第四章酶分離純化第1頁(yè)1、酶分離純化原因（3條）2、酶分離純化判定依據(jù)－蛋白質(zhì)物理化學(xué)特征（9條）第2頁(yè)內(nèi)容1、酶提取與分離純化技術(shù)路線2、細(xì)胞破碎3、酶提取4、酶分離方法5、酶組合分離純化策略6、酶濃縮、干燥與結(jié)晶第3頁(yè)細(xì)胞結(jié)構(gòu)與酶分布第4頁(yè)3.1酶提取、分離純化技術(shù)路線細(xì)胞破碎酶提取酶分離純化酶濃縮酶貯存動(dòng)物、植物或微生物細(xì)胞發(fā)酵液離心，過(guò)濾、沉淀、層析分離、電泳、萃取、結(jié)晶等分離方法第5頁(yè)酶純化過(guò)程，約可分為三個(gè)階段：(1)粗蛋白質(zhì)(crudeprotein):采樣→均質(zhì)打破細(xì)胞→抽出全蛋白，多使用鹽析沉淀法；能夠粗略去除蛋白質(zhì)以外物質(zhì)。(2)部分純化(partiallypurified):初步純化，使用各鐘柱層析法。(3)均質(zhì)酶(homogeneous):目標(biāo)酶進(jìn)一步精制純化，可用制備式電泳或HPLC。酶分離純化不一樣階段第6頁(yè)3.2細(xì)胞破碎許多酶存在于細(xì)胞內(nèi)。為了提取這些胞內(nèi)酶，首先需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎處理。1）機(jī)械破碎2）物理破碎3）化學(xué)破碎4）酶解破碎JY92-IID超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)細(xì)胞破碎珠高壓細(xì)胞破碎機(jī)DY89-I型電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)第7頁(yè)機(jī)械破碎搗碎法研磨法勻漿法

物理破碎溫度差破碎法壓力差破碎法超聲波破碎法

化學(xué)破碎有機(jī)溶劑：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性劑：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶制劑法經(jīng)過(guò)機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生剪切力，使組織、細(xì)胞破碎。經(jīng)過(guò)各種物理原因作用，使組織、細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細(xì)胞破碎。經(jīng)過(guò)各種化學(xué)試劑對(duì)細(xì)胞膜作用，而使細(xì)胞破碎經(jīng)過(guò)細(xì)胞本身酶系或外加酶制劑催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而到達(dá)細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎方法及其原理第8頁(yè)酶提取是指在一定條件下，用適當(dāng)溶劑或溶液處理含酶原料，使酶充分溶解到溶劑或溶液中過(guò)程。也稱(chēng)為酶抽提。酶提取時(shí)首先應(yīng)依據(jù)酶結(jié)構(gòu)和溶解性質(zhì)，選擇適當(dāng)溶劑。普通說(shuō)來(lái)，極性物質(zhì)易溶于極性溶劑中，非極性物質(zhì)易溶于非極性有機(jī)溶劑中，酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑中，堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑中。酶都能溶解于水，通?？捎盟蛳∷?、稀堿、稀鹽溶液等進(jìn)行提取，有些酶與脂質(zhì)結(jié)合或含有較多非極性基團(tuán)，則可用有機(jī)溶劑提取。

3.3酶提取第9頁(yè)

提升溫度，降低溶液粘度、增加擴(kuò)散面積、縮短擴(kuò)散距離，增大濃度差等都有利于提升酶分子擴(kuò)散速度，從而增大提取效果。為了提升酶提取率并預(yù)防酶變性失活，在提取過(guò)程中還要注意控制好溫度、pH值等提取條件。第10頁(yè)為了使蛋白質(zhì)充分溶解并保持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與活性，蛋白質(zhì)提取緩沖液常包含成份控制溶液pH值緩沖對(duì)；控制溶液離子強(qiáng)度無(wú)機(jī)鹽；控制溶液氧化還原狀態(tài)還原劑；蛋白酶抑制劑離子螯合劑標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白去污劑水和防腐劑甘油第11頁(yè)酶主要提取方法提取方法使用溶劑或溶液提取對(duì)象鹽溶液提取0.02～0.5mol/L鹽溶液用于提取在低濃度鹽溶液中溶解度較大酶酸溶液提取PH2～6水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且穩(wěn)定性很好酶堿溶液提取PH8～12水溶液用于提取在稀堿溶液中溶解度大且穩(wěn)定性很好酶有機(jī)溶劑提取可與水混溶有機(jī)溶劑用于提取那些與脂質(zhì)結(jié)合牢靠或含有較多非極性基團(tuán)酶第12頁(yè)大多數(shù)蛋白類(lèi)酶都溶于水，而且在低濃度鹽存在條件下，酶溶解度隨鹽濃度升高而增加，這稱(chēng)為鹽溶現(xiàn)象。第13頁(yè)3.4酶分離方法1、沉淀分離2、離心分離3、過(guò)濾與膜分離4、層析分離5、電泳分離6、萃取分離第14頁(yè)1、沉淀分離沉淀分離是經(jīng)過(guò)改變一些條件或添加某種物質(zhì)，使酶溶解度降低，而從溶液中沉淀析出，與其它溶質(zhì)分離技術(shù)過(guò)程。沉淀分離方法分離原理

