免疫學(xué)手段操作規(guī)程一、免疫學(xué)手段操作規(guī)程概述

免疫學(xué)手段在生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)診斷中具有廣泛應(yīng)用，其操作規(guī)程需嚴(yán)格遵循標(biāo)準(zhǔn)化流程，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。本規(guī)程涵蓋樣本準(zhǔn)備、試劑配制、實(shí)驗(yàn)操作及結(jié)果分析等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，旨在為相關(guān)實(shí)驗(yàn)人員提供規(guī)范化指導(dǎo)。

二、樣本準(zhǔn)備

（一）樣本采集

1.血液樣本：采用無(wú)菌采血管采集靜脈血，采集量根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求確定，一般5-10ml。

2.組織樣本：使用無(wú)菌手術(shù)器械采集新鮮組織，立即置于含冰鹽水的容器中保存。

3.尿液樣本：晨尿?yàn)橐耍杉罅⒓措x心（3000rpm，5min），取上清液保存。

（二）樣本處理

1.血液樣本：離心（3000rpm，10min）分離血漿，或直接用于細(xì)胞裂解。

2.組織樣本：用4%多聚甲醛固定（24h），或直接進(jìn)行冰凍切片。

3.尿液樣本：過(guò)濾（0.22μm膜），分裝后-80℃保存。

三、試劑配制

（一）緩沖液配制

1.PBS緩沖液：稱(chēng)取8gNaCl、0.2gKCl、1.4gNa?HPO?、0.2gKH?PO?，溶解后調(diào)節(jié)pH至7.4，定容至1L。

2.TBS緩沖液：稱(chēng)取0.8gTris、0.2gKCl、1.4gNaCl，溶解后調(diào)節(jié)pH至7.6，定容至1L。

（二）酶標(biāo)抗體配制

1.稀釋比例：根據(jù)說(shuō)明書(shū)調(diào)整抗體濃度，常用稀釋比例1:1000-1:5000。

2.封閉處理：加入5%脫脂奶粉或BSA，37℃封閉1-2h。

四、實(shí)驗(yàn)操作

（一）間接ELISA檢測(cè)

1.包被：將抗體檢測(cè)抗體（1μg/ml）加入酶標(biāo)板，4℃過(guò)夜。

2.洗滌：用PBST緩沖液（含0.05%Tween-20）洗滌3次，每次5min。

3.結(jié)合：加入樣本（稀釋后），37℃孵育1h。

4.洗滌：同步驟2。

5.顯色：加入TMB顯色液，室溫避光反應(yīng)15-30min。

6.終止：加入2MH?SO?終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值（450nm）。

（二）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

1.細(xì)胞染色：冰浴PBS洗滌細(xì)胞，加入抗體（如CD3-PE，濃度0.5μg/ml），避光孵育30min。

2.染色控制：設(shè)同型對(duì)照（IgG同型對(duì)照）。

3.上機(jī)檢測(cè)：用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記物，設(shè)置門(mén)控區(qū)域。

五、結(jié)果分析

（一）ELISA數(shù)據(jù)分析

1.標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制：使用標(biāo)準(zhǔn)品濃度對(duì)OD值作圖，擬合線(xiàn)性回歸方程。

2.樣本定量：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣本濃度（pg/ml或ng/ml）。

（二）流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)分析

1.數(shù)據(jù)導(dǎo)出：用FCS軟件導(dǎo)出原始數(shù)據(jù)，進(jìn)行Gates分析。

2.統(tǒng)計(jì)計(jì)算：計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比（%），或表達(dá)量平均值（MFI）。

六、注意事項(xiàng)

1.所有操作需在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行，避免污染。

2.試劑配制后需標(biāo)記濃度及日期，妥善保存。

3.實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需設(shè)置空白對(duì)照和陰性對(duì)照。

4.數(shù)據(jù)記錄需完整，包括樣本編號(hào)、試劑批號(hào)等信息。

一、免疫學(xué)手段操作規(guī)程概述

免疫學(xué)手段在生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)診斷中具有廣泛應(yīng)用，其操作規(guī)程需嚴(yán)格遵循標(biāo)準(zhǔn)化流程，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。本規(guī)程涵蓋樣本準(zhǔn)備、試劑配制、實(shí)驗(yàn)操作及結(jié)果分析等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，旨在為相關(guān)實(shí)驗(yàn)人員提供規(guī)范化指導(dǎo)。

