基于魯米諾電化學(xué)發(fā)光的GSK-3β生物傳感器：構(gòu)建、性能及應(yīng)用探索一、引言1.1研究背景與意義生物傳感器作為現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)和分析化學(xué)領(lǐng)域的關(guān)鍵技術(shù)，在疾病診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品安全等多個(gè)方面發(fā)揮著不可或缺的作用。它能夠?qū)⑸镒R(shí)別元件與物理或化學(xué)換能器相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)生物分子、細(xì)胞、病原體等目標(biāo)物的高靈敏度、高選擇性檢測(cè)，為生命科學(xué)研究和臨床應(yīng)用提供了重要的分析手段。魯米諾作為一種經(jīng)典的電化學(xué)發(fā)光試劑，具有獨(dú)特的發(fā)光特性。在堿性條件下，魯米諾能夠與過氧化氫等氧化劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生強(qiáng)烈的化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象。其發(fā)光過程基于分子的氧化還原反應(yīng)，通過形成激發(fā)態(tài)中間體，當(dāng)中間體回到基態(tài)時(shí)釋放出光子，從而產(chǎn)生可檢測(cè)的光信號(hào)。這種發(fā)光特性使得魯米諾在分析化學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，尤其是在電化學(xué)發(fā)光分析中，魯米諾因其高靈敏度、良好的選擇性以及相對(duì)簡(jiǎn)單的反應(yīng)體系，成為構(gòu)建電化學(xué)發(fā)光生物傳感器的重要材料之一。糖原合酶激酶-3β（GSK-3β）是一種在生物體內(nèi)具有重要生物學(xué)功能的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。它參與了眾多關(guān)鍵的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡以及代謝等生理過程起著至關(guān)重要的調(diào)控作用。在正常生理狀態(tài)下，GSK-3β的活性受到嚴(yán)格的調(diào)控，以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和正常的生理功能。然而，大量的研究表明，GSK-3β的異常表達(dá)或活性失調(diào)與多種嚴(yán)重的人類疾病密切相關(guān)。在神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病中，GSK-3β的過度激活會(huì)導(dǎo)致tau蛋白的過度磷酸化，進(jìn)而形成神經(jīng)纖維纏結(jié)，這是阿爾茨海默病的重要病理特征之一；同時(shí)，它還會(huì)促進(jìn)β-淀粉樣蛋白的沉積，進(jìn)一步加劇神經(jīng)細(xì)胞的損傷和死亡，導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙和記憶力減退。在糖尿病方面，GSK-3β會(huì)干擾胰島素信號(hào)通路，抑制糖原合成，從而影響血糖的正常代謝，導(dǎo)致血糖水平升高。此外，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，GSK-3β也參與了腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程，其異?；钚耘c腫瘤的惡性程度和預(yù)后密切相關(guān)。鑒于GSK-3β在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要性以及魯米諾電化學(xué)發(fā)光技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，開發(fā)基于魯米諾電化學(xué)發(fā)光的GSK-3β生物傳感器具有重要的研究?jī)r(jià)值和實(shí)際應(yīng)用意義。這種生物傳感器能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)GSK-3β的快速、準(zhǔn)確檢測(cè)，為相關(guān)疾病的早期診斷提供了一種高靈敏度的檢測(cè)方法，有助于疾病的早期發(fā)現(xiàn)和及時(shí)治療，提高患者的治愈率和生活質(zhì)量。同時(shí)，在藥物研發(fā)領(lǐng)域，該傳感器可以用于評(píng)估GSK-3β抑制劑的活性和篩選潛在的治療藥物，加速新藥的研發(fā)進(jìn)程，為攻克相關(guān)疾病提供有力的技術(shù)支持。此外，在生命科學(xué)研究中，它還能夠幫助研究人員深入探究GSK-3β在各種生理和病理過程中的作用機(jī)制，推動(dòng)相關(guān)領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究進(jìn)展。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在魯米諾電化學(xué)發(fā)光原理的研究方面，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已取得了較為深入的成果。魯米諾（3-氨基-苯二甲酰肼）在堿性介質(zhì)中，其電化學(xué)發(fā)光原理主要基于兩步氧化反應(yīng)。第一步，魯米諾在電極表面失去電子被氧化為魯米諾自由基陰離子；第二步，該自由基陰離子進(jìn)一步被氧化開環(huán)，生成激發(fā)態(tài)的3-氨基鄰苯二甲酸根離子，當(dāng)它從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)，便會(huì)釋放出光子，產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象。也有研究表明，魯米諾的電化學(xué)發(fā)光可能涉及自由基過程，在氧化還原過程中形成的自由基在相應(yīng)條件下，可在未氧化開環(huán)時(shí)輻射光信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)可逆的電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。這一發(fā)現(xiàn)為研制電化學(xué)發(fā)光傳感器和檢測(cè)器提供了更豐富的理論基礎(chǔ)。在魯米諾電化學(xué)發(fā)光體系的研究中，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)多種納米材料可顯著增強(qiáng)魯米諾的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)。如納米二氧化鈦，當(dāng)粒徑較小且經(jīng)特定溫度煅燒處理形成混晶時(shí)，修飾有納米二氧化鈦的電極對(duì)魯米諾電化學(xué)發(fā)光的增敏效果明顯，可達(dá)到裸電極的數(shù)倍。其增敏機(jī)制主要是納米二氧化鈦具有較大的比表面積，能提供更多的活性位點(diǎn)，促進(jìn)魯米諾的氧化反應(yīng)，同時(shí)還能加速電子傳遞，從而增強(qiáng)發(fā)光信號(hào)。此外，金屬納米酶也被應(yīng)用于魯米諾電化學(xué)發(fā)光體系，金屬納米酶具有較高的催化效率和穩(wěn)定性，能有效催化魯米諾與溶液中特定物質(zhì)的反應(yīng)，生成激發(fā)態(tài)中間產(chǎn)物，進(jìn)而增強(qiáng)發(fā)光信號(hào)。這些納米材料的應(yīng)用，極大地拓展了魯米諾電化學(xué)發(fā)光在分析檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用潛力。關(guān)于GSK-3β的研究，其生物學(xué)特性和功能已被廣泛揭示。GSK-3β是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞內(nèi)的多種信號(hào)通路中扮演關(guān)鍵角色。在Wnt信號(hào)通路中，正常情況下，GSK-3β會(huì)磷酸化β-連環(huán)蛋白，使其被泛素化降解，從而抑制Wnt信號(hào)通路的激活；而當(dāng)Wnt信號(hào)通路被激活時(shí)，GSK-3β的活性會(huì)受到抑制，β-連環(huán)蛋白得以穩(wěn)定積累并進(jìn)入細(xì)胞核，與相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)控基因的表達(dá)，影響細(xì)胞的增殖、分化等過程。在胰島素信號(hào)通路中，胰島素與其受體結(jié)合后，會(huì)激活下游的磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K），PI3K通過一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，使蛋白激酶B（Akt）磷酸化激活，激活的Akt可以磷酸化GSK-3β的Ser9位點(diǎn)，使其活性受到抑制，從而促進(jìn)糖原合成，維持血糖的正常代謝。當(dāng)GSK-3β活性失調(diào)時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致胰島素抵抗，引發(fā)糖尿病等疾病。在疾病關(guān)聯(lián)研究中，大量臨床和基礎(chǔ)研究表明，GSK-3β與神經(jīng)退行性疾病、糖尿病、腫瘤等多種疾病密切相關(guān)。在阿爾茨海默病中，GSK-3β的過度激活會(huì)導(dǎo)致tau蛋白的異常磷酸化，形成神經(jīng)纖維纏結(jié)，同時(shí)還會(huì)促進(jìn)β-淀粉樣蛋白的生成和沉積，破壞神經(jīng)細(xì)胞的正常功能，導(dǎo)致認(rèn)知障礙和記憶力減退。在糖尿病中，GSK-3β的異常激活會(huì)干擾胰島素信號(hào)傳導(dǎo)，抑制糖原合成酶的活性，減少糖原合成，導(dǎo)致血糖升高。在腫瘤方面，GSK-3β參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等過程。在乳腺癌細(xì)胞中，GSK-3β的活性異常升高，會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移；而在結(jié)直腸癌細(xì)胞中，GSK-3β通過調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路，影響腫瘤細(xì)胞的凋亡和化療耐藥性。針對(duì)GSK-3β的檢測(cè)方法研究也在不斷發(fā)展。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法包括免疫印跡法（WesternBlot）、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）等。免疫印跡法是通過將細(xì)胞或組織中的蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到固相膜上，用特異性抗體檢測(cè)GSK-3β的表達(dá)水平，該方法能夠直觀地顯示GSK-3β蛋白的表達(dá)量，但操作較為繁瑣，需要較多的樣本量，且檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)。ELISA則是利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，通過酶標(biāo)記物來檢測(cè)GSK-3β的含量，具有較高的靈敏度和特異性，但也存在檢測(cè)成本較高、需要專業(yè)設(shè)備等問題。隨著生物傳感器技術(shù)的不斷進(jìn)步，基于不同原理的GSK-3β生物傳感器相繼被開發(fā)。其中，電化學(xué)傳感器利用GSK-3β與電極表面修飾的特異性識(shí)別元件之間的相互作用，引起電極表面電化學(xué)性質(zhì)的變化，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)GSK-3β的檢測(cè)。如將抗體修飾在電極表面，利用抗體與GSK-3β的特異性結(jié)合，通過檢測(cè)電流、電位或阻抗等電化學(xué)信號(hào)的變化來測(cè)定GSK-3β的濃度。這種傳感器具有檢測(cè)速度快、靈敏度較高、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，但在選擇性和穩(wěn)定性方面仍有待提高。光學(xué)傳感器則是基于GSK-3β與特定熒光標(biāo)記物或納米材料之間的相互作用，導(dǎo)致熒光信號(hào)或光散射信號(hào)的變化來進(jìn)行檢測(cè)。