鹽析沉淀法利用不一樣蛋白質(zhì)在不一樣鹽濃度條件下溶解度不一樣特征，經(jīng)過(guò)在酶液中添加一定濃度中性鹽，使酶或雜質(zhì)從溶液中析出沉淀，從而使酶與雜質(zhì)分離等電點(diǎn)沉淀法利用兩性電解質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低，以及不一樣兩性電解質(zhì)有不一樣等電點(diǎn)這一特征，經(jīng)過(guò)調(diào)整溶液pH值，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離有機(jī)溶劑沉淀法利用酶與其它雜質(zhì)在有機(jī)溶劑中溶解度不一樣，經(jīng)過(guò)添加一定量某種有機(jī)溶劑，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離復(fù)合沉淀法在酶液中加入一些物質(zhì)，使它與酶形成復(fù)合物而沉淀下來(lái)，從而使酶與雜質(zhì)分離選擇性變性沉淀法選擇一定條件使酶液中存在一些雜質(zhì)變性沉淀，而不影響所需酶，從而使酶與雜質(zhì)分離第15頁(yè)在鹽濃度到達(dá)某一界限后，酶溶解度隨鹽濃度升高而降低，這稱(chēng)為鹽析現(xiàn)象。鹽析主要原理在于高濃度鹽離子與蛋白質(zhì)爭(zhēng)奪水化水，破壞蛋白質(zhì)分子表面水化膜，同時(shí)因?yàn)榉措x子作用，也影響蛋白質(zhì)分子所帶電荷

第16頁(yè)

在一定溫度和pH值條件下（β為常數(shù)），經(jīng)過(guò)改變離子強(qiáng)度使不一樣酶或蛋白質(zhì)分離方法稱(chēng)為Ks分段鹽析；而在一定鹽和離子強(qiáng)度條件下（KsI為常數(shù)），經(jīng)過(guò)改變溫度和pH值，使不一樣酶或蛋白質(zhì)分離方法，稱(chēng)為β分段鹽析公式logS=logS0-KsI=β-KsI第17頁(yè)在蛋白質(zhì)鹽析中，通常采取中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉和磷酸鈉等。其中以硫酸銨最為慣用。這是因?yàn)榱蛩徜@在水中溶解度大而且溫度系數(shù)小，不影響酶活性，分離效果好，而且價(jià)廉易得。然而用硫酸銨進(jìn)行鹽析時(shí)，緩沖能力較差，而且銨離子存在會(huì)干擾蛋白質(zhì)測(cè)定，所以有時(shí)也用其它中性鹽進(jìn)行鹽析。在鹽析時(shí)，溶液中硫酸銨濃度通常以飽和度表示（指溶液中加入飽和硫酸銨體積與混合溶液總體積比值）解讀蛋白質(zhì)工程p204頁(yè)表7－3第18頁(yè)

有機(jī)溶劑之所以能使酶沉淀析出。主要是因?yàn)橛袡C(jī)溶劑存在會(huì)使溶液介電常數(shù)降低。比如，20℃時(shí)水介電常數(shù)為80，而82％乙醇水溶液介電常數(shù)為40。

溶液介電常數(shù)降低，就使溶質(zhì)分子間靜電引力增大，相互吸引而易于凝集，同時(shí)，對(duì)于含有水膜分子來(lái)說(shuō)，有機(jī)溶劑與水相互作用，使溶質(zhì)分子表面水膜破壞，也使其溶解度降低而沉淀析出。

慣用于酶沉淀分離有機(jī)溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、甲醇等第19頁(yè)第20頁(yè)2、離心分離

離心分離是借助于離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生離心力，使不一樣大小、不一樣密度物質(zhì)分離技術(shù)過(guò)程。在離心分離時(shí)，要依據(jù)欲分離物質(zhì)以及雜質(zhì)顆粒大小、密度和特征不一樣，選擇適當(dāng)離心機(jī)、離心方法和離心條件。