二、樣本準(zhǔn)備

（一）樣本采集

1.血液樣本：采用無(wú)菌采血管采集靜脈血，采集量根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求確定，一般5-10ml。

（1）操作步驟：

a.使用75%酒精對(duì)采血部位進(jìn)行消毒，待酒精揮發(fā)。

b.用無(wú)菌采血針穿刺靜脈，首次采血棄去第一滴，避免組織液污染。

c.根據(jù)實(shí)驗(yàn)類(lèi)型選擇不同采血管（如肝素管用于凝血抑制，EDTA管用于有形成分分析）。

d.緩慢注入采血管，避免產(chǎn)生氣泡。

e.完成采集后，用無(wú)菌棉簽按壓穿刺點(diǎn)，避免血腫形成。

2.組織樣本：使用無(wú)菌手術(shù)器械采集新鮮組織，立即置于含冰鹽水的容器中保存。

（1）操作步驟：

a.使用無(wú)菌手術(shù)刀和鑷子，在無(wú)菌條件下切取目標(biāo)組織（大小約1cm3）。

b.立即將組織放入預(yù)冷的含0.1%NaN?的生理鹽水中，防止微生物污染。

c.如需固定，立即轉(zhuǎn)移至4%多聚甲醛溶液中（組織體積與固定液體積比1:10）。

d.如需進(jìn)行冰凍切片，將組織置于-80℃凍存管中快速冷凍。

3.尿液樣本：晨尿?yàn)橐?，采集后立即離心（3000rpm，5min），取上清液保存。

（1）操作步驟：

a.采集前避免飲用咖啡、酒精等可能影響尿液的物質(zhì)。

b.使用無(wú)菌容器收集尿液，首次尿液棄去，收集后續(xù)尿液。

c.立即置于離心機(jī)中，避免長(zhǎng)時(shí)間靜置導(dǎo)致細(xì)胞沉淀。

d.離心后取上清液，分裝至無(wú)菌EP管，-80℃保存。

（二）樣本處理

1.血液樣本：離心（3000rpm，10min）分離血漿，或直接用于細(xì)胞裂解。

（1）血漿分離：

a.血液采集后立即顛倒混勻，避免凝血。

b.置于室溫下靜置30min，使血細(xì)胞自然沉降。

c.3000rpm離心10min，小心吸取上層血漿，避免紅細(xì)胞污染。

d.如需長(zhǎng)期保存，加入終濃度0.1%NaN?防腐。

（2）細(xì)胞裂解：

a.使用淋巴細(xì)胞分離液（如Ficoll）進(jìn)行密度梯度離心（1500rpm，30min）。

b.吸取界面細(xì)胞，用PBS洗滌2次，去除殘留分離液。

c.加入裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑），冰浴裂解30min。

2.組織樣本：用4%多聚甲醛固定（24h），或直接進(jìn)行冰凍切片。

（1）多聚甲醛固定：

a.將組織置于新鮮配制的4%多聚甲醛溶液中，置于4℃冰箱固定。

b.固定24h后，用30%蔗糖溶液梯度脫水（更換蔗糖溶液2次，每次12h）。

c.終濃度為30%蔗糖溶液中，-20℃過(guò)夜，用于冰凍切片。

（2）冰凍切片：

a.將組織置于-80℃冷凍24h以上，使組織充分冷凍。

b.使用冷凍切片機(jī)（切片厚度10-20μm），切取組織片。

c.切片置于載玻片上，立即置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.尿液樣本：過(guò)濾（0.22μm膜），分裝后-80℃保存。

（1）過(guò)濾操作：

a.使用無(wú)菌濾器（0.22μm膜），預(yù)潤(rùn)洗3次（每次5mlPBS）。

b.將尿液樣本緩慢倒入濾器，避免沖破濾膜。

c.收集濾液，用無(wú)菌EP管分裝（每管500μl）。

d.加入終濃度10%DMSO作為凍存保護(hù)劑，-80℃保存。

三、試劑配制

（一）緩沖液配制

1.PBS緩沖液：稱(chēng)取8gNaCl、0.2gKCl、1.4gNa?HPO?、0.2gKH?PO?，溶解后調(diào)節(jié)pH至7.4，定容至1L。