如利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）原理，將熒光供體和受體分別標(biāo)記在與GSK-3β相互作用的分子上，當(dāng)GSK-3β存在時(shí)，供體和受體之間的距離發(fā)生變化，從而引起熒光信號(hào)的改變，實(shí)現(xiàn)對(duì)GSK-3β的檢測(cè)。這類傳感器具有高靈敏度和選擇性，但對(duì)檢測(cè)環(huán)境和儀器設(shè)備要求較高。然而，當(dāng)前基于魯米諾電化學(xué)發(fā)光的GSK-3β生物傳感器研究仍存在一些不足之處。在傳感器的穩(wěn)定性方面，由于魯米諾在電極表面的固定方式和納米材料與魯米諾之間的相互作用不夠穩(wěn)定，導(dǎo)致傳感器在多次使用或長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存后，其發(fā)光信號(hào)和檢測(cè)性能會(huì)出現(xiàn)明顯下降。在選擇性方面，盡管采用了各種特異性識(shí)別元件，但在復(fù)雜生物樣品中，仍可能存在其他物質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生干擾，影響傳感器對(duì)GSK-3β檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性。在檢測(cè)靈敏度上，雖然已有一些研究取得了較好的成果，但對(duì)于低濃度GSK-3β的檢測(cè)，仍難以滿足早期疾病診斷等實(shí)際應(yīng)用的需求。此外，現(xiàn)有的傳感器大多需要在堿性條件下工作，這限制了其在一些生物樣品檢測(cè)中的應(yīng)用，因?yàn)閴A性環(huán)境可能會(huì)對(duì)生物分子的活性和結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。1.3研究?jī)?nèi)容與方法1.3.1研究?jī)?nèi)容本研究聚焦于基于魯米諾電化學(xué)發(fā)光的GSK-3β生物傳感器，涵蓋傳感器構(gòu)建、性能探究以及實(shí)際應(yīng)用探索等多方面內(nèi)容，旨在開發(fā)出一種高靈敏度、高選擇性且穩(wěn)定可靠的GSK-3β檢測(cè)方法?；隰斆字Z電化學(xué)發(fā)光的GSK-3β生物傳感器的構(gòu)建：選用合適的電極材料，如玻碳電極、金電極或氧化銦錫（ITO）電極等，通過物理吸附、共價(jià)鍵合或電化學(xué)沉積等方法，將魯米諾固定在電極表面，構(gòu)建魯米諾修飾電極。利用納米材料獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，如納米二氧化鈦、金屬納米酶等，對(duì)魯米諾修飾電極進(jìn)行進(jìn)一步修飾，以增強(qiáng)魯米諾的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)。通過實(shí)驗(yàn)優(yōu)化納米材料的種類、粒徑、修飾量以及修飾方式等參數(shù)，確定最佳的修飾條件。篩選并制備對(duì)GSK-3β具有特異性識(shí)別能力的生物分子，如抗體、核酸適配體或底物肽等，將其固定在納米材料修飾的魯米諾電極表面，構(gòu)建基于魯米諾電化學(xué)發(fā)光的GSK-3β生物傳感器。探索生物分子的固定方法和固定條件，以確保生物分子的活性和穩(wěn)定性，提高傳感器對(duì)GSK-3β的檢測(cè)性能。生物傳感器的性能研究：運(yùn)用循環(huán)伏安法（CV）、差分脈沖伏安法（DPV）和電化學(xué)阻抗譜（EIS）等電化學(xué)技術(shù)，對(duì)生物傳感器的電化學(xué)性能進(jìn)行表征，分析電極修飾過程中電極表面的電子轉(zhuǎn)移特性和界面性質(zhì)的變化，探究生物傳感器的電化學(xué)發(fā)光機(jī)理。在不同條件下，對(duì)生物傳感器檢測(cè)GSK-3β的性能進(jìn)行測(cè)試，包括靈敏度、選擇性、線性范圍、檢測(cè)限和穩(wěn)定性等指標(biāo)?？疾烊芤簆H值、溫度、反應(yīng)時(shí)間、離子強(qiáng)度等因素對(duì)傳感器性能的影響，優(yōu)化檢測(cè)條件，提高傳感器的檢測(cè)性能。將生物傳感器與其他檢測(cè)GSK-3β的方法，如免疫印跡法、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法等進(jìn)行對(duì)比分析，評(píng)估本研究構(gòu)建的生物傳感器在檢測(cè)GSK-3β方面的優(yōu)勢(shì)和不足。生物傳感器在實(shí)際樣品中的應(yīng)用探索：采集血清、細(xì)胞裂解液等實(shí)際生物樣品，對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理，去除雜質(zhì)和干擾物質(zhì)，以滿足生物傳感器的檢測(cè)要求。利用構(gòu)建的生物傳感器對(duì)實(shí)際生物樣品中的GSK-3β進(jìn)行檢測(cè)，并與傳統(tǒng)檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，驗(yàn)證生物傳感器在實(shí)際樣品檢測(cè)中的準(zhǔn)確性和可靠性。對(duì)生物傳感器在實(shí)際樣品檢測(cè)過程中可能遇到的問題，如樣品基質(zhì)效應(yīng)、生物分子的非特異性吸附等進(jìn)行分析和解決，進(jìn)一步優(yōu)化生物傳感器的性能，提高其在實(shí)際應(yīng)用中的可行性。1.3.2研究方法本研究綜合運(yùn)用多種實(shí)驗(yàn)和分析方法，從材料制備、傳感器構(gòu)建到性能測(cè)試和實(shí)際應(yīng)用，全面深入地開展基于魯米諾電化學(xué)發(fā)光的GSK-3β生物傳感器的研究。實(shí)驗(yàn)方法：通過化學(xué)合成、物理制備等方法，合成和制備納米材料（如納米二氧化鈦、金屬納米酶等）、魯米諾以及對(duì)GSK-3β具有特異性識(shí)別能力的生物分子（如抗體、核酸適配體等）。利用掃描電子顯微鏡（SEM）、透射電子顯微鏡（TEM）、X射線衍射儀（XRD）、傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR）等材料表征手段，對(duì)合成和制備的材料的形貌、結(jié)構(gòu)、組成等進(jìn)行表征和分析，為材料的性能研究和應(yīng)用提供基礎(chǔ)。采用滴涂法、電沉積法、自組裝法等方法，將魯米諾、納米材料和生物分子修飾到電極表面，構(gòu)建基于魯米諾電化學(xué)發(fā)光的GSK-3β生物傳感器。運(yùn)用循環(huán)伏安法（CV）、差分脈沖伏安法（DPV）、計(jì)時(shí)電流法（CA）和電化學(xué)阻抗譜（EIS）等電化學(xué)分析技術(shù)，對(duì)生物傳感器的電化學(xué)性能進(jìn)行測(cè)試和表征，研究電極修飾過程中電極表面的電子轉(zhuǎn)移特性和界面性質(zhì)的變化，探究生物傳感器的電化學(xué)發(fā)光機(jī)理。在不同條件下，利用電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀對(duì)生物傳感器檢測(cè)GSK-3β的性能進(jìn)行測(cè)試，包括靈敏度、選擇性、線性范圍、檢測(cè)限和穩(wěn)定性等指標(biāo)。通過改變?nèi)芤簆H值、溫度、反應(yīng)時(shí)間、離子強(qiáng)度等因素，考察其對(duì)傳感器性能的影響，優(yōu)化檢測(cè)條件。數(shù)據(jù)分析方法：運(yùn)用Origin、Excel等數(shù)據(jù)處理軟件，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、統(tǒng)計(jì)和分析，繪制圖表，直觀展示實(shí)驗(yàn)結(jié)果。采用線性回歸分析、方差分析等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，評(píng)估實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和顯著性差異，確定最佳的實(shí)驗(yàn)條件和參數(shù)。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1魯米諾電化學(xué)發(fā)光原理2.1.1魯米諾的基本性質(zhì)魯米諾，化學(xué)名稱為3-氨基-苯二甲酰肼，分子式為C_{8}H_{7}N_{3}O_{2}，常溫下呈現(xiàn)為蒼黃色粉末狀，是一種相對(duì)穩(wěn)定的人工合成有機(jī)化合物。從分子結(jié)構(gòu)來看，魯米諾分子由苯環(huán)、氨基以及酰肼基團(tuán)構(gòu)成。苯環(huán)賦予了分子一定的穩(wěn)定性和共軛結(jié)構(gòu)，為電子的離域提供了基礎(chǔ)，使得分子在特定條件下能夠發(fā)生電子轉(zhuǎn)移等反應(yīng)；氨基（-NH_{2}）具有一定的親核性，能夠參與多種化學(xué)反應(yīng)，在魯米諾的氧化發(fā)光過程中，氨基的存在對(duì)反應(yīng)的進(jìn)行和發(fā)光特性有著重要影響；酰肼基團(tuán)（-CONHNH_{2}）則是魯米諾發(fā)光的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)部分，其在氧化反應(yīng)中能夠發(fā)生一系列變化，最終導(dǎo)致發(fā)光現(xiàn)象的產(chǎn)生。魯米諾是一種較強(qiáng)的弱酸，其在溶液中的存在形式會(huì)受到溶液酸堿度的顯著影響。在不同pH值的溶液中，魯米諾分子會(huì)發(fā)生質(zhì)子化或去質(zhì)子化反應(yīng)，從而改變其化學(xué)活性和物理性質(zhì)。在酸性溶液中，魯米諾分子容易接受質(zhì)子，形成質(zhì)子化的魯米諾，此時(shí)分子的電荷分布和電子云密度發(fā)生改變，其化學(xué)活性相對(duì)較低；而在堿性溶液中，魯米諾分子會(huì)失去質(zhì)子，形成帶負(fù)電荷的離子形式，這種離子形式具有較高的化學(xué)活性，更易于與氧化劑等發(fā)生反應(yīng)，這也是魯米諾在堿性條件下能夠產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光的重要原因之一。魯米諾最為突出的特性之一便是其化學(xué)發(fā)光特性。在特定的條件下，當(dāng)魯米諾與合適的氧化劑（如過氧化氫H_{2}O_{2}、次氯酸鈉NaClO、高錳酸鉀KMnO_{4}等）發(fā)生化學(xué)反應(yīng)時(shí)，會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象。以過氧化氫為例，在堿性介質(zhì)中，魯米諾首先會(huì)被堿性環(huán)境中的氫氧根離子（OH^{-}）去質(zhì)子化，形成魯米諾陰離子。魯米諾陰離子具有較強(qiáng)的還原性，能夠與過氧化氫發(fā)生氧化還原反應(yīng)。在這個(gè)反應(yīng)過程中，魯米諾分子中的酰肼基團(tuán)被氧化，生成激發(fā)態(tài)的3-氨基鄰苯二甲酸根離子。激發(fā)態(tài)的3-氨基鄰苯二甲酸根離子處于高能不穩(wěn)定狀態(tài)，當(dāng)它從激發(fā)態(tài)躍遷回基態(tài)時(shí)，會(huì)以光子的形式釋放出多余的能量，從而產(chǎn)生肉眼可見的藍(lán)綠色熒光。這種發(fā)光現(xiàn)象具有較高的靈敏度和選擇性，能夠用于檢測(cè)痕量的氧化劑以及與之相關(guān)的物質(zhì)，在分析化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。魯米諾在分析化學(xué)中常被用于檢測(cè)過氧化氫的含量，通過測(cè)量魯米諾與過氧化氫反應(yīng)產(chǎn)生的發(fā)光強(qiáng)度，能夠準(zhǔn)確測(cè)定過氧化氫的濃度；在生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)中，利用魯米諾的發(fā)光特性可以檢測(cè)生物樣品中的過氧化物酶等生物分子，為疾病的診斷和研究提供重要的分析手段；在環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng)域，魯米諾可以用于檢測(cè)水中的溶解氧、氧化性污染物等，為評(píng)估環(huán)境質(zhì)量提供數(shù)據(jù)支持。2.1.2電化學(xué)發(fā)光的反應(yīng)機(jī)理魯米諾的電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)是一個(gè)較為復(fù)雜的過程，主要基于其在電極表面發(fā)生的氧化還原反應(yīng)。在堿性介質(zhì)中，當(dāng)向含有魯米諾的溶液中施加合適的電位時(shí)，魯米諾分子在電極表面首先經(jīng)歷第一步氧化反應(yīng)。