常速離心機(jī)又稱(chēng)為低速離心機(jī),其最大轉(zhuǎn)速在8000r/min以?xún)?nèi)，相對(duì)離心力（RCF）在1×104g以下，在酶分離純化過(guò)程中，主要用于細(xì)胞、細(xì)胞碎片和培養(yǎng)基殘?jiān)裙绦挝锓蛛x。也用于酶結(jié)晶等較大顆粒分離。第21頁(yè)高速離心機(jī)最大轉(zhuǎn)速為（1～2.5）×104r/min，相對(duì)離心力到達(dá)1×104～1×105g，在酶分離中主要用于沉淀、細(xì)胞碎片和細(xì)胞器等分離。有些高速離心機(jī)裝設(shè)有冷凍裝置,謂之高速冷凍離心機(jī)超速離心機(jī)最大轉(zhuǎn)速達(dá)(2.5～12)×104r/min，相對(duì)離心力能夠高達(dá)5×105g甚至更高。超速離心主要用于DNA、RNA、蛋白質(zhì)等生物大分子以及細(xì)胞器、病毒等分離純化；樣品純度檢測(cè)；沉降系數(shù)和相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定等。第22頁(yè)超速離心有三種：差速離心：采取不一樣離心速度和離心時(shí)間，使不一樣沉降速度顆粒分批分離方法密度梯度離心：使沉降系數(shù)比較靠近物質(zhì)得以分離一個(gè)區(qū)帶分離方法。必須預(yù)先配制好適宜密度梯度系統(tǒng)離心前將樣品小心地鋪放在預(yù)先制備好密度梯度溶液表面。（密度相近，分子量不一樣）梯度較淺，密度較低等密度梯度離心：分離密度不一樣顆粒，欲分離顆粒處于密度梯度中等密度點(diǎn)（平衡）才可停頓離心，操作時(shí)先把一定濃度介質(zhì)溶液與樣品液混合均勻。（密度不一樣，分子量相近）梯度陡峭，密度較高第23頁(yè)密度梯度離心前用密度梯度混合器預(yù)先配制密度梯度系統(tǒng)，貯液室與混合室截面積關(guān)系決定梯度類(lèi)型。配制中，將稀溶液置于貯液室B，濃溶液置于混合室A,如圖4-2(郭勇酶工程p96）流出梯度液經(jīng)過(guò)導(dǎo)管小心搜集于離心管，假如濃溶液置于貯液室B，稀溶液置于A室，梯度液導(dǎo)液管必須直插到離心管管底，讓以后流入濃度高混合液將先流入濃度較低混合液頂浮起來(lái)形成由管口到管底逐步升高密度梯度第24頁(yè)第25頁(yè)第26頁(yè)超速離心機(jī)按照其用途能夠分為制備用超速離心機(jī)、分析用超速離心機(jī)和分析-制備兩用超速離心機(jī)3種蛋白質(zhì)分子在離心時(shí)，其分子量、分子密度、組成、形狀

等，均會(huì)影響其沉降速率，沉降系數(shù)即用來(lái)描述此沉降性質(zhì)；其單位為S

(Svedbergunit)。

每一種沉降系數(shù)與其分子密度或分子量成正比。不一樣沉降系數(shù)蛋白質(zhì)，可利用超高速離心法，在密度梯度中作分離。第27頁(yè)3、過(guò)濾與膜分離過(guò)濾是借助于過(guò)濾介質(zhì)將不一樣大小、不一樣形狀物質(zhì)分離技術(shù)過(guò)程。過(guò)濾介質(zhì)各種多樣，慣用有濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷、燒結(jié)金屬和各種高分子膜等，能夠依據(jù)需要選取。過(guò)濾非膜過(guò)濾：采取高分子膜以外物質(zhì)作為過(guò)濾介質(zhì)

膜過(guò)濾：采取各種高分子膜為過(guò)濾介質(zhì)

第28頁(yè)過(guò)濾分類(lèi)及其特征(依據(jù)過(guò)濾介質(zhì)截留物質(zhì)顆粒大小不一樣

)

類(lèi)別截留顆粒大小截留主要物質(zhì)過(guò)濾介質(zhì)粗濾>2μm酵母、霉菌、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、固形物等濾紙、濾布、纖維多孔陶瓷、燒結(jié)金屬等微濾0.2～2μm細(xì)菌、灰塵等微濾膜、微孔陶瓷超濾20?～0.2μm病毒、生物大分子等超濾膜反滲透<20?生物小分子、鹽、離子反滲透膜第29頁(yè)

借助于一定孔徑高分子薄膜，將不一樣大小、不一樣形狀和不一樣特征物質(zhì)顆粒或分子進(jìn)行分離技術(shù)稱(chēng)為膜分離技術(shù)。膜分離所使用薄膜主要是由丙烯腈、醋酸纖維素、賽璐玢以及尼龍等高分子聚合物制成高分子膜。有時(shí)也能夠采取動(dòng)物膜等。膜分離過(guò)程中，薄膜作用是選擇性地讓小于其孔徑物質(zhì)顆?；蚍肿咏?jīng)過(guò)，而把大于其孔徑顆粒截留。膜孔徑有各種規(guī)格可供使用時(shí)選擇第30頁(yè)。膜分離加壓膜分離

微濾超濾反滲透電場(chǎng)膜分離

電滲析離子交換膜電滲析

擴(kuò)散膜分離透析第31頁(yè)依據(jù)膜材料和不一樣進(jìn)料液特征，商品應(yīng)用膜產(chǎn)品通常采取以下幾個(gè)結(jié)構(gòu)形式：管式；中空纖維；卷式；平板式。第32頁(yè)膜技術(shù)

截留物尺寸nm（分子量）

推進(jìn)力

分離機(jī)理微濾MF

>20(>40,000)

壓力差，>100kPa

篩分超濾UF

1～20(10,000--40,000)

壓力差>100kPa

篩分納濾NF

>1(100～1000)

壓力差，<1000kPa優(yōu)先吸附、表面電位反滲透RO

(>100)

