⅰ,A項(xiàng)錯(cuò)誤。兩種引物與模板鏈結(jié)合即復(fù)性過(guò)程,該過(guò)程中溫度下降到50

℃左右,兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合,B項(xiàng)錯(cuò)誤。假設(shè)B鏈為目標(biāo)DNA單鏈,如果體系中原模板DNA的數(shù)量為a,早期10個(gè)循環(huán)產(chǎn)物雙鏈DNA分子的數(shù)量為210×a個(gè),其中有A鏈210×a個(gè),以A鏈為模板,利用引物又進(jìn)行了15次循環(huán),每次循環(huán)生成的都是B鏈,不改變A鏈的數(shù)目,即每次后期循環(huán)開(kāi)始時(shí)的模板鏈A鏈的數(shù)目都是210×a個(gè),15次循環(huán)每次生成B鏈也是210×a個(gè),故最終獲得的單鏈DNA探針數(shù)共為15×210×a個(gè),C項(xiàng)正確。單鏈DNA和雙鏈DNA的相對(duì)分子質(zhì)量不同,電泳可以將其分離,D項(xiàng)錯(cuò)誤?！練w納拓展】不對(duì)稱(chēng)PCR主要只擴(kuò)增一條模板鏈,實(shí)際操作時(shí),為了增加模板量,也可以加入一對(duì)引物,只是兩條引物在濃度上應(yīng)存在差異。如此題經(jīng)若干次循環(huán)后,低濃度的引物(限制性引物)被消耗盡,以后的循環(huán)只產(chǎn)生高濃度引物(非限制性引物)的延伸產(chǎn)物。此技術(shù)可制備單鏈DNA片段用于序列分析或核酸雜交的探針。四、實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)時(shí)熒光定量PCR主要是通過(guò)熒光PCR連續(xù)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)出現(xiàn)的先后順序以及信號(hào)強(qiáng)弱的變化,實(shí)時(shí)分析目的基因的初始量,該技術(shù)的發(fā)明實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍。RT表示逆轉(zhuǎn)錄。在RT-PCR中,通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA轉(zhuǎn)化為cDNA,然后通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增cDNA?！纠?】

(2025·江西模擬預(yù)測(cè))實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)利用熒光信號(hào)變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化,其靈敏度高、特異性好,是目前檢測(cè)微小殘留病變的常用方法。請(qǐng)回答下列有關(guān)問(wèn)題。圖1(1)Taqman探針是qPCR中一種常用的探針,其5'端連接熒光基團(tuán)(F),3'端連接淬滅基團(tuán)(Q)。當(dāng)探針完整時(shí),兩個(gè)基團(tuán)距離很近,F發(fā)出的熒光信號(hào)被Q吸收而不能被檢測(cè)到。在qPCR過(guò)程中,當(dāng)TaqDNA聚合酶遇到探針時(shí),探針會(huì)水解,F和Q兩個(gè)基團(tuán)分離,F發(fā)出的熒光信號(hào)被相應(yīng)儀器檢測(cè)到,即可對(duì)PCR進(jìn)行實(shí)時(shí)分析。具體過(guò)程如圖1所示。①qPCR除需要Taqman探針外,還需要模板DNA、TaqDNA聚合酶、

和dNTP(N代表A、T、G、C)等,每個(gè)循環(huán)需要經(jīng)歷

、

、延伸三個(gè)階段,其中延伸階段是從引物的

(填“3'”或“5'”)端開(kāi)始的。

②在qPCR過(guò)程中,TaqDNA聚合酶的兩個(gè)作用是

。

③在qPCR過(guò)程中,Taqman探針的復(fù)性溫度需比引物的高,原因是

。

引物變性復(fù)性3'

催化游離脫氧核苷酸連接到脫氧核苷酸鏈上、水解Taqman探針有利于保證復(fù)性時(shí)探針先于引物與模板DNA結(jié)合(2)隨著qPCR循環(huán)次數(shù)的增加,熒光信號(hào)強(qiáng)度

(填“增強(qiáng)”或“減弱”)。通過(guò)實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度,可得Ct值(擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的熒光閾值時(shí)所對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)),該值與待測(cè)樣本中目的基因的個(gè)數(shù)呈

(填“正相關(guān)”或“負(fù)相關(guān)”)。

增強(qiáng)負(fù)相關(guān)(3)qPCR可用于腫瘤基因的檢測(cè),其不但能靈敏地檢測(cè)到少量突變基因,盡早確診癌癥,還可以準(zhǔn)確檢測(cè)到腫瘤基因的表達(dá)量。圖2表示三位疑似腫瘤患者中腫瘤基因的檢測(cè)結(jié)果,從Ct值的角度進(jìn)行分析,患者

(填“A”“B”或“C”)出現(xiàn)腫瘤基因的概率更大,原因是

。

圖2A患者A出現(xiàn)熒光閾值時(shí)的循環(huán)次數(shù)比較小,因此其起始模板的致癌基因較多解析

(1)①qPCR除需要Taqman探針外,還需要模板DNA、Taq

DNA聚合酶、引物和dNTP(N代表A、T、G、C)等,每個(gè)循環(huán)需要經(jīng)歷變性、復(fù)性、延伸三個(gè)階段,延伸是從引物的3'端開(kāi)始的。②在qPCR過(guò)程中,Taq

DNA聚合酶能夠催化游離脫氧核苷酸連接到脫氧核苷酸鏈上,此外還能水解Taqman探針。③在qPCR過(guò)程中,Taqman探針的復(fù)性溫度需比引物的高,這有利于保證復(fù)性時(shí)探針先于引物與模板DNA結(jié)合。(2)在qPCR中,由于Taq

DNA聚合酶遇到探針時(shí)會(huì)使探針?biāo)舛尫懦鲇坞x的F,F發(fā)出的熒光信號(hào)被相應(yīng)儀器檢測(cè)到,理論上qPCR每擴(kuò)增一條DNA鏈,就有1個(gè)熒光分子形成,因此隨著qPCR循環(huán)次數(shù)的增加,熒光信號(hào)強(qiáng)度會(huì)增強(qiáng)。Ct值是PCR擴(kuò)增過(guò)程中,擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù),則Ct值越小,起始模板量越多,因此該值與待測(cè)樣本中目的基因的個(gè)數(shù)呈負(fù)相關(guān)。(3)已知Ct值是PCR擴(kuò)增過(guò)程中