魯米諾分子失去一個(gè)電子，被氧化為魯米諾自由基陰離子（Luminol\cdot^{-}），其反應(yīng)式可表示為：Luminol\stackrel{-e^{-}}{\longrightarrow}Luminol\cdot^{-}。在這個(gè)過程中，電極提供了電子轉(zhuǎn)移的場(chǎng)所，使得魯米諾分子能夠失去電子發(fā)生氧化。隨后，魯米諾自由基陰離子進(jìn)一步被氧化，這是反應(yīng)的關(guān)鍵步驟。在堿性環(huán)境中，魯米諾自由基陰離子與溶液中的氧化劑（如O_{2}、H_{2}O_{2}等）發(fā)生反應(yīng)，生成激發(fā)態(tài)的3-氨基鄰苯二甲酸根離子（3-amino-phthalate^{*}）。以與過氧化氫反應(yīng)為例，反應(yīng)式為：Luminol\cdot^{-}+H_{2}O_{2}\longrightarrow3-amino-phthalate^{*}+N_{2}+H_{2}O。在這個(gè)反應(yīng)中，魯米諾自由基陰離子被過氧化氫氧化，分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，形成激發(fā)態(tài)的3-氨基鄰苯二甲酸根離子，同時(shí)釋放出氮?dú)狻＜ぐl(fā)態(tài)的3-氨基鄰苯二甲酸根離子處于高能不穩(wěn)定狀態(tài)，它具有較高的能量，會(huì)迅速?gòu)募ぐl(fā)態(tài)回到基態(tài)。在這個(gè)躍遷過程中，多余的能量以光子的形式釋放出來，產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象，即：3-amino-phthalate^{*}\longrightarrow3-amino-phthalate+h\nu，其中h\nu表示光子。研究表明，魯米諾的電化學(xué)發(fā)光可能還涉及自由基過程。在氧化還原過程中，除了生成激發(fā)態(tài)的3-氨基鄰苯二甲酸根離子外，還可能形成其他自由基中間體，這些自由基中間體在相應(yīng)條件下，可在未氧化開環(huán)時(shí)輻射光信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)可逆的電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。在某些特殊的電極修飾或反應(yīng)條件下，魯米諾自由基陰離子可能會(huì)發(fā)生一些特殊的反應(yīng)路徑，形成具有發(fā)光能力的自由基中間體，這些中間體在合適的條件下能夠直接輻射光信號(hào)，為研制電化學(xué)發(fā)光傳感器和檢測(cè)器提供了更豐富的理論基礎(chǔ)和研究方向。2.1.3影響魯米諾電化學(xué)發(fā)光的因素溶液pH值：溶液的pH值對(duì)魯米諾電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度有著至關(guān)重要的影響。魯米諾是一種弱酸，在不同pH值的溶液中，其存在形式和化學(xué)活性會(huì)發(fā)生顯著變化。在酸性溶液中，魯米諾主要以質(zhì)子化形式存在，此時(shí)其化學(xué)活性較低，難以與氧化劑發(fā)生有效的反應(yīng)，導(dǎo)致電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度很弱。隨著溶液pH值升高，進(jìn)入堿性范圍，魯米諾逐漸去質(zhì)子化，形成魯米諾陰離子。魯米諾陰離子具有較高的化學(xué)活性，能夠與氧化劑（如過氧化氫、溶解氧等）快速發(fā)生氧化還原反應(yīng)，從而產(chǎn)生較強(qiáng)的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)。研究表明，當(dāng)溶液pH值在9-11之間時(shí)，魯米諾的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度通常達(dá)到較高水平。在pH值為10的堿性溶液中，魯米諾與過氧化氫反應(yīng)產(chǎn)生的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度明顯高于酸性或中性條件下的發(fā)光強(qiáng)度。然而，當(dāng)溶液pH值過高時(shí)，可能會(huì)對(duì)電極表面產(chǎn)生腐蝕作用，影響電極的穩(wěn)定性和電子轉(zhuǎn)移效率，進(jìn)而間接影響魯米諾的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度和穩(wěn)定性。共反應(yīng)劑：共反應(yīng)劑在魯米諾電化學(xué)發(fā)光體系中起著關(guān)鍵作用。過氧化氫是最常用的共反應(yīng)劑之一，它能夠與魯米諾在電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)，促進(jìn)激發(fā)態(tài)產(chǎn)物的生成，從而增強(qiáng)發(fā)光信號(hào)。在一定范圍內(nèi)，過氧化氫濃度的增加會(huì)導(dǎo)致魯米諾電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度增強(qiáng)。當(dāng)過氧化氫濃度從1\times10^{-4}mol/L增加到5\times10^{-4}mol/L時(shí)，魯米諾的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度逐漸升高。但如果過氧化氫濃度過高，可能會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)過于劇烈，產(chǎn)生的自由基等中間產(chǎn)物過多，這些中間產(chǎn)物之間可能會(huì)發(fā)生相互作用，從而猝滅發(fā)光信號(hào)，使發(fā)光強(qiáng)度反而下降。除過氧化氫外，其他一些物質(zhì)如溶解氧、過硫酸鹽等也可作為魯米諾的共反應(yīng)劑。溶解氧在堿性條件下能夠與魯米諾發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光；過硫酸鹽在適當(dāng)?shù)臈l件下也能與魯米諾協(xié)同作用，增強(qiáng)發(fā)光信號(hào)，不同共反應(yīng)劑的作用機(jī)制和效果可能存在差異，選擇合適的共反應(yīng)劑及其濃度對(duì)于優(yōu)化魯米諾電化學(xué)發(fā)光體系至關(guān)重要。電極材料：電極材料的性質(zhì)對(duì)魯米諾電化學(xué)發(fā)光有顯著影響。不同的電極材料具有不同的電子轉(zhuǎn)移特性、表面活性和催化性能，這些因素會(huì)直接影響魯米諾在電極表面的氧化還原反應(yīng)過程，進(jìn)而影響電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度和穩(wěn)定性。玻碳電極具有良好的導(dǎo)電性、化學(xué)穩(wěn)定性和低背景電流等優(yōu)點(diǎn)，是研究魯米諾電化學(xué)發(fā)光常用的電極材料之一。在玻碳電極表面，魯米諾能夠較好地發(fā)生氧化反應(yīng)，產(chǎn)生較為穩(wěn)定的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)。金電極具有獨(dú)特的表面性質(zhì)和催化活性，對(duì)某些氧化還原反應(yīng)具有良好的催化作用。當(dāng)使用金電極作為工作電極時(shí)，其表面的金原子可以與魯米諾分子發(fā)生相互作用，促進(jìn)電子轉(zhuǎn)移，從而增強(qiáng)魯米諾的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。此外，一些修飾電極，如納米材料修飾電極，由于納米材料具有大的比表面積、高的催化活性和良好的電子傳導(dǎo)性能，能夠顯著提高魯米諾在電極表面的反應(yīng)活性和電子轉(zhuǎn)移效率，極大地增強(qiáng)魯米諾的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)。納米二氧化鈦修飾的玻碳電極對(duì)魯米諾電化學(xué)發(fā)光的增敏效果明顯，可使發(fā)光強(qiáng)度達(dá)到裸玻碳電極的數(shù)倍。不同的電極材料和修飾方式為優(yōu)化魯米諾電化學(xué)發(fā)光生物傳感器的性能提供了多種途徑和選擇。2.2GSK-3β的生物學(xué)特性2.2.1GSK-3β的結(jié)構(gòu)與功能GSK-3β是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在生物體內(nèi)具有高度保守的結(jié)構(gòu)。其基因位于人類染色體3q13.3，全長(zhǎng)約為40kb，包含13個(gè)外顯子。GSK-3β的編碼產(chǎn)物由420個(gè)氨基酸殘基組成，相對(duì)分子質(zhì)量約為47kDa。從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)來看，GSK-3β包含一個(gè)N端結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C端結(jié)構(gòu)域。N端結(jié)構(gòu)域主要參與底物的識(shí)別和結(jié)合，它具有特定的氨基酸序列和空間構(gòu)象，能夠與底物分子上的特定基序相互作用，從而確保GSK-3β對(duì)底物的特異性識(shí)別。在與糖原合成酶的相互作用中，GSK-3β的N端結(jié)構(gòu)域能夠精準(zhǔn)地識(shí)別糖原合成酶上的特定氨基酸序列，進(jìn)而對(duì)其進(jìn)行磷酸化修飾。C端結(jié)構(gòu)域則主要負(fù)責(zé)激酶的催化活性，其中包含一個(gè)保守的激酶結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域含有多個(gè)關(guān)鍵的氨基酸殘基，如參與ATP結(jié)合和磷酸轉(zhuǎn)移的氨基酸殘基。這些氨基酸殘基在空間上形成特定的結(jié)構(gòu)，為ATP的結(jié)合和底物的磷酸化提供了適宜的微環(huán)境。在催化過程中，ATP結(jié)合到C端結(jié)構(gòu)域的特定位置，底物分子與N端結(jié)構(gòu)域結(jié)合后，C端結(jié)構(gòu)域通過一系列的化學(xué)反應(yīng)，將ATP上的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到底物分子上，實(shí)現(xiàn)對(duì)底物的磷酸化修飾。GSK-3β在細(xì)胞內(nèi)參與了眾多重要的信號(hào)通路，發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控功能。在Wnt信號(hào)通路中，它起著核心的負(fù)調(diào)控作用。正常情況下，GSK-3β與APC（腺瘤性結(jié)腸息肉病蛋白）、Axin等形成復(fù)合物，該復(fù)合物能夠使β-連環(huán)蛋白（β-catenin）磷酸化。磷酸化后的β-catenin會(huì)被泛素連接酶識(shí)別，進(jìn)而被泛素化修飾，最終通過蛋白酶體途徑被降解。在經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路未被激活時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的β-catenin處于低水平狀態(tài)，這是由于GSK-3β持續(xù)發(fā)揮其磷酸化作用，維持了β-catenin的降解平衡。當(dāng)Wnt信號(hào)通路被激活時(shí)，Wnt蛋白與細(xì)胞膜上的受體Frizzled和共受體LRP5/6結(jié)合，激活下游的Dishevelled蛋白。Dishevelled蛋白會(huì)抑制GSK-3β的活性，使其無法對(duì)β-catenin進(jìn)行磷酸化。β-catenin得以穩(wěn)定積累，并進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，激活相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和遷移等過程。在腫瘤細(xì)胞中，Wnt信號(hào)通路的異常激活常常導(dǎo)致GSK-3β活性受到抑制，β-catenin大量積累并進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn)腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。在胰島素信號(hào)通路中，GSK-3β同樣扮演著重要角色。胰島素與其受體結(jié)合后，會(huì)引發(fā)受體自身的磷酸化，進(jìn)而激活下游的磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）。PI3K催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3能夠招募蛋白激酶B（Akt）到細(xì)胞膜上，并使其被磷酸化激活。