壓力差，>1000kPa

優(yōu)先吸附、溶解擴(kuò)散

四種慣用膜分離技術(shù)基本特征

第33頁(yè)四種慣用膜分離過(guò)程截留特征第34頁(yè)4、層析分離層析技術(shù)，亦稱(chēng)色譜技術(shù)，是一個(gè)物理分離方法。它是利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)差異，使各組分以不一樣程度分布在兩個(gè)相中，其中一個(gè)相為固定(稱(chēng)為固定相)，另一個(gè)相則流過(guò)此固定相(稱(chēng)為流動(dòng)相)并使各組分以不一樣速度移動(dòng)，從而到達(dá)分離。第35頁(yè)層析方法分離依據(jù)吸附層析利用吸附劑對(duì)不一樣物質(zhì)吸附力不一樣而使混合物中各組分分離（分子表面特征）分配層析利用各組分在兩相中分配系數(shù)不一樣，而使各組分分離（溶解度）離子交換層析利用離子交換劑上可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）對(duì)各種離子親和力不一樣而抵達(dá)分離目標(biāo)（帶電性質(zhì)）凝膠層析以各種多孔凝膠為固定相，利用流動(dòng)相中所含各種組分相對(duì)分子質(zhì)量不一樣而抵達(dá)物質(zhì)分離（分子大小）親和層析利用生物分子與配基之間所含有專(zhuān)一而又可逆親和力，使生物分子分離純化（分子形狀）層析聚焦將酶等兩性物質(zhì)等電點(diǎn)特征與離子交換層析特征結(jié)合在一起，實(shí)現(xiàn)組分分離第36頁(yè)吸附層析

吸附層析是利用吸附劑對(duì)不一樣物質(zhì)吸附力不一樣而使混合物中各組分分離方法吸附層析通常采取柱型裝置，將吸附劑裝在吸附柱中，裝置成吸附層析柱。層析時(shí)，欲分離混合溶液自柱頂加入，當(dāng)樣品液全部進(jìn)入吸附層析柱后，再加入洗脫劑解吸洗脫。在洗脫時(shí)，層析柱內(nèi)不停發(fā)生解吸、吸附、再解吸、再吸附過(guò)程第37頁(yè)。

第38頁(yè)溶劑洗脫法－采取單一或混合溶劑進(jìn)行洗脫，各組分按照由弱到強(qiáng)次序先后流出，以洗脫液對(duì)組分濃度作圖呈峰狀，兩組分之間有一空白。若兩峰重合或拖尾現(xiàn)象出現(xiàn)，可采取按一定規(guī)律改變pH梯度或濃度梯度洗脫置換洗脫法－置換洗脫液中有一吸附力比被吸附組分更強(qiáng)物質(zhì)取代被吸附成份，后者按照吸附力由弱到強(qiáng)次序流出，以洗脫液對(duì)組分濃度作圖，可得到階梯式洗脫曲線前緣洗脫法－用含有各組分混合溶液本身作洗脫液，連續(xù)加入吸附層析柱，吸附劑飽和時(shí)吸附力最弱組分開(kāi)始最先流出。其洗脫曲線即使也呈階梯型，但只有吸附力最弱組分得以和其它組分分離，僅用于分析前緣組分分析第39頁(yè)分配層析定義：分配層析是利用各組分在兩相中分配系數(shù)不一樣，而使各組分分離方法分配系數(shù)：是指一個(gè)溶質(zhì)在兩種互不相溶溶劑中溶解到達(dá)平衡時(shí)，該溶質(zhì)在兩相溶劑中濃度比值。在層析條件確定后，層析系數(shù)是一常數(shù)第40頁(yè)

在分配層析中，通常采取一個(gè)多孔性固體支持物（如濾紙、硅藻土、纖維素等）吸著一個(gè)溶劑為固定相，這種溶劑在層析過(guò)程中一直固定在多孔支持物上。另一個(gè)與固定相溶劑互不相溶溶劑可沿著固定相流動(dòng)，稱(chēng)為流動(dòng)相。當(dāng)某溶質(zhì)在流動(dòng)相帶動(dòng)下流經(jīng)固定相時(shí)，該溶質(zhì)在兩相之間進(jìn)行連續(xù)動(dòng)態(tài)分配第41頁(yè)按固定相介質(zhì)分

