ICS65.020.01

CCSB16

15

內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)

DB15/T2957—2023

馬鈴薯晚疫病菌PCR檢測方法

DetectionofpathogenicfungusforpotatolateblightbyPCRmethod

2023-04-26發(fā)布2023-05-26實施

內(nèi)蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB15/T2957—2023

目次

前言.................................................................................II

1范圍...............................................................................1

2規(guī)范性引用文件.....................................................................1

3術(shù)語和定義.........................................................................1

4原理...............................................................................1

5試劑與儀器.........................................................................1

試劑...........................................................................1

溶液配制.......................................................................2

儀器...........................................................................2

6操作步驟...........................................................................2

對照的設(shè)立.....................................................................2

取樣...........................................................................2

馬鈴薯組織樣品DNA提取.........................................................2

PCR擴(kuò)增........................................................................2

7瓊脂糖凝膠電泳.....................................................................3

8結(jié)果判定...........................................................................3

試驗成立的條件.................................................................3

結(jié)果判定.......................................................................3

I

DB15/T2957—2023

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧廳提出。

本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)馬鈴薯標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會（SAM/TC40）歸口。

本文件起草單位：內(nèi)蒙古自治區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院、內(nèi)蒙古中加農(nóng)業(yè)生物科技有限公司、烏蘭察

布市檢驗檢測中心、內(nèi)蒙古朱日和鎮(zhèn)綜合保障和技術(shù)推廣中心。

本文件主要起草人：劉廣晶、劉曉權(quán)、包美麗、高曉娟、呂文霞、趙莉、高俊、齊桂敏、姜濤、李

燕、田艷花、趙欣、孫輝遠(yuǎn)、任瑋、常青、侯曉云、李建青、李藝凡、李翔、王慧娟、董志剛、王勐、

喬奇、王美霞。

II

DB15/T2957—2023

馬鈴薯晚疫病菌PCR檢測方法

1范圍

本文件規(guī)定了馬鈴薯晚疫病菌PCR檢測方法。

本文件適用于馬鈴薯植株、塊莖中晚疫病菌的檢測。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

馬鈴薯晚疫病potatolateblight

由致病疫霉(Phytophthorainfestans(Montagne)deBary)侵染引起馬鈴薯病害?？汕秩抉R鈴薯

的葉片、莖桿以及塊莖等。發(fā)病初期病斑多在葉尖和葉緣處形成水浸狀褪綠斑，后擴(kuò)大為圓形暗綠色斑，

病斑邊緣界限不明顯。在空氣濕度大時，病斑可擴(kuò)及葉的大半以及全葉，病斑邊緣有一環(huán)白色稀疏的霉

輪，莖部受害，可形成長短不一的褐色斑。塊莖發(fā)病，初為褐色或紫褐色不規(guī)則的病斑，稍凹陷，后期

導(dǎo)致薯肉不同深度的褐色壞死。潮濕條件下，莖稈和塊莖發(fā)病部位能夠形成白色稀疏的霉層。

4原理

本文件采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）方法檢測馬鈴薯晚疫病菌。其原

理是：以馬鈴薯晚疫病菌ITS序列區(qū)設(shè)計特異性引物，以基因組DNA為模板，在TaqDNA聚合酶的作

用下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)PCR擴(kuò)增結(jié)果判斷該樣品中是否含有目的片段，從而達(dá)到鑒定馬鈴薯晚疫

病菌的目的。

5試劑與儀器

試劑

5.1.1以下所有試劑，除另有規(guī)定外，均使用分析純試劑；水為符合GB/T6682中規(guī)定的一級水。

5.1.2植物基因組提取試劑盒、2×TaqPCRMasterMix、無水乙醇、50×TAE電泳緩沖液、溴化乙錠、

DNAMarker、6×DNALoadingBuffer等均從試劑公司購買。

1

DB15/T2957—2023

溶液配制

5.2.1溴化乙錠溶液（10mg/mL）

稱取溴化乙錠100mg，加水溶解，定容至10mL。

5.2.21×TAE電泳緩沖液

量取50×TAE電泳緩沖液20mL，加水定容至1L。

5.2.31.0%瓊脂糖凝膠

稱取1.0g瓊脂糖，加入100mL的1×TAE電泳緩沖液，微波爐加熱至瓊脂糖融化，待溶液冷卻至50℃

左右時，加入5μL溴化乙錠溶液，搖勻，倒入制膠板中均勻鋪板，凝固后取下梳子，備用。

儀器

PCR儀、臺式高速離心機(jī)（離心力1180g～12470g）、電泳儀、水平電泳槽、凝膠成像儀、水浴鍋、

移液器、高壓蒸汽滅菌鍋、4℃冰箱、普通天平（感量0.01g）。

6操作步驟

對照的設(shè)立

檢測體系以馬鈴薯晚疫病菌的DNA作為陽性對照，以不添加DNA模板的反應(yīng)體系作為陰性對照。

取樣

一塊地取發(fā)病馬鈴薯植株或塊莖組織，將樣品保存于4℃冰箱中，DNA提取時取馬鈴薯葉片或塊莖

組織0.2g，樣品需現(xiàn)用現(xiàn)取。

馬鈴薯組織樣品DNA提取

將樣品置于滅過菌的研缽中，加液氮研磨成粉末，轉(zhuǎn)至1.5mL離心管，利用植物基因組DNA提取

試劑盒提取。

PCR擴(kuò)增

6.4.1PCR擴(kuò)增引物

在ITS序列區(qū)設(shè)計引物，引物序列如下：

上游引物：5’-TGGGCGAGCCCTATCAAAA-3’。

下游引物：5’-CGATTCAAATGCCAAGCTAA-3’。

擴(kuò)增片段大小為613bp。

用超純水將上、下游引物分別配制成工作濃度為10ng/μL的溶液。

6.4.2PCR反應(yīng)體系

馬鈴薯晚疫病菌PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如表1所示，按照以下順序加入相應(yīng)試劑到PCR管中，混勻并離心

10s，使混合液都沉降到PCR管底。詳見表1。

2

DB15/T2957—2023

表1PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)物加入PCR反應(yīng)體系的體積

uL

ddH2O18.0

2×TaqPCRMasterMix4.0

上游引物（10ng/uL）1.0

下游引物（10ng/uL）1.0

模板DNA1.0

總體積