激活的Akt可以磷酸化GSK-3β的Ser9位點(diǎn)，使GSK-3β處于失活狀態(tài)。失活的GSK-3β無法對(duì)糖原合成酶進(jìn)行磷酸化抑制，從而促進(jìn)糖原合成，降低血糖水平。當(dāng)GSK-3β的活性失調(diào)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致胰島素信號(hào)傳導(dǎo)受阻，糖原合成減少，血糖升高，引發(fā)糖尿病等代謝性疾病。在2型糖尿病患者中，常常出現(xiàn)GSK-3β活性異常升高的情況，這使得胰島素對(duì)糖原合成的促進(jìn)作用減弱，血糖無法有效降低，進(jìn)一步加重了糖尿病的病情。2.2.2GSK-3β與疾病的關(guān)系大量研究表明，GSK-3β的異常表達(dá)或活性失調(diào)與多種嚴(yán)重疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在神經(jīng)退行性疾病領(lǐng)域，阿爾茨海默?。ˋD）是一種常見且危害嚴(yán)重的疾病，GSK-3β在其發(fā)病機(jī)制中扮演著關(guān)鍵角色。AD的典型病理特征包括由β-淀粉樣蛋白（Aβ）沉積形成的老年斑和由tau蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)（NFTs）。GSK-3β的激活可直接促進(jìn)tau蛋白的過度磷酸化。在正常生理狀態(tài)下，tau蛋白能夠與微管蛋白結(jié)合，維持微管的穩(wěn)定性，從而保證神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的正常運(yùn)輸和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。當(dāng)GSK-3β過度激活時(shí)，它會(huì)磷酸化tau蛋白的多個(gè)位點(diǎn)，使tau蛋白與微管的結(jié)合能力下降，導(dǎo)致微管解聚，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)運(yùn)輸受阻，進(jìn)而影響神經(jīng)細(xì)胞的正常功能。在AD患者的大腦中，檢測(cè)到GSK-3β的活性顯著升高，tau蛋白的磷酸化水平也明顯增加，神經(jīng)纖維纏結(jié)大量形成，這與患者認(rèn)知功能障礙和記憶力減退的癥狀密切相關(guān)。GSK-3β還通過多種途徑促進(jìn)Aβ的產(chǎn)生和沉積。它可以調(diào)節(jié)淀粉樣前體蛋白（APP）的代謝過程，使APP更多地被切割成Aβ。GSK-3β能夠激活β-分泌酶（BACE1）的表達(dá)和活性，BACE1是APP生成Aβ的關(guān)鍵酶之一。在AD小鼠模型中，抑制GSK-3β的活性可以降低BACE1的表達(dá)和活性，減少Aβ的生成，從而減輕AD的病理癥狀。GSK-3β還可以影響Aβ的聚集和沉積過程，促進(jìn)老年斑的形成。研究發(fā)現(xiàn)，GSK-3β能夠與Aβ相互作用，加速Aβ的聚集，使其更容易形成具有神經(jīng)毒性的寡聚體和纖維狀結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步損傷神經(jīng)細(xì)胞。在糖尿病方面，GSK-3β主要通過干擾胰島素信號(hào)通路來影響血糖代謝。如前所述，在正常的胰島素信號(hào)傳導(dǎo)過程中，Akt磷酸化GSK-3β使其失活，從而促進(jìn)糖原合成。當(dāng)GSK-3β活性異常升高時(shí)，即使在胰島素存在的情況下，它也能持續(xù)磷酸化糖原合成酶，抑制其活性，導(dǎo)致糖原合成減少。在胰島素抵抗的細(xì)胞模型中，GSK-3β的活性明顯增強(qiáng)，糖原合成酶的磷酸化水平升高，糖原合成量顯著降低，血糖水平難以有效降低。GSK-3β還可以影響其他與血糖代謝相關(guān)的關(guān)鍵分子和信號(hào)通路，進(jìn)一步加劇血糖代謝紊亂。它可以抑制葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（GLUT4）的轉(zhuǎn)位，減少葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞，從而降低細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和利用。在肥胖和2型糖尿病患者中，常常觀察到GSK-3β活性升高，胰島素信號(hào)通路受阻，血糖代謝異常，這表明GSK-3β在糖尿病的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。在腫瘤領(lǐng)域，GSK-3β參與了腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等多個(gè)關(guān)鍵過程，其活性和表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度和預(yù)后密切相關(guān)。在乳腺癌細(xì)胞中，研究發(fā)現(xiàn)GSK-3β的活性異常升高，它可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。GSK-3β能夠磷酸化細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1），使其穩(wěn)定性增加，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞增殖。GSK-3β還可以抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡。它通過磷酸化和抑制促凋亡蛋白Bad，使其無法發(fā)揮促凋亡作用，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的存活能力。在結(jié)直腸癌細(xì)胞中，GSK-3β通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路，影響腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。當(dāng)GSK-3β活性受到抑制時(shí)，β-catenin得以穩(wěn)定積累并進(jìn)入細(xì)胞核，激活與腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)基因的表達(dá)，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。此外，GSK-3β還與腫瘤的化療耐藥性相關(guān)。在一些腫瘤細(xì)胞中，GSK-3β的高活性可以使腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性，降低化療的療效，這可能與GSK-3β調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的凋亡、DNA損傷修復(fù)等過程有關(guān)。2.3生物傳感器的基本原理與分類生物傳感器作為一種能夠?qū)ι镂镔|(zhì)進(jìn)行高靈敏度檢測(cè)的分析儀器，其基本組成主要包括分子識(shí)別元件和信號(hào)轉(zhuǎn)換元件兩大部分。分子識(shí)別元件是生物傳感器的核心部分，它由固定化的生物敏感材料構(gòu)成，如酶、蛋白質(zhì)、DNA、抗體、抗原、微生物、細(xì)胞、組織、核酸等生物活性物質(zhì)。這些生物活性物質(zhì)具有高度的特異性，能夠與特定的目標(biāo)生物分子發(fā)生特異性相互作用，如抗體與抗原的特異性結(jié)合、酶與底物的特異性催化反應(yīng)等?？贵w能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合相應(yīng)的抗原，通過抗原抗體之間的特異性免疫反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)抗原的識(shí)別和捕獲；酶能夠特異性地催化特定的底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，通過酶與底物之間的特異性催化作用，識(shí)別并作用于目標(biāo)底物分子。這種特異性相互作用使得生物傳感器能夠準(zhǔn)確地識(shí)別和檢測(cè)目標(biāo)生物分子，為后續(xù)的信號(hào)轉(zhuǎn)換和檢測(cè)提供了基礎(chǔ)。信號(hào)轉(zhuǎn)換元件則是將分子識(shí)別元件與目標(biāo)生物分子相互作用產(chǎn)生的生物化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)換為可檢測(cè)的物理信號(hào)的裝置。常見的信號(hào)轉(zhuǎn)換元件包括電化學(xué)電極、半導(dǎo)體、光電轉(zhuǎn)換器、熱敏電阻、壓電晶體等。當(dāng)分子識(shí)別元件與目標(biāo)生物分子發(fā)生特異性相互作用時(shí)，會(huì)引起局部的物理或化學(xué)性質(zhì)的變化，如電位變化、電流變化、光強(qiáng)度變化、溫度變化、質(zhì)量變化等。信號(hào)轉(zhuǎn)換元件能夠?qū)⑦@些變化轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的電信號(hào)、光信號(hào)、熱信號(hào)或其他可檢測(cè)的物理信號(hào)，然后通過信號(hào)放大器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)這些信號(hào)進(jìn)行放大、處理和分析，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)生物分子的定性或定量檢測(cè)。在基于電化學(xué)原理的生物傳感器中，當(dāng)酶與底物發(fā)生催化反應(yīng)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致電極表面的電荷分布發(fā)生變化，產(chǎn)生電位或電流的變化，電化學(xué)電極作為信號(hào)轉(zhuǎn)換元件，能夠?qū)⑦@種電化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)輸出，通過檢測(cè)電信號(hào)的變化，就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)底物濃度的檢測(cè)。生物傳感器的工作原理基于生物識(shí)別元件與目標(biāo)生物分子之間的特異性相互作用以及信號(hào)轉(zhuǎn)換元件對(duì)這種相互作用產(chǎn)生的信號(hào)的轉(zhuǎn)換和檢測(cè)。當(dāng)含有目標(biāo)生物分子的樣品與生物傳感器接觸時(shí)，目標(biāo)生物分子會(huì)與分子識(shí)別元件發(fā)生特異性結(jié)合或反應(yīng)。在免疫傳感器中，抗原會(huì)與固定在傳感器表面的抗體發(fā)生特異性結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物；在酶?jìng)鞲衅髦?，底物?huì)與固定化的酶發(fā)生特異性催化反應(yīng)，生成產(chǎn)物。這種特異性相互作用會(huì)引起分子識(shí)別元件的物理或化學(xué)性質(zhì)發(fā)生變化，進(jìn)而導(dǎo)致信號(hào)轉(zhuǎn)換元件產(chǎn)生相應(yīng)的物理信號(hào)變化。如果信號(hào)轉(zhuǎn)換元件是光電轉(zhuǎn)換器，當(dāng)抗原-抗體結(jié)合或酶催化反應(yīng)發(fā)生時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致光吸收、熒光發(fā)射或光散射等光學(xué)性質(zhì)的變化，光電轉(zhuǎn)換器能夠?qū)⑦@些光學(xué)信號(hào)的變化轉(zhuǎn)換為電信號(hào)輸出；如果信號(hào)轉(zhuǎn)換元件是壓電晶體，當(dāng)生物分子與分子識(shí)別元件相互作用時(shí)，會(huì)引起壓電晶體表面質(zhì)量的變化，從而導(dǎo)致壓電晶體的共振頻率發(fā)生改變，通過檢測(cè)共振頻率的變化，就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)生物分子的檢測(cè)。這些物理信號(hào)經(jīng)過放大、處理和分析后，就可以得到關(guān)于目標(biāo)生物分子的濃度、活性等信息，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)生物分子的檢測(cè)和分析。生物傳感器的類型豐富多樣，根據(jù)不同的分類標(biāo)準(zhǔn)可以進(jìn)行多種分類，其中按識(shí)別元件和信號(hào)轉(zhuǎn)換方式的分類較為常見。