紙上層析分配薄層層析分配氣相層析分配層析按固定相極性不一樣分為

正相分配層析（極性溶劑為固定相）

反相分配層析（非極性有機(jī)溶劑為固定相）第42頁(yè)離子層析離子交換層析是利用離子交換劑上可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）對(duì)各種離子親和力不一樣而到達(dá)分離目標(biāo)一個(gè)層析分離方法。離子交換劑是含有若干活性基團(tuán)不溶性高分子物質(zhì)。經(jīng)過(guò)在不溶性高分子物質(zhì)（母體）上引入若干可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）而制成。第43頁(yè)離子交換層析介質(zhì)由三部分組成：惰性支持物；帶電基團(tuán)；（帶電基團(tuán)）平衡離子通常所說(shuō)離子交換實(shí)際上是蛋白質(zhì)分子與平衡離子間相互交換，他們共同競(jìng)爭(zhēng)離子交換層析介質(zhì)中帶電基團(tuán)陽(yáng)離子交換層析－平衡離子為陽(yáng)離子，層析介質(zhì)帶電基團(tuán)帶有負(fù)電陰離子交換層析－平衡離子為陰離子，層析介質(zhì)帶電基團(tuán)帶有正電第44頁(yè)1、離子交換劑選擇應(yīng)依據(jù)欲分離組分特征和要求，過(guò)強(qiáng)吸附以及極端洗脫條件都可能造成活性分子變性失活；另外溶液pH直接決定離子交換劑活性基團(tuán)及組分離子解離程度，從而影響了離子交換劑交換容量和交換選擇性第45頁(yè)選擇離子交換劑時(shí)考慮原因：1）離子交換劑和組分離子物理化學(xué)性質(zhì)；2）組分離子所帶電荷種類(lèi)；3）溶液中組分離子濃度高低；4）組分離子質(zhì)量大?。?）組分離子與離子交換劑親和力大小第46頁(yè)2、離子交換劑處理1）溶脹、洗滌至澄清；2)4V2mol/LHCl進(jìn)行酸處理，洗滌；3)4V2mol/LNaOH進(jìn)行堿處理，洗滌；4）裝柱5）用適當(dāng)試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)型處理，使離子交換劑上所帶可交換離子轉(zhuǎn)變?yōu)樗桦x子比如，陽(yáng)離子交換劑（如）用NaOH處理，轉(zhuǎn)變?yōu)镹a+型，用HCl處理，轉(zhuǎn)變?yōu)镠+型；陰離子交換劑用NaOH處理，轉(zhuǎn)變?yōu)镺H-型，用HCl處理轉(zhuǎn)變?yōu)镃l-型第47頁(yè)離子交換劑有離子交換樹(shù)脂、纖維素、凝膠，一些大孔徑離子交換樹(shù)脂、纖維素、凝膠可用于酶分離純化。離子交換層析介質(zhì)吸附蛋白量很大，相比于分子篩層析，所用層析柱短而粗處理好離子交換劑能夠在交換槽中進(jìn)行分批離子交換，也能夠?qū)㈦x子交換劑裝進(jìn)離子交換柱進(jìn)行連續(xù)離子交換第48頁(yè)離子層析分離過(guò)程包含1、裝柱：干法裝柱和濕法裝柱，裝填成均勻、無(wú)氣泡、無(wú)裂縫離子交換柱2、上柱:轉(zhuǎn)型后，用溶劑或緩沖液進(jìn)行平衡，然后將欲分離混合液加入離子交換柱中。上柱時(shí)混合液中鹽離子濃度不能過(guò)高、還要注意混合液溫度和pH值上柱時(shí)要控制適當(dāng)流速3、洗脫：洗脫液應(yīng)該含有與離子交換劑親和力較大離子，要經(jīng)過(guò)試驗(yàn)確定洗脫流速。洗脫過(guò)程中，組分離子按照與交換劑親和力由大到小次序先后洗出。對(duì)多組分為到達(dá)良好分離效果，慣用濃度梯度或pH梯度洗脫法，每一個(gè)又可選取階段梯度洗脫或連續(xù)梯度洗脫，后者分辨率更高。第49頁(yè)離子層析分離過(guò)程包含4、搜集：與離子層析柱親和力最小組分先流出，經(jīng)過(guò)紫外檢測(cè)器檢測(cè)從層析柱中流出液體在280nm光吸收值，同時(shí)用部分搜集器搜集。以洗脫體積為橫坐標(biāo)，以280nm光吸收值為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線。依據(jù)洗脫峰位置，確定不一樣大小蛋白質(zhì)所在試管，深入用電泳伎倆判定目標(biāo)蛋白5、交換劑再生：酸－堿－酸處理堿－酸－堿處理第50頁(yè)第51頁(yè)凝膠層析

凝膠層析又稱(chēng)為凝膠過(guò)濾，分子排阻層析，分子篩層析等。是指以各種多孔凝膠為固定相，利用流動(dòng)相中所含各種組分相對(duì)分子質(zhì)量不一樣而到達(dá)物質(zhì)分離一個(gè)層析技術(shù)第52頁(yè)凝膠層析基本原理凝膠層析柱中裝有多孔凝膠，當(dāng)含有各種組分混合溶液流經(jīng)凝膠層析柱時(shí)，大分子物質(zhì)因?yàn)榉肿又睆酱?，不能進(jìn)入凝膠微孔，只能分布于凝膠顆粒間隙中，以較快速度流過(guò)凝膠柱。較小分子能進(jìn)入凝膠微孔內(nèi)，不停地進(jìn)出于一個(gè)個(gè)顆粒微孔內(nèi)外，這就使小分子物質(zhì)向下移動(dòng)速度比大分子速度慢，從而使混合溶液中各組分按照相對(duì)分子質(zhì)量由大到小次序先后流出層析柱，而到達(dá)分離目標(biāo)第53頁(yè)為了定量地衡量混合液中各組分流出次序，經(jīng)常采取分配系數(shù)Ka來(lái)量度

Ve洗脫體積，表示某一組分從加進(jìn)層析柱到最高峰出現(xiàn)時(shí)，所需洗脫液體積；Vo外體積，即為層析柱內(nèi)凝膠顆?？障吨g體積VI內(nèi)體積，即為層析柱內(nèi)凝膠顆粒內(nèi)部微孔體積Ka＝Ve-V0VI第54頁(yè)假如某組分分配系數(shù)Ka=0，即Ve=Vo，說(shuō)明該組分完全不能進(jìn)入凝膠微孔，洗脫是最先流出；假如某組分分配系數(shù)Ka=1，即Ve=Vo+VI，說(shuō)明該組分能夠自由地?cái)U(kuò)散進(jìn)入到凝膠顆粒內(nèi)部全部微孔，洗脫是最終流出；假如某組分分配系數(shù)Ka在0～1，說(shuō)明該組分分子大小介乎大分子和小分子之間，能夠進(jìn)入凝膠微孔，不過(guò)擴(kuò)散速度較慢，洗脫時(shí)按照Ka值由小到大次序先后流出。

