基因敲除HPV16E6對(duì)宮頸癌細(xì)胞p63蛋白表達(dá)及功能影響的深度剖析一、引言1.1研究背景宮頸癌是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅女性健康的惡性腫瘤之一。根據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的數(shù)據(jù)，2020年全球?qū)m頸癌新發(fā)病例約60.4萬(wàn)，死亡病例約34.2萬(wàn)，其發(fā)病率和死亡率在女性惡性腫瘤中均位居前列。在我國(guó)，宮頸癌同樣是一個(gè)不容忽視的公共衛(wèi)生問題，每年新增病例數(shù)眾多，且發(fā)病年齡呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)。如2022年我國(guó)新發(fā)宮頸癌病例15.1萬(wàn)份，發(fā)病率為十萬(wàn)分之十三點(diǎn)八，居女性癌癥發(fā)病第五位。高危型人乳頭瘤病毒（HPV）的持續(xù)感染是引發(fā)宮頸癌的主要病因，其中HPV16型是最為常見且致癌性最強(qiáng)的高危型別。HPV16主要通過(guò)其編碼的E6和E7蛋白發(fā)揮致癌作用。E6蛋白能夠與細(xì)胞內(nèi)的抑癌蛋白p53結(jié)合，促使p53通過(guò)泛素化途徑降解，從而使細(xì)胞喪失對(duì)異常增殖的監(jiān)控和抑制能力。正常情況下，p53作為細(xì)胞內(nèi)重要的“基因組衛(wèi)士”，在細(xì)胞受到DNA損傷等應(yīng)激時(shí)被激活，通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、促進(jìn)DNA修復(fù)或觸發(fā)細(xì)胞凋亡等機(jī)制，維持基因組的穩(wěn)定性，阻止腫瘤的發(fā)生發(fā)展。當(dāng)p53被E6蛋白降解后，細(xì)胞內(nèi)受損的DNA無(wú)法得到有效修復(fù)，細(xì)胞增殖和凋亡失衡，導(dǎo)致細(xì)胞不斷積累遺傳物質(zhì)的改變，逐漸向癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化。p63蛋白作為p53家族的重要成員，在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著復(fù)雜而關(guān)鍵的角色。p63基因可通過(guò)不同的啟動(dòng)子和可變剪接方式，產(chǎn)生多種異構(gòu)體，主要分為TAp63和ΔNp63兩大類。TAp63具有與p53相似的N端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，在功能上部分模擬p53，能夠激活下游一系列與細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡相關(guān)的靶基因，發(fā)揮抑癌作用。例如，TAp63可以誘導(dǎo)p21基因的表達(dá)，使細(xì)胞周期停滯在G1期，阻止異常細(xì)胞的增殖；同時(shí)，TAp63還能激活促凋亡基因Bax，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，清除潛在的癌細(xì)胞。而ΔNp63則缺少N端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，不僅自身無(wú)法有效激活p53相關(guān)的靶基因，還能通過(guò)與TAp63競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合DNA靶序列，或與p53形成無(wú)功能的異源二聚體，從而抑制p53和TAp63的抑癌功能。在宮頸癌中，ΔNp63常常呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，其高表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及不良預(yù)后密切相關(guān)。研究表明，ΔNp63高表達(dá)的宮頸癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖、遷移和侵襲能力，更容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，患者的生存率也相對(duì)較低?；蚯贸夹g(shù)作為一種重要的分子生物學(xué)手段，在腫瘤研究領(lǐng)域發(fā)揮著關(guān)鍵作用。通過(guò)基因敲除技術(shù)，可以特異性地去除細(xì)胞或生物體中的某個(gè)基因，從而深入研究該基因在生理和病理過(guò)程中的功能和作用機(jī)制。在宮頸癌研究中，基因敲除技術(shù)為探究HPV16E6基因與宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為之間的關(guān)系提供了有力工具。