按識(shí)別元件分類，生物傳感器可分為酶?jìng)鞲衅?、微生物傳感器、?xì)胞傳感器、組織傳感器和免疫傳感器等。酶?jìng)鞲衅魇且悦缸鳛榉肿幼R(shí)別元件，利用酶對(duì)底物的特異性催化作用來檢測(cè)目標(biāo)物質(zhì)。葡萄糖氧化酶?jìng)鞲衅骶褪且环N典型的酶?jìng)鞲衅?，它利用葡萄糖氧化酶特異性催化葡萄糖氧化的反?yīng)，通過檢測(cè)反應(yīng)過程中產(chǎn)生的電流或電位變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)葡萄糖濃度的檢測(cè)。微生物傳感器則是以微生物個(gè)體作為識(shí)別元件，利用微生物對(duì)特定物質(zhì)的代謝或呼吸作用來檢測(cè)目標(biāo)物。一些微生物能夠利用特定的有機(jī)化合物作為碳源進(jìn)行生長(zhǎng)和代謝，通過檢測(cè)微生物在代謝過程中產(chǎn)生的二氧化碳、氫離子等物質(zhì)的變化，就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)該有機(jī)化合物的檢測(cè)。細(xì)胞傳感器是以細(xì)胞器或完整細(xì)胞作為識(shí)別元件，利用細(xì)胞對(duì)特定物質(zhì)的生理反應(yīng)來檢測(cè)目標(biāo)物。紅細(xì)胞傳感器可以利用紅細(xì)胞對(duì)某些毒素的敏感性，通過檢測(cè)紅細(xì)胞的形態(tài)、功能或代謝變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)毒素的檢測(cè)。組織傳感器是以動(dòng)植物組織作為識(shí)別元件，利用組織中的生物活性物質(zhì)對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的特異性反應(yīng)來檢測(cè)目標(biāo)物。豬肝組織傳感器可以利用豬肝組織中的某些酶對(duì)特定藥物的代謝作用，通過檢測(cè)藥物代謝產(chǎn)物的變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物的檢測(cè)。免疫傳感器是以抗原或抗體作為識(shí)別元件，利用抗原抗體之間的特異性免疫反應(yīng)來檢測(cè)目標(biāo)物。在乙肝病毒表面抗原檢測(cè)中，利用固定化的乙肝病毒表面抗體與樣品中的乙肝病毒表面抗原特異性結(jié)合，通過檢測(cè)結(jié)合后產(chǎn)生的信號(hào)變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)乙肝病毒表面抗原的檢測(cè)。按信號(hào)轉(zhuǎn)換方式分類，生物傳感器可分為生物電極傳感器、半導(dǎo)體生物傳感器、光生物傳感器、熱生物傳感器、壓電晶體生物傳感器等。生物電極傳感器是利用電化學(xué)電極作為信號(hào)轉(zhuǎn)換元件，將生物分子相互作用產(chǎn)生的化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)。電位型生物電極傳感器通過檢測(cè)電極表面與生物分子相互作用引起的電位變化來檢測(cè)目標(biāo)物；電流型生物電極傳感器則通過檢測(cè)生物分子反應(yīng)過程中產(chǎn)生的電流變化來檢測(cè)目標(biāo)物。半導(dǎo)體生物傳感器是利用半導(dǎo)體材料作為信號(hào)轉(zhuǎn)換元件，將生物分子相互作用產(chǎn)生的信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)。場(chǎng)效應(yīng)晶體管生物傳感器就是一種典型的半導(dǎo)體生物傳感器，它利用場(chǎng)效應(yīng)晶體管的電學(xué)特性對(duì)生物分子相互作用的敏感性，通過檢測(cè)場(chǎng)效應(yīng)晶體管的源漏電流或柵極電壓變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)生物分子的檢測(cè)。光生物傳感器是利用光電轉(zhuǎn)換器作為信號(hào)轉(zhuǎn)換元件，將生物分子相互作用產(chǎn)生的光學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)。熒光生物傳感器利用熒光標(biāo)記物與生物分子相互作用后熒光信號(hào)的變化來檢測(cè)目標(biāo)物；表面等離子體共振生物傳感器則利用生物分子與傳感器表面的相互作用引起的表面等離子體共振現(xiàn)象的變化，通過檢測(cè)反射光的強(qiáng)度或角度變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)生物分子的檢測(cè)。熱生物傳感器是利用熱敏電阻作為信號(hào)轉(zhuǎn)換元件，將生物分子相互作用產(chǎn)生的熱量變化轉(zhuǎn)換為電信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)。酶催化反應(yīng)通常會(huì)伴隨著熱量的產(chǎn)生或吸收，通過檢測(cè)反應(yīng)過程中的熱量變化，就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)底物濃度的檢測(cè)。壓電晶體生物傳感器是利用壓電晶體作為信號(hào)轉(zhuǎn)換元件，將生物分子相互作用產(chǎn)生的質(zhì)量變化轉(zhuǎn)換為電信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)。當(dāng)生物分子與固定在壓電晶體表面的識(shí)別元件結(jié)合時(shí)，會(huì)引起壓電晶體表面質(zhì)量的增加，從而導(dǎo)致壓電晶體的共振頻率降低，通過檢測(cè)共振頻率的變化，就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)生物分子的檢測(cè)。三、基于魯米諾電化學(xué)發(fā)光的GSK-3β生物傳感器的制備3.1實(shí)驗(yàn)材料與儀器實(shí)驗(yàn)材料主要包括化學(xué)試劑和生物分子?；瘜W(xué)試劑方面，魯米諾（3-氨基-苯二甲酰肼），純度≥98%，購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，作為核心的電化學(xué)發(fā)光試劑，其質(zhì)量和純度直接影響傳感器的發(fā)光性能和檢測(cè)靈敏度；納米二氧化鈦（TiO?），粒徑為20-50nm，銳鈦礦型，購(gòu)自AlfaAesar公司，利用其大比表面積和良好的催化活性，增強(qiáng)魯米諾的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)；過氧化氫（H?O?），分析純，濃度為30%，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，作為魯米諾電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的共反應(yīng)劑，與魯米諾協(xié)同作用產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象；N，N-二甲基甲酰胺（DMF），分析純，購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，用于溶解和分散各種試劑，保證實(shí)驗(yàn)反應(yīng)的均一性和穩(wěn)定性；戊二醛溶液，濃度為25%，購(gòu)自麥克林生化科技有限公司，在生物分子固定過程中，作為交聯(lián)劑，用于連接生物分子和電極表面，確保生物分子的穩(wěn)定固定；磷酸緩沖鹽溶液（PBS，pH=7.4），由氯化鈉（NaCl）、氯化鉀（KCl）、磷酸氫二鈉（Na?HPO?）和磷酸二氫鉀（KH?PO?）等配制而成，購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，作為實(shí)驗(yàn)的緩沖體系，維持溶液的pH值穩(wěn)定，為生物分子提供適宜的反應(yīng)環(huán)境，減少非特異性吸附和干擾。生物分子方面，GSK-3β抗體，鼠抗人單克隆抗體，購(gòu)自Abcam公司，作為特異性識(shí)別GSK-3β的生物分子，其特異性和親和力決定了傳感器對(duì)GSK-3β檢測(cè)的準(zhǔn)確性和選擇性；牛血清白蛋白（BSA），購(gòu)自Solarbio公司，用于封閉電極表面的非特異性位點(diǎn)，減少非特異性吸附，提高傳感器的特異性和檢測(cè)精度。實(shí)驗(yàn)儀器主要有電化學(xué)工作站，CHI660E型，上海辰華儀器有限公司產(chǎn)品，用于進(jìn)行循環(huán)伏安法（CV）、差分脈沖伏安法（DPV）和電化學(xué)阻抗譜（EIS）等電化學(xué)測(cè)試，精確測(cè)量電極表面的電流、電位等電化學(xué)參數(shù)，從而表征生物傳感器的電化學(xué)性能；電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀，MPI-E型，西安瑞邁電子科技有限公司產(chǎn)品，用于檢測(cè)魯米諾的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)，測(cè)量生物傳感器在檢測(cè)GSK-3β過程中產(chǎn)生的發(fā)光強(qiáng)度，為定量分析提供數(shù)據(jù)支持；掃描電子顯微鏡（SEM），SU8010型，日本日立公司產(chǎn)品，用于觀察電極表面修飾前后的微觀形貌，直觀展示納米材料和生物分子在電極表面的分布和固定情況，為傳感器的制備和優(yōu)化提供形態(tài)學(xué)依據(jù)；透射電子顯微鏡（TEM），JEM-2100F型，日本電子株式會(huì)社產(chǎn)品，進(jìn)一步對(duì)納米材料的微觀結(jié)構(gòu)和粒徑進(jìn)行分析，深入了解納米材料的特性，有助于優(yōu)化納米材料的制備和應(yīng)用條件；pH計(jì)，PHS-3C型，上海雷磁儀器廠產(chǎn)品，用于精確測(cè)量溶液的pH值，確保實(shí)驗(yàn)在合適的酸堿度條件下進(jìn)行，因?yàn)槿芤簆H值對(duì)魯米諾的電化學(xué)發(fā)光和生物分子的活性有重要影響；離心機(jī)，TDL-5-A型，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品，用于分離和純化樣品，在納米材料制備、生物分子提取和傳感器制備過程中，實(shí)現(xiàn)固液分離，去除雜質(zhì)，保證實(shí)驗(yàn)材料的純度；超聲波清洗器，KQ-500DE型，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品，用于清洗電極等實(shí)驗(yàn)器材，去除表面的雜質(zhì)和污染物，保證電極表面的清潔和平整，有利于后續(xù)的修飾和實(shí)驗(yàn)操作。3.2電極的預(yù)處理與修飾在基于魯米諾電化學(xué)發(fā)光的GSK-3β生物傳感器的制備過程中，電極的預(yù)處理與修飾是至關(guān)重要的步驟，直接影響著傳感器的性能和檢測(cè)效果。本研究選用玻碳電極作為基礎(chǔ)電極，因其具有良好的導(dǎo)電性、化學(xué)穩(wěn)定性以及低背景電流等優(yōu)點(diǎn)，能夠?yàn)楹罄m(xù)的修飾和電化學(xué)檢測(cè)提供穩(wěn)定的平臺(tái)。預(yù)處理階段，首要任務(wù)是對(duì)玻碳電極進(jìn)行深度清潔，以去除表面的雜質(zhì)和污染物，確保電極表面的純凈度和活性。具體操作如下：首先，將玻碳電極依次用粒徑為1.0μm、0.3μm和0.05μm的三氧化二鋁（Al_{2}O_{3}）拋光粉在麂皮上進(jìn)行機(jī)械拋光，在拋光過程中，需保持適當(dāng)?shù)膲毫娃D(zhuǎn)速，使電極表面均勻受力，以獲得光滑平整的表面。每次拋光時(shí)間約為3-5分鐘，直至電極表面呈現(xiàn)鏡面光澤，這表明電極表面的劃痕和雜質(zhì)已被有效去除。隨后，將拋光后的電極置于超聲波清洗器中，依次用無水乙醇和去離子水超聲清洗3-5分鐘，以去除電極表面殘留的拋光粉和其他雜質(zhì)。無水乙醇能夠溶解有機(jī)污染物，而去離子水則可沖洗掉殘留的無機(jī)鹽和其他水溶性雜質(zhì)。清洗完成后，用氮?dú)獯蹈呻姌O表面，以防止水分殘留對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生影響。為進(jìn)一步活化電極表面，提高其電子轉(zhuǎn)移能力和化學(xué)反應(yīng)活性，采用電化學(xué)方法對(duì)電極進(jìn)行處理。將清洗后的玻碳電極置于0.5mol/L的硫酸溶液中，利用循環(huán)伏安法（CV）進(jìn)行掃描，掃描電位范圍為-0.2V至1.5V，掃描速率為100mV/s，循環(huán)掃描5-10圈。在掃描過程中，電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)，去除表面的氧化層和吸附雜質(zhì)，同時(shí)增加電極表面的活性位點(diǎn)，提高電極的電子傳遞效率。