（1）配制步驟：

a.將NaCl、KCl、Na?HPO?、KH?PO?依次加入燒杯中，用蒸餾水溶解。

b.使用磁力攪拌器攪拌至完全溶解。

c.用HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4（使用pH計(jì)監(jiān)測(cè)）。

d.攪拌均勻后，轉(zhuǎn)移至容量瓶，用蒸餾水定容至刻度。

e.濾膜（0.22μm）過(guò)濾除菌后，分裝冷藏保存。

2.TBS緩沖液：稱(chēng)取0.8gTris、0.2gKCl、1.4gNaCl，溶解后調(diào)節(jié)pH至7.6，定容至1L。

（1）配制步驟：

a.將Tris、KCl、NaCl依次加入燒杯中，用蒸餾水溶解。

b.使用磁力攪拌器攪拌至完全溶解。

c.用HCl調(diào)節(jié)pH至7.6（使用pH計(jì)監(jiān)測(cè)）。

d.攪拌均勻后，轉(zhuǎn)移至容量瓶，用蒸餾水定容至刻度。

e.濾膜（0.22μm）過(guò)濾除菌后，分裝冷藏保存。

（二）酶標(biāo)抗體配制

1.稀釋比例：根據(jù)說(shuō)明書(shū)調(diào)整抗體濃度，常用稀釋比例1:1000-1:5000。

（1）稀釋方法：

a.使用PBS或TBS緩沖液作為稀釋液。

b.取100μl抗體原液，加入900μl稀釋液，混勻后備用。

c.如需4℃保存，可加入5%蔗糖或甘露醇穩(wěn)定抗體。

2.封閉處理：加入5%脫脂奶粉或BSA，37℃封閉1-2h。

（1）操作步驟：

a.將包被好的酶標(biāo)板用封閉液（含5%脫脂奶粉或BSA的PBS/TBS緩沖液）填充。

b.置于37℃恒溫箱中封閉，濕度保持在95%以上。

c.封閉結(jié)束后，用PBST緩沖液洗滌3次，每次5min，去除未結(jié)合的封閉劑。

四、實(shí)驗(yàn)操作

（一）間接ELISA檢測(cè)

1.包被：將抗體檢測(cè)抗體（1μg/ml）加入酶標(biāo)板，4℃過(guò)夜。

（1）操作步驟：

a.使用移液器將抗體加入酶標(biāo)板各孔，每孔100μl。

b.將酶標(biāo)板置于4℃冰箱，用密封膜封口過(guò)夜。

c.次日取出，室溫恢復(fù)至室溫。

2.洗滌：用PBST緩沖液（含0.05%Tween-20）洗滌3次，每次5min。

（1）操作步驟：

a.打開(kāi)酶標(biāo)板，棄去孔內(nèi)液體。

b.向每孔加入300μlPBST洗滌液，輕拍酶標(biāo)板邊緣使液體均勻分布。

c.棄去液體，重復(fù)操作2次。

d.最后一次洗滌后，倒置放置，吸去殘留液體。

3.結(jié)合：加入樣本（稀釋后），37℃孵育1h。

（1）操作步驟：

a.將樣本用PBS/TBS緩沖液按1:100-1:1000稀釋。

b.使用移液器將稀釋后的樣本加入酶標(biāo)板各孔，每孔100μl。

c.置于37℃恒溫箱中孵育，濕度保持在95%以上。

4.洗滌：同步驟2。

5.顯色：加入TMB顯色液，室溫避光反應(yīng)15-30min。

（1）操作步驟：

a.棄去孔內(nèi)液體，加入100μlTMB顯色液。

b.避光條件下，使用振蕩器輕輕振蕩酶標(biāo)板（60rpm）。

c.反應(yīng)時(shí)間根據(jù)OD值變化確定，一般15-30min。

6.終止：加入2MH?SO?終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值（450nm）。

（1）操作步驟：

a.快速加入50μl2MH?SO?至每孔，立即混勻。

b.靜置10min后，使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處檢測(cè)OD值。

c.設(shè)置參考波長(zhǎng)（如630nm）校正背景吸收。

（二）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

1.細(xì)胞染色：冰浴PBS洗滌細(xì)胞，加入抗體（如CD3-PE，濃度0.5μg/ml），避光孵育30min。

（1）操作步驟：

a.使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度，用PBS將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×10?cells/ml。

b.將細(xì)胞置于冰浴中，用PBS洗滌1次，去除殘留培養(yǎng)基。

c.加入CD3-PE抗體（0.5μg/ml），避光孵育30min。

d.期間每隔5min混勻細(xì)胞懸液，防止抗體聚集。

2.染色控制：設(shè)同型對(duì)照（IgG同型對(duì)照）。

（1）操作步驟：

a.取等量細(xì)胞，加入IgG同型對(duì)照抗體（0.5μg/ml）。

b.避光孵育條件同步驟1。

c.用于流式細(xì)胞術(shù)比較非特異性結(jié)合。

3.上機(jī)檢測(cè)：用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記物，設(shè)置門(mén)控區(qū)域。