第55頁(yè)第56頁(yè)在凝膠對(duì)組分沒(méi)有吸附作用情況下，且Ve=Vo+VI，全部組分都應(yīng)該被洗脫出來(lái)，Ka最大值為1當(dāng)Ka大于1時(shí)，說(shuō)明此層析不是單純凝膠層析，還存在吸附層析或離子交換層析對(duì)同一類(lèi)型化合物，凝膠層析洗脫特征與組分相對(duì)分子量呈函數(shù)關(guān)系，洗脫時(shí)組分按相對(duì)分子質(zhì)量由大到小次序先后流出。Ve=K1-K2lgM第57頁(yè)在實(shí)際應(yīng)用中，常以相對(duì)洗脫體積Kav對(duì)lgM作曲線，稱(chēng)為選擇曲線相對(duì)洗脫體積是指組分洗脫體積與層析柱內(nèi)凝膠床總體積之比值Kav＝Ve/Vt第58頁(yè)lgMKav3.54.04.55.05.56.001.00.5選擇曲線斜率說(shuō)明凝膠特征。每一類(lèi)型化合物都有其各自特定選擇曲線。如此圖所表示，能夠經(jīng)過(guò)凝膠層析測(cè)定物質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量第59頁(yè)凝膠選擇與處理慣用凝膠材料主要有葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠與瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠，層析用微孔凝膠是由凝膠材料與交聯(lián)劑交聯(lián)聚合而成，交聯(lián)劑有環(huán)氧氯丙烷選擇凝膠主要是依據(jù)欲分離組分分子質(zhì)量大小。凝膠顆粒直徑大小對(duì)層析柱內(nèi)溶液流速有一定影響，應(yīng)選擇大小比較均勻商品凝膠，使用前需將凝膠于洗脫液中充分溶脹。溶脹通常采取熱水溶脹（2－3小時(shí)），這么也到達(dá)消毒和排出凝膠內(nèi)氣泡目標(biāo)溶脹后凝膠用傾瀉法除去小顆粒，經(jīng)減壓排氣即可裝柱第60頁(yè)凝膠層析操作過(guò)程凝膠層析操作普通包含裝柱、上柱、洗脫等過(guò)程裝柱：柱內(nèi)先充滿(mǎn)洗脫劑，然后一邊攪拌一邊遲緩而連續(xù)地加入濃稠凝膠懸浮液，讓其自然沉降，分布均勻無(wú)氣泡和裂縫，直至所需高度。裝好后洗脫液浸沒(méi)凝膠表面。上柱：在洗脫液液面恰好與凝膠床表面相平時(shí)加入混合液。混合液體積通常為凝膠床體積10%左右，濃度可高些，黏度應(yīng)低。洗脫：洗脫液應(yīng)與干燥凝膠溶脹時(shí)及裝柱平衡時(shí)使用一致，體積普通為凝膠床體積120%，洗脫流出液分步搜集。第61頁(yè)凝膠層析操作過(guò)程（詳見(jiàn)蛋白質(zhì)工程p213）洗脫完成后，凝膠柱已經(jīng)恢復(fù)酶液上樣前狀態(tài)，不需再生處理就能夠重復(fù)進(jìn)行下一批分離純化。假如使用次數(shù)較多，或要純化不一樣品時(shí)，用2－3倍柱體積非離子去污劑除去吸附在凝膠中雜質(zhì)，或卸下凝膠，用0.2mol/LNaOH浸泡，再水洗。然后加入20%乙醇或0.04%NaN3在4－8℃長(zhǎng)久保留第62頁(yè)親和層析親和層析是利用生物分子與配基之間所含有專(zhuān)一而又可逆親和力，而使生物分子分離純化技術(shù)。酶與底物、酶與競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑、酶與輔助因子、抗原與抗體、酶RNA與互補(bǔ)RNA分子或片段、RNA與互補(bǔ)DNA分子或片段等之間，都是含有專(zhuān)一而又可逆親和力生物分子對(duì)。故此,親和層析在酶分離純化中有主要應(yīng)用第63頁(yè)親和層析技術(shù)特點(diǎn)是選擇性很高，可降低提純步驟在親和層析中,作為固定相一方稱(chēng)為配基(Ligand)，配基必須偶聯(lián)于不溶性母體(Matrix)上，母體又稱(chēng)為載體或擔(dān)體。普通采取瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、纖維素作母體當(dāng)小分子物質(zhì)(金屬離子等無(wú)機(jī)輔助因子、有機(jī)輔助因子等)作為配基時(shí)，因?yàn)榭臻g位阻作用，難以與配正確大分子親和吻合，需要在母體與配基之間引入適當(dāng)長(zhǎng)度連接臂（spacearm）