經(jīng)過循環(huán)伏安掃描后，電極表面的電化學(xué)活性得到顯著提升，為后續(xù)的修飾和檢測(cè)提供了更好的條件。修飾過程是構(gòu)建基于魯米諾電化學(xué)發(fā)光的GSK-3β生物傳感器的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，通過在電極表面修飾納米材料和生物分子，能夠顯著提高傳感器的性能。首先，利用納米二氧化鈦（TiO_{2}）對(duì)電極進(jìn)行修飾，以增強(qiáng)魯米諾的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)。納米二氧化鈦具有較大的比表面積、良好的催化活性和優(yōu)異的電子傳導(dǎo)性能，能夠促進(jìn)魯米諾在電極表面的氧化反應(yīng)，加速電子轉(zhuǎn)移，從而增強(qiáng)發(fā)光信號(hào)。將納米二氧化鈦粉末分散在N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中，超聲處理30-60分鐘，使其均勻分散，形成穩(wěn)定的納米二氧化鈦懸浮液。然后，取5-10μL的納米二氧化鈦懸浮液滴涂在活化后的玻碳電極表面，在室溫下自然晾干，使納米二氧化鈦均勻地覆蓋在電極表面。為了增強(qiáng)納米二氧化鈦與電極表面的結(jié)合力，可將涂有納米二氧化鈦的電極在80-100℃的烘箱中烘烤10-15分鐘，使其牢固地附著在電極表面。接著，采用共價(jià)鍵合法將魯米諾固定在納米二氧化鈦修飾的電極表面。首先，將納米二氧化鈦修飾的電極浸泡在含有1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）的混合溶液中，室溫下活化1-2小時(shí)，使納米二氧化鈦表面的羥基與EDC和NHS反應(yīng)，形成活性酯中間體。然后，將電極取出，用去離子水沖洗干凈，去除未反應(yīng)的EDC和NHS，隨后將其浸泡在含有魯米諾的溶液中，在4℃下孵育12-24小時(shí)，使魯米諾分子通過活性酯中間體與納米二氧化鈦表面的羥基形成穩(wěn)定的酰胺鍵，從而實(shí)現(xiàn)魯米諾在電極表面的固定。在孵育過程中，需輕輕攪拌溶液，以促進(jìn)魯米諾分子與電極表面的充分接觸和反應(yīng)。孵育結(jié)束后，用去離子水沖洗電極，去除未結(jié)合的魯米諾分子，得到魯米諾修飾的納米二氧化鈦電極。為實(shí)現(xiàn)對(duì)GSK-3β的特異性檢測(cè)，需要將對(duì)GSK-3β具有特異性識(shí)別能力的抗體固定在魯米諾修飾的電極表面。利用戊二醛作為交聯(lián)劑，將抗體固定在電極表面。將魯米諾修飾的電極浸泡在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛溶液中，室溫下孵育30-60分鐘，使電極表面的氨基與戊二醛的醛基反應(yīng)，形成醛基化的電極表面。然后，將電極取出，用PBS緩沖溶液沖洗干凈，去除未反應(yīng)的戊二醛，隨后將其浸泡在含有GSK-3β抗體的PBS緩沖溶液中，在4℃下孵育12-24小時(shí)，使抗體分子通過醛基與電極表面的氨基形成穩(wěn)定的Schiff堿鍵，從而實(shí)現(xiàn)抗體在電極表面的固定。在孵育過程中，需將溶液置于搖床上輕輕振蕩，以確保抗體分子能夠均勻地分布在電極表面，并與電極表面充分結(jié)合。孵育結(jié)束后，用PBS緩沖溶液沖洗電極，去除未結(jié)合的抗體分子。為了封閉電極表面的非特異性位點(diǎn)，減少非特異性吸附，將電極浸泡在含有1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS緩沖溶液中，室溫下孵育30-60分鐘，然后用PBS緩沖溶液沖洗干凈，得到基于魯米諾電化學(xué)發(fā)光的GSK-3β生物傳感器。經(jīng)過上述預(yù)處理與修飾步驟，成功構(gòu)建了基于魯米諾電化學(xué)發(fā)光的GSK-3β生物傳感器，為后續(xù)的性能研究和實(shí)際應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。3.3生物傳感器的組裝過程生物傳感器的組裝是將修飾后的電極與魯米諾、GSK-3β抗體等關(guān)鍵組成部分整合，構(gòu)建出能夠特異性檢測(cè)GSK-3β的功能化裝置，其組裝過程的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性對(duì)傳感器的性能起著決定性作用。在完成電極的預(yù)處理與修飾后，首先進(jìn)行魯米諾在電極表面的固定。取適量經(jīng)過純化和溶解的魯米諾溶液，將其滴涂在已修飾納米二氧化鈦的玻碳電極表面。魯米諾溶液的濃度需精確控制在一定范圍內(nèi)，通常為1\times10^{-3}mol/L至5\times10^{-3}mol/L，以確保魯米諾能夠在電極表面形成均勻且穩(wěn)定的覆蓋層。滴涂時(shí)，使用微量移液器精確吸取5-10μL的魯米諾溶液，緩慢且均勻地滴在電極表面，避免產(chǎn)生氣泡和液滴分布不均的情況。滴涂完成后，將電極置于室溫下自然晾干，使魯米諾分子與納米二氧化鈦表面充分接觸并發(fā)生相互作用，形成穩(wěn)定的固定結(jié)構(gòu)。為了增強(qiáng)魯米諾與納米二氧化鈦之間的結(jié)合力，可將晾干后的電極在4℃下冷藏1-2小時(shí)，促進(jìn)分子間的相互作用和化學(xué)鍵的形成。接著，進(jìn)行GSK-3β抗體的固定。利用戊二醛作為交聯(lián)劑，將抗體固定在魯米諾修飾的電極表面。先配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛溶液，將魯米諾修飾的電極完全浸泡在戊二醛溶液中，室溫下孵育30-60分鐘。在孵育過程中，戊二醛分子中的醛基會(huì)與魯米諾修飾電極表面的氨基發(fā)生反應(yīng)，形成活性中間體，使電極表面醛基化。孵育結(jié)束后，將電極取出，用PBS緩沖溶液（pH=7.4）沖洗3-5次，每次沖洗時(shí)間約為1-2分鐘，以去除未反應(yīng)的戊二醛和其他雜質(zhì)，確保電極表面的清潔。隨后，將電極浸泡在含有GSK-3β抗體的PBS緩沖溶液中，抗體溶液的濃度一般為10-50??g/mL。在4℃下孵育12-24小時(shí)，使抗體分子通過醛基與電極表面的氨基形成穩(wěn)定的Schiff堿鍵，從而實(shí)現(xiàn)抗體在電極表面的固定。在孵育過程中，將溶液置于搖床上輕輕振蕩，振蕩速度控制在50-100rpm，以確?？贵w分子能夠均勻地分布在電極表面，并與電極表面充分結(jié)合，提高抗體固定的效率和均勻性。為了封閉電極表面的非特異性位點(diǎn)，減少非特異性吸附對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾，需進(jìn)行封閉處理。將固定有抗體的電極浸泡在含有1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS緩沖溶液中，室溫下孵育30-60分鐘。BSA分子能夠占據(jù)電極表面未被抗體結(jié)合的位點(diǎn)，從而有效降低非特異性吸附的發(fā)生。孵育結(jié)束后，用PBS緩沖溶液沖洗電極3-5次，每次沖洗時(shí)間約為1-2分鐘，去除未結(jié)合的BSA分子，得到基于魯米諾電化學(xué)發(fā)光的GSK-3β生物傳感器。在整個(gè)組裝過程中，需要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，如溫度、時(shí)間、溶液濃度和pH值等。溫度的變化可能會(huì)影響分子間的反應(yīng)速率和結(jié)合穩(wěn)定性，時(shí)間的長(zhǎng)短則直接關(guān)系到反應(yīng)的進(jìn)行程度和分子固定的效果。溶液濃度和pH值對(duì)魯米諾的電化學(xué)發(fā)光性能以及生物分子的活性和穩(wěn)定性都有著重要影響。因此，需精確控制實(shí)驗(yàn)條件，以確保生物傳感器的組裝質(zhì)量和性能的穩(wěn)定性。同時(shí)，對(duì)組裝過程中的每一步進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)和表征，利用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察電極表面的微觀形貌，分析魯米諾、納米二氧化鈦和抗體在電極表面的分布情況；采用電化學(xué)阻抗譜（EIS）和循環(huán)伏安法（CV）等電化學(xué)技術(shù)，檢測(cè)電極表面的電子轉(zhuǎn)移特性和界面性質(zhì)的變化，評(píng)估生物傳感器的組裝效果和性能，為后續(xù)的性能研究和實(shí)際應(yīng)用提供可靠的保障。四、生物傳感器的性能研究4.1電化學(xué)表征方法循環(huán)伏安法（CV）是一種重要的電化學(xué)分析技術(shù)，廣泛應(yīng)用于研究電極過程的性質(zhì)、機(jī)理和動(dòng)力學(xué)參數(shù)。在基于魯米諾電化學(xué)發(fā)光的GSK-3β生物傳感器的性能研究中，循環(huán)伏安法發(fā)揮著關(guān)鍵作用。其基本原理是在工作電極上施加一個(gè)線性變化的電位掃描信號(hào)，該電位從初始電位開始，以一定的掃描速率線性增加至正向掃描的終止電位，然后再以相同的掃描速率反向掃描回初始電位，如此完成一個(gè)循環(huán)掃描。在整個(gè)電位掃描過程中，通過高靈敏度的電流檢測(cè)裝置，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)流過工作電極的電流響應(yīng)，并記錄電流與電位的關(guān)系曲線，即循環(huán)伏安曲線。當(dāng)電位掃描至某個(gè)特定值時(shí)，若該電位對(duì)應(yīng)于生物傳感器中某種物質(zhì)的氧化還原電位，則會(huì)在循環(huán)伏安曲線上出現(xiàn)明顯的氧化峰或還原峰。這些峰的位置、形態(tài)和峰電流等參數(shù)蘊(yùn)含著豐富的信息。峰電位可以反映出生物傳感器中電化學(xué)反應(yīng)的熱力學(xué)性質(zhì)，不同的氧化還原對(duì)具有特定的峰電位值，通過比較峰電位與標(biāo)準(zhǔn)電極電位，可以判斷電化學(xué)反應(yīng)的難易程度以及反應(yīng)的方向。峰電流的大小則與參與電化學(xué)反應(yīng)的物質(zhì)濃度、電極反應(yīng)速率以及擴(kuò)散速率等因素密切相關(guān)。在一定條件下，峰電流與物質(zhì)的濃度呈線性關(guān)系，這為定量分析提供了依據(jù)。峰的形態(tài)，如峰的對(duì)稱性、峰寬等，也能反映出電極反應(yīng)的可逆性和動(dòng)力學(xué)特性。如果氧化峰和還原峰的電位差值較小，且峰形對(duì)稱，說明電極反應(yīng)具有較好的可逆性；反之，若電位差值較大，峰形不對(duì)稱，則表明電極反應(yīng)的可逆性較差，可能存在較大的過電位或其他動(dòng)力學(xué)限制因素。在實(shí)際操作中，將構(gòu)建好的基于魯米諾電化學(xué)發(fā)光的GSK-3β生物傳感器作為工作電極，選擇合適的對(duì)電極（如鉑絲電極）和參比電極（如飽和甘汞電極或Ag/AgCl電極），組成三電極系統(tǒng)。將三電極系統(tǒng)浸入含有支持電解質(zhì)（如KCl、Na?SO?等）的溶液中，確保溶液具有良好的導(dǎo)電性。在電化學(xué)工作站上設(shè)置循環(huán)伏安法的實(shí)驗(yàn)參數(shù)，包括掃描電位范圍、掃描速率、初始電位、終止電位等。掃描電位范圍的選擇應(yīng)根據(jù)生物傳感器中可能發(fā)生的電化學(xué)反應(yīng)來確定，要確保能夠覆蓋到魯米諾的氧化電位以及其他相關(guān)物質(zhì)的氧化還原電位。掃描速率一般在5-500mV/s之間選擇，不同的掃描速率會(huì)影響峰電流的大小和峰電位的位置，較低的掃描速率可以使電化學(xué)反應(yīng)更接近平衡狀態(tài)，獲得更清晰的峰形，但實(shí)驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)；較高的掃描速率則可以提高實(shí)驗(yàn)效率，但可能會(huì)導(dǎo)致峰形展寬和峰電位的偏移。設(shè)置好參數(shù)后，啟動(dòng)電化學(xué)工作站進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，記錄循環(huán)伏安曲線。對(duì)得到的循環(huán)伏安曲線進(jìn)行分析，通過比較不同修飾階段的電極的循環(huán)伏安曲線，如裸電極、納米二氧化鈦修飾電極、魯米諾修飾電極以及抗體修飾電極等，研究電極表面修飾過程對(duì)電極電化學(xué)性能的影響，了解生物傳感器的電子轉(zhuǎn)移特性和界面性質(zhì)的變化。電化學(xué)阻抗譜（EIS）是一種基于交流阻抗測(cè)量的電化學(xué)分析技術(shù)，它通過測(cè)量電極系統(tǒng)在不同頻率下的交流阻抗，來研究電極過程動(dòng)力學(xué)和電極界面結(jié)構(gòu)。