（1）操作步驟：

a.使用FACS流式細(xì)胞儀，設(shè)置488nm激光激發(fā)PE熒光。

b.調(diào)整電壓參數(shù)，確保PE信號(hào)在檢測(cè)范圍內(nèi)。

c.設(shè)置門(mén)控區(qū)域（如FSC/SSC散點(diǎn)圖排除死細(xì)胞），檢測(cè)CD3陽(yáng)性細(xì)胞百分比。

d.每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)3次，取平均值。

五、結(jié)果分析

（一）ELISA數(shù)據(jù)分析

1.標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制：使用標(biāo)準(zhǔn)品濃度對(duì)OD值作圖，擬合線(xiàn)性回歸方程。

（1）操作步驟：

a.使用標(biāo)準(zhǔn)品系列（如濃度梯度為0,10,50,100,500pg/ml）。

b.每個(gè)濃度重復(fù)檢測(cè)3次，計(jì)算平均OD值。

c.以濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

d.使用線(xiàn)性回歸分析，擬合方程式（y=mx+b）。

2.樣本定量：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣本濃度（pg/ml或ng/ml）。

（1）操作步驟：

a.將樣本OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程，計(jì)算濃度值。

b.樣本濃度=標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率×樣本OD值-標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)截距。

c.計(jì)算結(jié)果保留三位小數(shù)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（如t檢驗(yàn)）。

（二）流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)分析

1.數(shù)據(jù)導(dǎo)出：用FCS軟件導(dǎo)出原始數(shù)據(jù)，進(jìn)行Gates分析。

（1）操作步驟：

a.使用FCSExpress或FlowJo軟件，導(dǎo)出FCS原始數(shù)據(jù)文件。

b.在FSC/SSC散點(diǎn)圖上設(shè)置門(mén)控區(qū)域，排除細(xì)胞碎片和死細(xì)胞（如FSC低、SSC低）。

c.在PE通道直方圖上確定CD3陽(yáng)性細(xì)胞群體。

2.統(tǒng)計(jì)計(jì)算：計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比（%），或表達(dá)量平均值（MFI）。

（1）操作步驟：

a.計(jì)算CD3陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比。

b.計(jì)算PE熒光強(qiáng)度的平均值（MFI），反映標(biāo)記強(qiáng)度。

c.比較不同實(shí)驗(yàn)組間差異，使用ANOVA或t檢驗(yàn)。

六、注意事項(xiàng)

1.所有操作需在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行，避免污染。

（1）實(shí)驗(yàn)臺(tái)面需每日使用70%酒精消毒。

（2）操作前需用酒精燈火焰滅菌移液器吸頭。

2.試劑配制后需標(biāo)記濃度及日期，妥善保存。

（1）所有試劑瓶需貼上標(biāo)簽，注明名稱(chēng)、濃度、配制日期。

（2）緩沖液需在4℃冰箱保存，避免反復(fù)凍融。

3.實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需設(shè)置空白對(duì)照和陰性對(duì)照。

（1）空白對(duì)照：不加樣本或抗體的包被孔。

（2）陰性對(duì)照：不加目標(biāo)抗體的細(xì)胞染色孔。

4.數(shù)據(jù)記錄需完整，包括樣本編號(hào)、試劑批號(hào)等信息。

（1）使用實(shí)驗(yàn)記錄本詳細(xì)記錄每一步操作參數(shù)。

（2）保存原始數(shù)據(jù)文件，并標(biāo)注實(shí)驗(yàn)條件。

一、免疫學(xué)手段操作規(guī)程概述

免疫學(xué)手段在生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)診斷中具有廣泛應(yīng)用，其操作規(guī)程需嚴(yán)格遵循標(biāo)準(zhǔn)化流程，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。本規(guī)程涵蓋樣本準(zhǔn)備、試劑配制、實(shí)驗(yàn)操作及結(jié)果分析等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，旨在為相關(guān)實(shí)驗(yàn)人員提供規(guī)范化指導(dǎo)。