第64頁(yè)要使不溶性母體與配基偶聯(lián)或經(jīng)過(guò)連接臂與配基偶聯(lián)，都必須進(jìn)行母體活化。即經(jīng)過(guò)某種方法，如溴化氰法、疊氮法、高碘酸氧化法、環(huán)氧化法、甲苯磺酰氯法、雙功效試劑法等，使母體引入某種活潑基團(tuán)，才能以共價(jià)鍵與配基偶聯(lián)因?yàn)橛H和結(jié)合專(zhuān)一性強(qiáng)，洗脫條件要求高。在親和層析過(guò)程中，應(yīng)控制好溫度（0－10℃）、pH等條件，以免酶變性失活，親和層析劑免遭破壞。親和介質(zhì)昂貴，處理量不大，制備時(shí)只是在純化后期使用第65頁(yè)第66頁(yè)親和層析四個(gè)要素第67頁(yè)慣用親和介質(zhì)及專(zhuān)一性配體第68頁(yè)依據(jù)欲分離組分與配基結(jié)合特征,親和層析能夠分為：

共價(jià)親和層析 疏水層析(要區(qū)分疏水層析與反相層析) 金屬離子親和層析（試驗(yàn)方法見(jiàn)蛋白質(zhì)工程p218） 免疫親和層析 染料親和層析 凝集素親和層析

第69頁(yè)金屬離子親和層析

金屬離子親和層析是利用蛋白類(lèi)酶和其它蛋白表面組氨酸咪唑基團(tuán)、半胱氨酸巰基基團(tuán)、色氨酸吲哚基團(tuán)可與金屬離子發(fā)生可逆性親和結(jié)合特征，用螯合在母體上金屬離子對(duì)混合液中目標(biāo)蛋白進(jìn)行純化。要將酶或蛋白從親和層析柱上洗脫下來(lái)，可改變鹽濃度或pH（降低金屬離子和蛋白質(zhì)間親和常數(shù)），或采取競(jìng)爭(zhēng)性試劑將蛋白置換下來(lái)，可采取分級(jí)洗脫或梯度洗脫方式金屬離子親和層析主要優(yōu)點(diǎn)是可用不一樣金屬離子結(jié)合到螯合載體上，實(shí)現(xiàn)母體再生。第70頁(yè)

層析聚焦－將酶等兩性物質(zhì)等電點(diǎn)特征與離子交換層析結(jié)合在一起，實(shí)現(xiàn)組分分離層析技術(shù)第71頁(yè)5、電泳分離帶電粒子在電場(chǎng)中向著與其本身所帶電荷相反電極移動(dòng)過(guò)程稱(chēng)為電泳。顆粒在電場(chǎng)中移動(dòng)速度主要決定于其本身所帶凈電荷量，同時(shí)受顆粒形狀和顆粒大小影響。另外，還受到電場(chǎng)強(qiáng)度、溶液pH值、離子強(qiáng)度及支持體特征等外界條件影響。第72頁(yè)紙電泳自由電泳薄層電泳凝膠電泳薄膜電泳等電聚焦電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳瓊脂糖電泳連續(xù)凝膠電泳梯度凝膠電泳不連續(xù)凝膠電泳SDS-凝膠電泳電泳第73頁(yè)制備式電泳通常以不含SDS原態(tài)disc進(jìn)行，方便回收含有活性蛋白質(zhì)；蛋白質(zhì)樣本要先經(jīng)過(guò)部分純化，不然效果不佳，并先以分析式電泳確定所要色帶位置。第74頁(yè)第75頁(yè)電極緩沖液應(yīng)依據(jù)欲分離組分而定。一個(gè)為陰離子電泳系統(tǒng)，緩沖液pH為8－9，上槽接負(fù)極，下槽接正極，用溴酚藍(lán)為指示劑，適合用于普通蛋白質(zhì)和核酸分離；一個(gè)為陽(yáng)離子電泳系統(tǒng)，緩沖液pH為4左右，上槽接正極，下槽接負(fù)極，用亞甲基綠為指示劑，適合用于堿性蛋白質(zhì)電泳分離電泳試驗(yàn)方法主要要求看SDS－PAGE和雙向電泳（詳見(jiàn)《蛋白質(zhì)工程》p220-223）凝膠層析詳見(jiàn)《蛋白質(zhì)工程》p213金屬離子親和層析見(jiàn)《蛋白質(zhì)工程》

p218第76頁(yè)高效液相色譜（HPLC）高效液相色譜，將常規(guī)層析介質(zhì)制備成特殊高效液相色譜柱，它使用基質(zhì)珠更小，孔徑更均一，基質(zhì)填充比常規(guī)層析柱更致密，所以能夠耐受更大壓力，采取更加快洗脫速度，含有更高分辨率和重復(fù)性。高效液相色譜依據(jù)凝膠介質(zhì)分離原理不一樣，又可分為高效凝膠過(guò)濾色譜、高效離子交換色譜、高效疏水色譜、高效親和色譜第77頁(yè)6、萃取分離萃取分離是利用物質(zhì)在兩相中溶解度不一樣而使其分離技術(shù)。萃取分離中兩相普通為互不相溶兩個(gè)液相。有時(shí)也可采取其它流體。按照兩相組成不一樣，萃取能夠分為：