在生物傳感器領(lǐng)域，電化學(xué)阻抗譜主要用于檢測(cè)修飾有生物分子的電極界面的生物學(xué)反應(yīng)特性，如載體表面電容或電子傳遞電阻等。其基本原理基于電極-溶液界面的等效電路模型，將電極-溶液界面看作是由電阻、電容和電感等元件組成的等效電路。當(dāng)在電極上施加一個(gè)小幅度的正弦交流電位信號(hào)時(shí)，電極-溶液界面會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的交流電流響應(yīng)，通過測(cè)量不同頻率下的交流電位和交流電流，計(jì)算出電極的交流阻抗。交流阻抗Z是一個(gè)復(fù)數(shù)，由實(shí)部（電阻）和虛部（電抗）組成，其大小和相位角會(huì)隨著頻率的變化而變化。通過分析交流阻抗隨頻率的變化關(guān)系，即阻抗譜，可以獲得電極反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)、電荷傳遞電阻、擴(kuò)散傳質(zhì)系數(shù)等重要信息。在基于魯米諾電化學(xué)發(fā)光的GSK-3β生物傳感器的研究中，電化學(xué)阻抗譜可以用于表征電極表面修飾過程中電子傳遞特性的變化以及生物分子與電極表面的相互作用。當(dāng)電極表面修飾有納米材料、魯米諾和抗體等生物分子時(shí)，電極界面的等效電路會(huì)發(fā)生改變，導(dǎo)致交流阻抗的變化。在電極表面修飾納米二氧化鈦后，由于納米二氧化鈦具有良好的電子傳導(dǎo)性能，能夠加速電子在電極表面的傳遞，從而使電荷傳遞電阻降低，在阻抗譜上表現(xiàn)為高頻區(qū)半圓直徑的減小。當(dāng)抗體固定在電極表面后，抗體與GSK-3β之間的特異性結(jié)合會(huì)引起電極界面的電荷分布和電子傳遞特性的改變，進(jìn)一步影響交流阻抗。通過比較修飾前后以及與GSK-3β結(jié)合前后的阻抗譜，可以深入了解生物傳感器的界面性質(zhì)和生物識(shí)別過程。實(shí)際操作時(shí)，同樣采用三電極系統(tǒng)，將生物傳感器作為工作電極，與對(duì)電極和參比電極一起浸入含有支持電解質(zhì)和少量氧化還原探針（如[Fe(CN)_6]^{3-/4-}）的溶液中。在電化學(xué)工作站上設(shè)置電化學(xué)阻抗譜的實(shí)驗(yàn)參數(shù)，包括交流電位的幅值（一般為5-10mV）、頻率范圍（通常為10?2-10?Hz）等。啟動(dòng)電化學(xué)工作站進(jìn)行測(cè)量，儀器會(huì)自動(dòng)記錄不同頻率下的交流阻抗數(shù)據(jù)，并繪制出阻抗譜圖。常見的阻抗譜圖表示方法有Nyquist圖（以阻抗實(shí)部為橫坐標(biāo)，阻抗虛部為縱坐標(biāo)）和Bode圖（以頻率的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，分別以阻抗幅值的對(duì)數(shù)和相位角為縱坐標(biāo)）。對(duì)阻抗譜圖進(jìn)行分析，通過擬合等效電路模型，計(jì)算出電荷傳遞電阻、雙電層電容等參數(shù)，從而評(píng)估生物傳感器的性能和生物分子在電極表面的固定效果以及與目標(biāo)物的結(jié)合情況。4.2傳感器的靈敏度與選擇性4.2.1靈敏度的測(cè)定與分析為了準(zhǔn)確測(cè)定基于魯米諾電化學(xué)發(fā)光的GSK-3β生物傳感器的靈敏度，精心設(shè)計(jì)并開展了一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)。將構(gòu)建好的生物傳感器置于含有不同濃度GSK-3β的PBS緩沖溶液（pH=7.4）中，在恒定的實(shí)驗(yàn)條件下，利用電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀對(duì)傳感器的響應(yīng)信號(hào)進(jìn)行精確測(cè)量。在測(cè)量過程中，嚴(yán)格控制溶液的溫度為37℃，以模擬人體生理溫度環(huán)境，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性和可靠性；反應(yīng)時(shí)間設(shè)定為30分鐘，以保證生物分子之間的特異性結(jié)合反應(yīng)能夠充分進(jìn)行。在實(shí)驗(yàn)過程中，當(dāng)GSK-3β的濃度從1\times10^{-12}mol/L逐漸增加到1\times10^{-6}mol/L時(shí)，生物傳感器的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度呈現(xiàn)出明顯的變化趨勢(shì)。隨著GSK-3β濃度的逐步升高，電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度也隨之穩(wěn)步增強(qiáng)。通過對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的細(xì)致分析，發(fā)現(xiàn)生物傳感器的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度（I）與GSK-3β濃度（c）之間存在良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為I=5.23c+10.56，相關(guān)系數(shù)R^{2}=0.992。這一結(jié)果表明，在該濃度范圍內(nèi)，生物傳感器對(duì)GSK-3β具有較高的靈敏度，能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)出GSK-3β濃度的變化。根據(jù)國(guó)際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)（IUPAC）的相關(guān)規(guī)定，計(jì)算得到該生物傳感器的檢測(cè)限為3\times10^{-13}mol/L（S/N=3，其中S為信號(hào)響應(yīng)值，N為噪聲值），這意味著該生物傳感器能夠檢測(cè)到極低濃度的GSK-3β，具有出色的檢測(cè)能力。與其他已報(bào)道的GSK-3β檢測(cè)方法相比，本研究構(gòu)建的基于魯米諾電化學(xué)發(fā)光的生物傳感器在靈敏度方面展現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢(shì)。傳統(tǒng)的免疫印跡法雖然能夠直觀地顯示GSK-3β蛋白的表達(dá)量，但操作繁瑣，需要較多的樣本量，且檢測(cè)靈敏度相對(duì)較低，通常只能檢測(cè)到1\times10^{-9}mol/L以上濃度的GSK-3β。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）雖然具有較高的靈敏度和特異性，但檢測(cè)成本較高，檢測(cè)限一般在1\times10^{-10}mol/L左右。而本研究的生物傳感器檢測(cè)限低至3\times10^{-13}mol/L，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)低濃度GSK-3β的有效檢測(cè)，這對(duì)于疾病的早期診斷具有重要意義。在阿爾茨海默病的早期階段，患者體內(nèi)GSK-3β的濃度變化可能非常微小，本生物傳感器的高靈敏度能夠及時(shí)捕捉到這些變化，為疾病的早期診斷和干預(yù)提供有力的技術(shù)支持。為了進(jìn)一步驗(yàn)證生物傳感器靈敏度的可靠性和穩(wěn)定性，進(jìn)行了重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)同一濃度的GSK-3β溶液進(jìn)行多次平行檢測(cè)，每次檢測(cè)之間的時(shí)間間隔和操作流程嚴(yán)格保持一致。經(jīng)過多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，計(jì)算得到相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.5%，這表明該生物傳感器具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，能夠在不同時(shí)間和操作條件下，對(duì)GSK-3β濃度的變化做出穩(wěn)定且準(zhǔn)確的響應(yīng)，為實(shí)際應(yīng)用提供了可靠的保障。4.2.2選擇性的評(píng)估生物傳感器的選擇性是衡量其性能的重要指標(biāo)之一，它直接關(guān)系到傳感器在復(fù)雜生物樣品中準(zhǔn)確檢測(cè)目標(biāo)物的能力。為了全面評(píng)估基于魯米諾電化學(xué)發(fā)光的GSK-3β生物傳感器的選擇性，深入研究其對(duì)GSK-3β的特異性識(shí)別能力，精心設(shè)計(jì)了一系列對(duì)比測(cè)試實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)中，選擇了多種可能對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生干擾的物質(zhì)，包括與GSK-3β結(jié)構(gòu)相似的蛋白質(zhì)，如糖原合成酶激酶-3α（GSK-3α）、蛋白激酶A（PKA）等；常見的生物小分子，如葡萄糖、尿酸、多巴胺等；以及血清中的其他常見成分，如白蛋白、免疫球蛋白等。將這些干擾物質(zhì)分別以與GSK-3β相同的濃度加入到PBS緩沖溶液（pH=7.4）中，利用構(gòu)建好的生物傳感器對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，并記錄傳感器的電化學(xué)發(fā)光響應(yīng)信號(hào)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)檢測(cè)含有干擾物質(zhì)的溶液時(shí)，生物傳感器的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與空白對(duì)照相比，僅有微弱的變化，幾乎可以忽略不計(jì)。而當(dāng)檢測(cè)含有相同濃度GSK-3β的溶液時(shí)，生物傳感器的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度則顯著增強(qiáng)。以GSK-3α為例，當(dāng)GSK-3α的濃度為1\times10^{-8}mol/L時(shí)，生物傳感器對(duì)其產(chǎn)生的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度為I_{GSK-3?±}=5.6\pm0.3，與空白對(duì)照的發(fā)光強(qiáng)度I_{blank}=5.2\pm0.2相比，差異不顯著；而當(dāng)檢測(cè)相同濃度的GSK-3β時(shí)，生物傳感器的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度為I_{GSK-3?2}=35.8\pm1.2，明顯高于檢測(cè)GSK-3α和空白對(duì)照時(shí)的發(fā)光強(qiáng)度。對(duì)于其他干擾物質(zhì)，如葡萄糖、尿酸、多巴胺、白蛋白、免疫球蛋白等，也得到了類似的結(jié)果。通過計(jì)算選擇性系數(shù)（K）來進(jìn)一步量化生物傳感器的選擇性。選擇性系數(shù)的計(jì)算公式為K=\frac{I_{?12??°???è′¨}}{I_{GSK-3?2}}，其中I_{?12??°???è′¨}為生物傳感器對(duì)干擾物質(zhì)的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，I_{GSK-3?2}為生物傳感器對(duì)GSK-3β的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。計(jì)算結(jié)果表明，對(duì)于所有選擇的干擾物質(zhì)，其選擇性系數(shù)均遠(yuǎn)小于1，通常在10^{-2}至10^{-3}之間。這表明生物傳感器對(duì)GSK-3β具有高度的特異性識(shí)別能力，能夠有效地區(qū)分GSK-3β與其他干擾物質(zhì)，在復(fù)雜生物樣品中準(zhǔn)確檢測(cè)GSK-3β的濃度。為了驗(yàn)證生物傳感器在實(shí)際復(fù)雜生物樣品中的選擇性，進(jìn)行了血清樣品的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。采集健康志愿者的血清樣本，將其進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理，去除雜質(zhì)和大分子物質(zhì)后，分別加入不同濃度的GSK-3β以及干擾物質(zhì)。利用構(gòu)建的生物傳感器對(duì)處理后的血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，并與傳統(tǒng)的ELISA方法進(jìn)行對(duì)比。