例如，利用CRISPR/Cas9等基因編輯技術(shù)敲除HPV16E6基因后，宮頸癌細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制，細(xì)胞周期出現(xiàn)阻滯，凋亡率增加。這表明HPV16E6基因?qū)τ诰S持宮頸癌細(xì)胞的惡性表型至關(guān)重要，敲除該基因能夠有效逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞的部分惡性特征。盡管目前對(duì)于HPV16E6致癌機(jī)制以及p63蛋白在宮頸癌中的作用已有一定認(rèn)識(shí)，但仍存在許多未知領(lǐng)域亟待探索。研究基因敲除HPV16E6對(duì)宮頸癌細(xì)胞p63蛋白的影響，有望揭示HPV16感染導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生發(fā)展的新機(jī)制。一方面，明確兩者之間的關(guān)系，有助于深入理解HPV16E6如何通過(guò)干擾p63蛋白的功能，打破細(xì)胞內(nèi)正常的增殖、凋亡平衡，從而推動(dòng)宮頸癌的發(fā)生。另一方面，這一研究也可能為宮頸癌的診斷和治療開辟新的方向。例如，若發(fā)現(xiàn)基因敲除HPV16E6后，p63蛋白的表達(dá)或功能發(fā)生了特異性改變，那么p63蛋白及其相關(guān)信號(hào)通路可能成為宮頸癌早期診斷的潛在生物標(biāo)志物，以及治療干預(yù)的新靶點(diǎn)。通過(guò)針對(duì)p63蛋白進(jìn)行靶向治療，有望開發(fā)出更加精準(zhǔn)、有效的宮頸癌治療策略，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究基因敲除HPV16E6對(duì)宮頸癌細(xì)胞p63蛋白的影響，從分子水平揭示HPV16相關(guān)宮頸癌發(fā)生發(fā)展的潛在機(jī)制，為宮頸癌的防治提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)。具體而言，本研究將通過(guò)基因敲除技術(shù)，構(gòu)建HPV16E6基因缺失的宮頸癌細(xì)胞模型，對(duì)比分析敲除前后宮頸癌細(xì)胞中p63蛋白在表達(dá)水平、蛋白結(jié)構(gòu)、細(xì)胞定位以及與其他相關(guān)蛋白相互作用等方面的變化。同時(shí)，進(jìn)一步研究這些變化對(duì)宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為，如增殖、凋亡、遷移、侵襲等的影響，從而全面系統(tǒng)地闡述基因敲除HPV16E6與宮頸癌細(xì)胞p63蛋白之間的內(nèi)在聯(lián)系。從理論意義來(lái)看，本研究有助于深化對(duì)HPV16致癌機(jī)制的理解。盡管目前已知HPV16E6通過(guò)降解p53等途徑促進(jìn)腫瘤發(fā)生，但HPV16E6與p63蛋白之間復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚未完全明晰。通過(guò)研究基因敲除HPV16E6對(duì)p63蛋白的影響，有望填補(bǔ)這一領(lǐng)域的理論空白，為揭示HPV16感染導(dǎo)致宮頸癌的分子機(jī)制提供新的視角和線索。這不僅有助于完善腫瘤發(fā)生發(fā)展的理論體系，還能為后續(xù)相關(guān)研究奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，推動(dòng)腫瘤分子生物學(xué)領(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展。在實(shí)踐意義方面，本研究成果具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。宮頸癌作為嚴(yán)重威脅女性健康的惡性腫瘤，早期診斷和有效治療一直是臨床關(guān)注的焦點(diǎn)。若能明確基因敲除HPV16E6后p63蛋白的變化與宮頸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，那么p63蛋白及其相關(guān)信號(hào)通路有望成為宮頸癌早期診斷的新型生物標(biāo)志物。通過(guò)檢測(cè)p63蛋白的表達(dá)水平、結(jié)構(gòu)或功能變化，能夠更精準(zhǔn)地預(yù)測(cè)宮頸癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，實(shí)現(xiàn)早期篩查和診斷，為患者爭(zhēng)取寶貴的治療時(shí)機(jī)。此外，以p63蛋白為靶點(diǎn)開發(fā)新型治療策略，如設(shè)計(jì)特異性的小分子抑制劑或靶向藥物，干預(yù)p63蛋白的異常功能，有望為宮頸癌的治療提供新的有效手段，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。同時(shí)，本研究也可能為其他HPV相關(guān)疾病的防治提供借鑒和參考，具有廣泛的應(yīng)用前景。