有機(jī)溶劑萃取 雙水相萃取 超臨界萃取 反膠束萃取

第78頁(yè)有機(jī)溶劑萃取在酶萃取過(guò)程中，有機(jī)溶劑要預(yù)冷至0－10℃，萃取過(guò)程在0－10℃低溫條件下進(jìn)行，并盡可能縮短酶與有機(jī)溶劑接觸時(shí)間第79頁(yè)雙水相萃取

雙水相系統(tǒng)普通是指將兩種親水性聚合物都加在水溶液中，當(dāng)超出某一濃度時(shí)，產(chǎn)生兩相，兩種聚合物分別溶于互不相溶兩相中（每種聚合物在上下相中分配比率不一樣）成相是因?yàn)榫酆衔锓肿涌臻g妨礙作用，無(wú)法相互滲透，不能形成均一相，從而含有相分離傾向。雙水相形成條件和定量關(guān)系可用相圖表示，對(duì)于兩種聚合物和水相組成系統(tǒng)，其相圖如圖4-8所表示。第80頁(yè)各種雙水相系統(tǒng)聚合物P聚合物Q或鹽聚丙二醇甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，羥丙基葡聚糖，葡聚糖聚乙二醇聚乙烯醇，葡聚糖，聚蔗糖甲基纖維素羥甲基葡聚糖，葡聚糖乙基羥乙基纖維素葡聚糖羥丙基葡聚糖葡聚糖聚蔗糖葡聚糖聚乙二醇硫酸鎂，硫酸銨，硫酸鈉，甲酸鈉，酒石酸鉀鈉第81頁(yè)圖4－7雙水相系統(tǒng)相圖在雙節(jié)線TCB下方區(qū)域是單相區(qū)，上方是雙相區(qū)。T點(diǎn)和B點(diǎn)分別表示到達(dá)平衡時(shí)上相組成和下相組成，在同一直線上各點(diǎn)分成兩相，含有相同組成，但體積比不一樣當(dāng)系線TMB下移，長(zhǎng)度減小，兩相之間差異逐步減小，到達(dá)臨界點(diǎn)C點(diǎn)時(shí)，系線長(zhǎng)度為零，到達(dá)均相。聚合物P%B′TBCT′聚合物Q或鹽%M第82頁(yè)雙節(jié)線位置和形狀與聚合物分子質(zhì)量相關(guān)，聚合物分子質(zhì)量越高，相分離所需濃度越低。在高分子聚合物上引入親和配基，能夠進(jìn)行雙水相親和萃取雙水相萃取不足：分離后酶液濃度低高分子聚合物在分離后需要分離除去第83頁(yè)超臨界萃取超臨界萃取又稱(chēng)超臨界流體萃取，是利用欲分離物質(zhì)與雜質(zhì)在超臨界流體中溶解度不一樣而到達(dá)分離一個(gè)萃取技術(shù)在相同壓力和溫度條件下，同一物質(zhì)液相和氣相物理特征是截然不一樣。當(dāng)溫度和壓力到達(dá)某一特定數(shù)值時(shí)，氣體和液體物理特征就會(huì)趨于相同，這個(gè)數(shù)值稱(chēng)為超臨界點(diǎn)。當(dāng)溫度和壓力超出其超臨界點(diǎn)時(shí)，兩相變?yōu)橐幌?，這種狀態(tài)下流體稱(chēng)為超臨界流體第84頁(yè)pTGLSSCF圖4-8超臨界系統(tǒng)相超臨界流體顯著特點(diǎn)：①其物理特征和傳質(zhì)特征介于液體和氣體之間，適于作萃取溶劑；②其含有和液體一樣溶解能力，含有很高萃取速度；③隨溫度和壓力改變，其對(duì)物質(zhì)萃取含有選擇性，萃取后易分離；④其黏度靠近于氣體黏度，利于物質(zhì)擴(kuò)散；第85頁(yè)作為萃取劑超臨界流體必須具備以下條件：具備良好化學(xué)穩(wěn)定性，對(duì)設(shè)備沒(méi)腐蝕性；臨界溫度不能太高或太低，最好在室溫或操作溫度附近；操作溫度應(yīng)低于被萃取溶質(zhì)分解溫度；臨界壓力不能太高，節(jié)約壓縮動(dòng)力；選擇性要好，輕易制得高純度制品；溶解度要高，可降低溶劑循環(huán)量；萃取劑要輕易取得，價(jià)格廉價(jià)第86頁(yè)CO2超臨界萃取工藝工程由萃取和分離兩個(gè)步驟組成，按分離方法不一樣，分離工藝過(guò)程分為：等壓分離：壓力相同，溫度升高，溶質(zhì)在CO2中溶解度降低而分離析出分離等溫分離：溫度相同，壓力下降，溶質(zhì)在CO2中溶解度降低而分離析出吸附分離：溫度壓力不變，分離罐中吸附劑吸附溶質(zhì)而分離溶質(zhì)在超臨界流體萃取中，為提升分離效果，在超臨界流體中添加少許另一溶劑，稱(chēng)為夾帶劑，如水、乙醇、丙酮。第87頁(yè)一些超臨界流體超臨界點(diǎn)和超臨界密度流體名稱(chēng)臨界溫度(℃)臨界壓力(Mpa)臨界密度（g/ml）乙烷C2H632.34.880.203丙