二、樣本準(zhǔn)備

（一）樣本采集

1.血液樣本：采用無(wú)菌采血管采集靜脈血，采集量根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求確定，一般5-10ml。

2.組織樣本：使用無(wú)菌手術(shù)器械采集新鮮組織，立即置于含冰鹽水的容器中保存。

3.尿液樣本：晨尿?yàn)橐?，采集后立即離心（3000rpm，5min），取上清液保存。

（二）樣本處理

1.血液樣本：離心（3000rpm，10min）分離血漿，或直接用于細(xì)胞裂解。

2.組織樣本：用4%多聚甲醛固定（24h），或直接進(jìn)行冰凍切片。

3.尿液樣本：過(guò)濾（0.22μm膜），分裝后-80℃保存。

三、試劑配制

（一）緩沖液配制

1.PBS緩沖液：稱(chēng)取8gNaCl、0.2gKCl、1.4gNa?HPO?、0.2gKH?PO?，溶解后調(diào)節(jié)pH至7.4，定容至1L。

2.TBS緩沖液：稱(chēng)取0.8gTris、0.2gKCl、1.4gNaCl，溶解后調(diào)節(jié)pH至7.6，定容至1L。

（二）酶標(biāo)抗體配制

1.稀釋比例：根據(jù)說(shuō)明書(shū)調(diào)整抗體濃度，常用稀釋比例1:1000-1:5000。

2.封閉處理：加入5%脫脂奶粉或BSA，37℃封閉1-2h。

四、實(shí)驗(yàn)操作

（一）間接ELISA檢測(cè)

1.包被：將抗體檢測(cè)抗體（1μg/ml）加入酶標(biāo)板，4℃過(guò)夜。

2.洗滌：用PBST緩沖液（含0.05%Tween-20）洗滌3次，每次5min。

3.結(jié)合：加入樣本（稀釋后），37℃孵育1h。

4.洗滌：同步驟2。

5.顯色：加入TMB顯色液，室溫避光反應(yīng)15-30min。

6.終止：加入2MH?SO?終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值（450nm）。

（二）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

1.細(xì)胞染色：冰浴PBS洗滌細(xì)胞，加入抗體（如CD3-PE，濃度0.5μg/ml），避光孵育30min。

2.染色控制：設(shè)同型對(duì)照（IgG同型對(duì)照）。

3.上機(jī)檢測(cè)：用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記物，設(shè)置門(mén)控區(qū)域。

五、結(jié)果分析

（一）ELISA數(shù)據(jù)分析

1.標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制：使用標(biāo)準(zhǔn)品濃度對(duì)OD值作圖，擬合線(xiàn)性回歸方程。

2.樣本定量：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣本濃度（pg/ml或ng/ml）。

（二）流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)分析

1.數(shù)據(jù)導(dǎo)出：用FCS軟件導(dǎo)出原始數(shù)據(jù)，進(jìn)行Gates分析。

2.統(tǒng)計(jì)計(jì)算：計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比（%），或表達(dá)量平均值（MFI）。

六、注意事項(xiàng)

1.所有操作需在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行，避免污染。

2.試劑配制后需標(biāo)記濃度及日期，妥善保存。

3.實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需設(shè)置空白對(duì)照和陰性對(duì)照。

4.數(shù)據(jù)記錄需完整，包括樣本編號(hào)、試劑批號(hào)等信息。

一、免疫學(xué)手段操作規(guī)程概述

免疫學(xué)手段在生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)診斷中具有廣泛應(yīng)用，其操作規(guī)程需嚴(yán)格遵循標(biāo)準(zhǔn)化流程，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。本規(guī)程涵蓋樣本準(zhǔn)備、試劑配制、實(shí)驗(yàn)操作及結(jié)果分析等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，旨在為相關(guān)實(shí)驗(yàn)人員提供規(guī)范化指導(dǎo)。

二、樣本準(zhǔn)備

（一）樣本采集

1.血液樣本：采用無(wú)菌采血管采集靜脈血，采集量根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求確定，一般5-10ml。