二、研究綜述2.1HPV16E6與宮頸癌的關(guān)系人乳頭瘤病毒（HPV）是一類雙鏈環(huán)狀DNA病毒，其基因組包含早期基因區(qū)（E1、E2、E4、E5、E6、E7）、晚期基因區(qū)（L1、L2）以及長(zhǎng)控制區(qū)（LCR）。在眾多HPV型別中，HPV16屬于高危型別，其編碼的E6蛋白具有強(qiáng)烈的致癌活性，在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色。HPV16E6蛋白是一種由151個(gè)氨基酸組成的小分子蛋白，其空間結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出獨(dú)特的折疊方式，包含多個(gè)α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)特征賦予了E6蛋白與多種細(xì)胞內(nèi)蛋白相互作用的能力。研究表明，E6蛋白能夠通過(guò)其C末端的PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白結(jié)合模體，與細(xì)胞內(nèi)一系列含有PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白相互作用，從而干擾細(xì)胞的正常生理功能。此外，E6蛋白還具有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，這些位點(diǎn)的磷酸化修飾能夠調(diào)節(jié)E6蛋白的活性以及其與其他蛋白的結(jié)合能力，進(jìn)一步影響細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路。HPV16E6蛋白的致癌機(jī)制主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面。首先，E6蛋白能夠與細(xì)胞內(nèi)的抑癌蛋白p53緊密結(jié)合。這種結(jié)合作用是通過(guò)E6蛋白與E6相關(guān)蛋白（E6AP）形成復(fù)合物來(lái)實(shí)現(xiàn)的。E6AP是一種E3泛素連接酶，當(dāng)E6蛋白與E6AP結(jié)合后，能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合p53蛋白，隨后將多個(gè)泛素分子連接到p53蛋白上。泛素化修飾后的p53蛋白會(huì)被細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶體識(shí)別并降解，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)p53蛋白水平急劇下降。p53蛋白作為細(xì)胞內(nèi)重要的腫瘤抑制因子，在正常細(xì)胞中發(fā)揮著維持基因組穩(wěn)定性、調(diào)控細(xì)胞周期以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等關(guān)鍵作用。當(dāng)p53蛋白被E6蛋白降解后，細(xì)胞對(duì)DNA損傷的修復(fù)能力下降，細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制失控，使得受損細(xì)胞能夠逃避凋亡程序，持續(xù)增殖，進(jìn)而增加了細(xì)胞發(fā)生癌變的風(fēng)險(xiǎn)。其次，HPV16E6蛋白還能夠通過(guò)多種途徑促進(jìn)細(xì)胞的增殖和永生化。E6蛋白可以激活端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT）的表達(dá)，從而增強(qiáng)端粒酶的活性。端粒酶是一種能夠延長(zhǎng)染色體末端端粒長(zhǎng)度的酶，在正常體細(xì)胞中，端粒酶的活性受到嚴(yán)格調(diào)控，隨著細(xì)胞的分裂，端粒逐漸縮短，當(dāng)端粒縮短到一定程度時(shí)，細(xì)胞就會(huì)進(jìn)入衰老或凋亡狀態(tài)。而在癌細(xì)胞中，端粒酶活性異常升高，能夠維持端粒的長(zhǎng)度，使細(xì)胞獲得無(wú)限增殖的能力。E6蛋白通過(guò)激活TERT，使得宮頸上皮細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度得以維持，細(xì)胞不斷增殖，逐漸向癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化。此外，E6蛋白還可以與細(xì)胞內(nèi)的其他增殖相關(guān)蛋白相互作用，如激活PI3K-AKT信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。