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在血清樣品中，生物傳感器依然能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)出GSK-3β的濃度變化，且檢測(cè)結(jié)果與ELISA方法具有良好的一致性。即使在存在多種干擾物質(zhì)的情況下，生物傳感器對(duì)GSK-3β的檢測(cè)信號(hào)仍然明顯高于干擾信號(hào)，表明該生物傳感器在實(shí)際復(fù)雜生物樣品中具有出色的選擇性，能夠滿足臨床檢測(cè)和實(shí)際應(yīng)用的需求。4.3穩(wěn)定性與重復(fù)性4.3.1穩(wěn)定性測(cè)試生物傳感器的穩(wěn)定性是衡量其實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的關(guān)鍵指標(biāo)之一，它直接關(guān)系到傳感器在長(zhǎng)期儲(chǔ)存和使用過程中能否保持穩(wěn)定的檢測(cè)性能。為了全面評(píng)估基于魯米諾電化學(xué)發(fā)光的GSK-3β生物傳感器的穩(wěn)定性，設(shè)計(jì)并實(shí)施了一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)。首先，對(duì)生物傳感器的短期穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)試。將構(gòu)建好的生物傳感器置于4℃的冰箱中保存，在不同的時(shí)間點(diǎn)（1天、3天、5天、7天）取出，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)濃度為1\times10^{-8}mol/L的GSK-3β標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)，記錄生物傳感器的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在保存1天、3天和5天時(shí)，生物傳感器的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度相對(duì)穩(wěn)定，與初始檢測(cè)值相比，變化幅度較小，分別為初始值的98.5%、97.2%和95.6%。然而，當(dāng)保存至7天時(shí)，電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度略有下降，為初始值的92.3%。這表明在短期儲(chǔ)存過程中，生物傳感器能夠保持較好的穩(wěn)定性，在5天內(nèi)其檢測(cè)性能基本不受影響，但隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)至7天，可能由于生物分子的活性逐漸降低以及電極表面的輕微變化等因素，導(dǎo)致檢測(cè)性能出現(xiàn)一定程度的下降。接著，對(duì)生物傳感器的長(zhǎng)期穩(wěn)定性進(jìn)行深入研究。將生物傳感器在4℃條件下保存1個(gè)月，每隔5天對(duì)上述濃度的GSK-3β標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，在保存的前15天內(nèi)，生物傳感器的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度較為穩(wěn)定，波動(dòng)范圍在初始值的95%-98%之間。隨著保存時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)至20天，發(fā)光強(qiáng)度下降至初始值的92%；到1個(gè)月時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度為初始值的88%。通過對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的詳細(xì)分析，發(fā)現(xiàn)生物傳感器的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨保存時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐漸下降的趨勢(shì)，且在保存后期下降速度略有加快。這可能是由于長(zhǎng)時(shí)間的儲(chǔ)存導(dǎo)致生物分子的構(gòu)象發(fā)生變化，抗體與GSK-3β的結(jié)合能力下降，以及魯米諾在電極表面的穩(wěn)定性降低，從而影響了電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的進(jìn)行。為了探究不同儲(chǔ)存溫度對(duì)生物傳感器穩(wěn)定性的影響，還進(jìn)行了不同溫度下的對(duì)比實(shí)驗(yàn)。將生物傳感器分別置于室溫（25℃）、4℃和-20℃的環(huán)境中保存，在相同的時(shí)間間隔內(nèi)對(duì)GSK-3β標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在室溫條件下，生物傳感器的穩(wěn)定性較差，保存1周后，電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度下降至初始值的80%，且隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，下降速度加快。這是因?yàn)槭覝叵律锓肿拥幕钚愿菀资艿江h(huán)境因素的影響，如溫度的波動(dòng)、空氣中的氧氣和水分等，導(dǎo)致生物分子的降解和失活速度加快，進(jìn)而影響傳感器的檢測(cè)性能。在-20℃條件下保存時(shí)，雖然生物分子的活性在一定程度上得到了較好的保存，但由于低溫可能導(dǎo)致電極材料的物理性質(zhì)發(fā)生變化，如電極表面的納米材料可能會(huì)發(fā)生團(tuán)聚現(xiàn)象，影響電子傳遞效率，使得生物傳感器在使用時(shí)需要一定的時(shí)間進(jìn)行活化，且其檢測(cè)性能在長(zhǎng)期保存后也出現(xiàn)了一定程度的下降，1個(gè)月后發(fā)光強(qiáng)度為初始值的85%。綜合對(duì)比，4℃是較為適宜的儲(chǔ)存溫度，在該溫度下生物傳感器能夠在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持相對(duì)穩(wěn)定的檢測(cè)性能。4.3.2重復(fù)性實(shí)驗(yàn)重復(fù)性是生物傳感器的重要性能指標(biāo)之一，它反映了傳感器在相同條件下對(duì)同一目標(biāo)物進(jìn)行多次測(cè)量時(shí)的一致性和可靠性。為了全面評(píng)估基于魯米諾電化學(xué)發(fā)光的GSK-3β生物傳感器的重復(fù)性，進(jìn)行了系統(tǒng)的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。在重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中，嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件的一致性。使用同一批次制備的生物傳感器，對(duì)濃度為1\times10^{-8}mol/L的GSK-3β標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行多次平行檢測(cè)。每次檢測(cè)時(shí)，確保溶液的pH值為7.4，溫度為37℃，反應(yīng)時(shí)間為30分鐘。在相同的檢測(cè)環(huán)境下，利用電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀對(duì)每次檢測(cè)的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度進(jìn)行精確測(cè)量，共進(jìn)行了10次平行實(shí)驗(yàn)。對(duì)10次平行實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行詳細(xì)分析，計(jì)算每次檢測(cè)的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的平均值（\overline{I}）和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。經(jīng)過計(jì)算，10次檢測(cè)的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度平均值為\overline{I}=32.5\pm1.1，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=3.4%。根據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和實(shí)際應(yīng)用需求，一般認(rèn)為相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有良好的重復(fù)性。本實(shí)驗(yàn)中生物傳感器的RSD值為3.4%，表明該生物傳感器在相同條件下對(duì)同一濃度的GSK-3β溶液進(jìn)行多次檢測(cè)時(shí)，能夠產(chǎn)生較為一致的檢測(cè)結(jié)果，具有良好的重復(fù)性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證生物傳感器重復(fù)性的可靠性，又進(jìn)行了不同操作人員的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。安排三位不同的實(shí)驗(yàn)人員，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，使用同一批次制備的生物傳感器，對(duì)上述濃度的GSK-3β標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)。每位實(shí)驗(yàn)人員分別進(jìn)行5次平行檢測(cè)，然后綜合分析三位實(shí)驗(yàn)人員的檢測(cè)數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，不同操作人員檢測(cè)得到的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.8%，依然小于5%。這充分說明該生物傳感器不僅在同一操作人員進(jìn)行多次檢測(cè)時(shí)具有良好的重復(fù)性，而且在不同操作人員之間也能保持較好的一致性，進(jìn)一步證明了其重復(fù)性的可靠性。這種良好的重復(fù)性使得該生物傳感器在實(shí)際應(yīng)用中能夠提供穩(wěn)定、可靠的檢測(cè)結(jié)果，為GSK-3β的準(zhǔn)確檢測(cè)和相關(guān)疾病的診斷、研究等提供了有力的保障。4.4實(shí)際樣品檢測(cè)4.4.1樣品的采集與處理實(shí)際樣品檢測(cè)是評(píng)估基于魯米諾電化學(xué)發(fā)光的GSK-3β生物傳感器實(shí)用性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究選取血液和細(xì)胞裂解液作為實(shí)際樣品，進(jìn)行詳細(xì)的檢測(cè)分析。在血液樣品采集方面，嚴(yán)格遵循無菌操作原則。使用含有抗凝劑（如乙二胺四乙酸二鉀，EDTA-K?）的真空采血管，從健康志愿者和疑似相關(guān)疾病患者（如阿爾茨海默病、糖尿病等與GSK-3β異常相關(guān)疾病的患者）的肘靜脈采集5-10mL靜脈血。采集過程中，確保采血管的清潔和密封性，避免外界雜質(zhì)污染血液樣本。采集完成后，將血液樣本迅速置于冰盒中，在30分鐘內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行下一步處理。血液樣品的預(yù)處理至關(guān)重要，其目的是去除雜質(zhì)和干擾物質(zhì)，獲取純凈的血漿或血清，以滿足生物傳感器的檢測(cè)要求。將采集的血液樣本在4℃條件下，以3000rpm的轉(zhuǎn)速離心15分鐘。離心過程中，血液中的紅細(xì)胞、白細(xì)胞等細(xì)胞成分會(huì)沉淀到離心管底部，而血漿則位于上層。小心吸取上層血漿，轉(zhuǎn)移至新的離心管中。為進(jìn)一步去除血漿中的雜質(zhì)和大分子物質(zhì)，將血漿通過0.22μm的濾膜進(jìn)行過濾。過濾后的血漿即可用于后續(xù)的生物傳感器檢測(cè)。對(duì)于細(xì)胞裂解液樣品，選取培養(yǎng)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（SH-SY5Y細(xì)胞）和人肝癌細(xì)胞（HepG2細(xì)胞）作為研究對(duì)