（1）操作步驟：

a.使用75%酒精對(duì)采血部位進(jìn)行消毒，待酒精揮發(fā)。

b.用無(wú)菌采血針穿刺靜脈，首次采血棄去第一滴，避免組織液污染。

c.根據(jù)實(shí)驗(yàn)類(lèi)型選擇不同采血管（如肝素管用于凝血抑制，EDTA管用于有形成分分析）。

d.緩慢注入采血管，避免產(chǎn)生氣泡。

e.完成采集后，用無(wú)菌棉簽按壓穿刺點(diǎn)，避免血腫形成。

2.組織樣本：使用無(wú)菌手術(shù)器械采集新鮮組織，立即置于含冰鹽水的容器中保存。

（1）操作步驟：

a.使用無(wú)菌手術(shù)刀和鑷子，在無(wú)菌條件下切取目標(biāo)組織（大小約1cm3）。

b.立即將組織放入預(yù)冷的含0.1%NaN?的生理鹽水中，防止微生物污染。

c.如需固定，立即轉(zhuǎn)移至4%多聚甲醛溶液中（組織體積與固定液體積比1:10）。

d.如需進(jìn)行冰凍切片，將組織置于-80℃凍存管中快速冷凍。

3.尿液樣本：晨尿?yàn)橐?，采集后立即離心（3000rpm，5min），取上清液保存。

（1）操作步驟：

a.采集前避免飲用咖啡、酒精等可能影響尿液的物質(zhì)。

b.使用無(wú)菌容器收集尿液，首次尿液棄去，收集后續(xù)尿液。

c.立即置于離心機(jī)中，避免長(zhǎng)時(shí)間靜置導(dǎo)致細(xì)胞沉淀。

d.離心后取上清液，分裝至無(wú)菌EP管，-80℃保存。

（二）樣本處理

1.血液樣本：離心（3000rpm，10min）分離血漿，或直接用于細(xì)胞裂解。

（1）血漿分離：

a.血液采集后立即顛倒混勻，避免凝血。

b.置于室溫下靜置30min，使血細(xì)胞自然沉降。

c.3000rpm離心10min，小心吸取上層血漿，避免紅細(xì)胞污染。

d.如需長(zhǎng)期保存，加入終濃度0.1%NaN?防腐。

（2）細(xì)胞裂解：

a.使用淋巴細(xì)胞分離液（如Ficoll）進(jìn)行密度梯度離心（1500rpm，30min）。

b.吸取界面細(xì)胞，用PBS洗滌2次，去除殘留分離液。

c.加入裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑），冰浴裂解30min。

2.組織樣本：用4%多聚甲醛固定（24h），或直接進(jìn)行冰凍切片。

（1）多聚甲醛固定：

a.將組織置于新鮮配制的4%多聚甲醛溶液中，置于4℃冰箱固定。

b.固定24h后，用30%蔗糖溶液梯度脫水（更換蔗糖溶液2次，每次12h）。

c.終濃度為30%蔗糖溶液中，-20℃過(guò)夜，用于冰凍切片。

（2）冰凍切片：

a.將組織置于-80℃冷凍24h以上，使組織充分冷凍。

b.使用冷凍切片機(jī)（切片厚度10-20μm），切取組織片。

c.切片置于載玻片上，立即置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.尿液樣本：過(guò)濾（0.22μm膜），分裝后-80℃保存。

（1）過(guò)濾操作：

a.使用無(wú)菌濾器（0.22μm膜），預(yù)潤(rùn)洗3次（每次5mlPBS）。

b.將尿液樣本緩慢倒入濾器，避免沖破濾膜。

c.收集濾液，用無(wú)菌EP管分裝（每管500μl）。

d.加入終濃度10%DMSO作為凍存保護(hù)劑，-80℃保存。

三、試劑配制

（一）緩沖液配制

1.PBS緩沖液：稱(chēng)取8gNaCl、0.2gKCl、1.4gNa?HPO?、0.2gKH?PO?，溶解后調(diào)節(jié)pH至7.4，定容至1L。