PI3K-AKT信號(hào)通路在細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活、代謝等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，E6蛋白通過(guò)激活該信號(hào)通路，能夠促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）等增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，使細(xì)胞增殖速度加快。HPV16E6蛋白還能夠抑制細(xì)胞凋亡，為癌細(xì)胞的生存和發(fā)展創(chuàng)造有利條件。E6蛋白可以與死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白（Daxx）結(jié)合，抑制Daxx啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，從而降低Daxx蛋白的表達(dá)水平。Daxx蛋白是一種參與細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的重要蛋白，其表達(dá)下降會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡信號(hào)通路受阻，細(xì)胞凋亡受到抑制。此外，E6蛋白還可以通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)，影響細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Bcl-2家族蛋白包括促凋亡蛋白（如Bax、Bak等）和抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-XL等），它們之間的平衡關(guān)系決定了細(xì)胞是否發(fā)生凋亡。E6蛋白能夠上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)促凋亡蛋白Bax、Bak的表達(dá)，從而使細(xì)胞內(nèi)的凋亡平衡向抗凋亡方向傾斜，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。HPV16E6蛋白在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用已經(jīng)得到了大量研究的證實(shí)。臨床研究表明，在宮頸癌患者的腫瘤組織中，HPV16E6蛋白的表達(dá)水平明顯高于正常宮頸組織，且其表達(dá)水平與腫瘤的分期、分級(jí)以及患者的預(yù)后密切相關(guān)。高表達(dá)HPV16E6蛋白的宮頸癌患者，其腫瘤的惡性程度更高，更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，患者的生存率也相對(duì)較低。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型研究中，也發(fā)現(xiàn)將HPV16E6基因?qū)胝m頸上皮細(xì)胞后，細(xì)胞會(huì)逐漸獲得癌細(xì)胞的特征，如增殖能力增強(qiáng)、侵襲和遷移能力提高、對(duì)凋亡誘導(dǎo)劑的抵抗性增強(qiáng)等。而通過(guò)基因敲除或RNA干擾等技術(shù)抑制HPV16E6蛋白的表達(dá)后，宮頸癌細(xì)胞的惡性表型會(huì)得到明顯逆轉(zhuǎn)，細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力受到抑制，凋亡率增加。2.2p63蛋白在宮頸癌細(xì)胞中的作用p63蛋白作為p53家族的關(guān)鍵成員，其結(jié)構(gòu)和功能的復(fù)雜性在腫瘤研究領(lǐng)域備受關(guān)注。p63基因定位于人類染色體3q27-29區(qū)域，該基因可通過(guò)不同的啟動(dòng)子和可變剪接機(jī)制，產(chǎn)生多種異構(gòu)體。根據(jù)其N端結(jié)構(gòu)的差異，主要分為TAp63和ΔNp63兩大類。TAp63異構(gòu)體包含與p53相似的N端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，這一結(jié)構(gòu)域能夠招募轉(zhuǎn)錄相關(guān)的輔助因子，如CBP/p300等，與p63蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域協(xié)同作用，識(shí)別并結(jié)合下游靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列，從而激活基因轉(zhuǎn)錄。而ΔNp63異構(gòu)體則缺少N端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，其N端由獨(dú)特的氨基酸序列組成，這使得ΔNp63在功能上與TAp63存在顯著差異。在宮頸癌細(xì)胞中，p63蛋白的表達(dá)模式與正常宮頸組織相比發(fā)生了明顯改變。研究表明，正常宮頸上皮組織中，TAp63和ΔNp63均有表達(dá)，且兩者之間維持著相對(duì)平衡的狀態(tài)。