（1）配制步驟：

a.將NaCl、KCl、Na?HPO?、KH?PO?依次加入燒杯中，用蒸餾水溶解。

b.使用磁力攪拌器攪拌至完全溶解。

c.用HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4（使用pH計(jì)監(jiān)測(cè)）。

d.攪拌均勻后，轉(zhuǎn)移至容量瓶，用蒸餾水定容至刻度。

e.濾膜（0.22μm）過(guò)濾除菌后，分裝冷藏保存。

2.TBS緩沖液：稱(chēng)取0.8gTris、0.2gKCl、1.4gNaCl，溶解后調(diào)節(jié)pH至7.6，定容至1L。

（1）配制步驟：

a.將Tris、KCl、NaCl依次加入燒杯中，用蒸餾水溶解。

b.使用磁力攪拌器攪拌至完全溶解。

c.用HCl調(diào)節(jié)pH至7.6（使用pH計(jì)監(jiān)測(cè)）。

d.攪拌均勻后，轉(zhuǎn)移至容量瓶，用蒸餾水定容至刻度。

e.濾膜（0.22μm）過(guò)濾除菌后，分裝冷藏保存。

（二）酶標(biāo)抗體配制

1.稀釋比例：根據(jù)說(shuō)明書(shū)調(diào)整抗體濃度，常用稀釋比例1:1000-1:5000。

（1）稀釋方法：

a.使用PBS或TBS緩沖液作為稀釋液。

b.取100μl抗體原液，加入900μl稀釋液，混勻后備用。

c.如需4℃保存，可加入5%蔗糖或甘露醇穩(wěn)定抗體。

2.封閉處理：加入5%脫脂奶粉或BSA，37℃封閉1-2h。

（1）操作步驟：

a.將包被好的酶標(biāo)板用封閉液（含5%脫脂奶粉或BSA的PBS/TBS緩沖液）填充。

b.置于37℃恒溫箱中封閉，濕度保持在95%以上。

c.封閉結(jié)束后，用PBST緩沖液洗滌3次，每次5min，去除未結(jié)合的封閉劑。

四、實(shí)驗(yàn)操作

（一）間接ELISA檢測(cè)

1.包被：將抗體檢測(cè)抗體（1μg/ml）加入酶標(biāo)板，4℃過(guò)夜。

（1）操作步驟：

a.使用移液器將抗體加入酶標(biāo)板各孔，每孔100μl。

b.將酶標(biāo)板置于4℃冰箱，用密封膜封口過(guò)夜。

c.次日取出，室溫恢復(fù)至室溫。

2.洗滌：用PBST緩沖液（含0.05%Tween-20）洗滌3次，每次5min。

（1）操作步驟：

a.打開(kāi)酶標(biāo)板，棄去孔內(nèi)液體。

b.向每孔加入300μlPBST洗滌液，輕拍酶標(biāo)板邊緣使液體均勻分布。

c.棄去液體，重復(fù)操作2次。

d.最后一次洗滌后，倒置放置，吸去殘留液體。

3.結(jié)合：加入樣本（稀釋后），37℃孵育1h。

（1）操作步驟：

a.將樣本用PBS/TBS緩沖液按1:100-1:1000稀釋。

b.使用移液器將稀釋后的樣本加入酶標(biāo)板各孔，每孔100μl。

c.置于37℃恒溫箱中孵育，濕度保持在95%以上。

4.洗滌：同步驟2。

5.顯色：加入TMB顯色液，室溫避光反應(yīng)15-30min。

（1）操作步驟：

a.棄去孔內(nèi)液體，加入100μlTMB顯色液。

b.避光條件下，使用振蕩器輕輕振蕩酶標(biāo)板（60rpm）。

c.反應(yīng)時(shí)間根據(jù)OD值變化確定，一般15-30min。

6.終止：加入2MH?SO?終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值（450nm）。

（1）操作步驟：

a.快速加入50μl2MH?SO?至每孔，立即混勻。

b.靜置10min后，使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處檢測(cè)OD值。

c.設(shè)置參考波長(zhǎng)（如630nm）校正背景吸收。

（二）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

1.細(xì)胞染色：冰浴PBS洗滌細(xì)胞，加入抗體（如CD3-PE，濃度0.5μg/ml），避光孵育30min。

（1）操作步驟：

a.使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度，用PBS將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×10?cells/ml。

b.將細(xì)胞置于冰浴中，用PBS洗滌1次，去除殘留培養(yǎng)基。

c.加入CD3-PE抗體（0.5μg/ml），避光孵育30min。

d.期間每隔5min混勻細(xì)胞懸液，防止抗體聚集。

2.染色控制：設(shè)同型對(duì)照（IgG同型對(duì)照）。

（1）操作步驟：

a.取等量細(xì)胞，加入IgG同型對(duì)照抗體（0.5μg/ml）。

b.避光孵育