TAp63主要表達(dá)于宮頸上皮的基底細(xì)胞層，其通過(guò)激活一系列與細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡相關(guān)的靶基因，如p21、Bax等，抑制細(xì)胞的異常增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，維持宮頸上皮細(xì)胞的正常穩(wěn)態(tài)。而ΔNp63在正常宮頸上皮組織中的表達(dá)相對(duì)較低，主要參與細(xì)胞的分化和發(fā)育過(guò)程。然而，在宮頸癌細(xì)胞中，ΔNp63的表達(dá)水平顯著上調(diào)，而TAp63的表達(dá)則相對(duì)下調(diào)，這種表達(dá)失衡在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到了關(guān)鍵作用。p63蛋白，尤其是ΔNp63異構(gòu)體，與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在細(xì)胞增殖方面，ΔNp63能夠通過(guò)多種途徑促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖。一方面，ΔNp63可以與E2F轉(zhuǎn)錄因子家族成員相互作用，激活E2F介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞周期從G1期向S期的轉(zhuǎn)換，從而加速細(xì)胞增殖。研究發(fā)現(xiàn)，在高表達(dá)ΔNp63的宮頸癌細(xì)胞中，E2F1、E2F2等轉(zhuǎn)錄因子的活性明顯增強(qiáng)，細(xì)胞周期蛋白CyclinD1、CyclinE等的表達(dá)也顯著上調(diào)，這些蛋白的異常表達(dá)共同促進(jìn)了細(xì)胞的快速增殖。另一方面，ΔNp63還可以抑制p53和TAp63的抑癌功能，間接促進(jìn)細(xì)胞增殖。如前文所述，ΔNp63能夠與TAp63競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合DNA靶序列，阻止TAp63對(duì)下游靶基因的激活；同時(shí)，ΔNp63還能與p53形成無(wú)功能的異源二聚體，使p53喪失對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的調(diào)控能力，導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控。p63蛋白在宮頸癌細(xì)胞的分化過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用。正常情況下，宮頸上皮細(xì)胞的分化是一個(gè)有序的過(guò)程，從基底細(xì)胞逐漸向上分化為成熟的鱗狀上皮細(xì)胞。在這一過(guò)程中，TAp63和ΔNp63通過(guò)相互協(xié)調(diào)，共同調(diào)控細(xì)胞的分化相關(guān)基因表達(dá)。然而，在宮頸癌發(fā)生時(shí)，p63蛋白的表達(dá)失衡導(dǎo)致細(xì)胞分化異常。高表達(dá)的ΔNp63會(huì)抑制宮頸癌細(xì)胞向鱗狀上皮細(xì)胞的正常分化，使細(xì)胞停留在未分化或低分化狀態(tài)。研究表明，ΔNp63可以通過(guò)抑制角質(zhì)形成細(xì)胞分化相關(guān)基因，如KRT1、KRT10等的表達(dá)，阻礙細(xì)胞的終末分化。這些基因編碼的角蛋白是鱗狀上皮細(xì)胞分化的重要標(biāo)志物，其表達(dá)受到抑制會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的分化受阻，進(jìn)而影響宮頸上皮的正常結(jié)構(gòu)和功能。由于p63蛋白在宮頸癌細(xì)胞中的異常表達(dá)與細(xì)胞的增殖、分化密切相關(guān)，因此其可作為鱗狀上皮源性腫瘤的重要標(biāo)記物。在宮頸癌的病理診斷中，檢測(cè)p63蛋白的表達(dá)情況有助于判斷腫瘤的來(lái)源和分化程度。免疫組織化學(xué)染色是常用的檢測(cè)方法，通過(guò)特異性抗體標(biāo)記p63蛋白，在顯微鏡下觀察其在組織切片中的表達(dá)部位和強(qiáng)度。研究顯示，在大多數(shù)宮頸癌組織中，p63蛋白呈陽(yáng)性表達(dá)，尤其是在鱗狀細(xì)胞癌中，p63的陽(yáng)性表達(dá)率較高。而且，p63蛋白的表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤的分化程度相關(guān)，高分化的宮頸癌組織中p63表達(dá)相對(duì)較高，而低分化的腫瘤組織中p63表達(dá)則相對(duì)較低。這表明p63蛋白不僅可以作為宮頸癌診斷的輔助指標(biāo)，還能為評(píng)估腫瘤的惡性程度和預(yù)后提供重要參考。2.3基因敲除技術(shù)在宮頸癌研究中的應(yīng)用基因敲除技術(shù)是指通過(guò)一定的途徑使機(jī)體特定的基因失活或缺失的技術(shù)。其原理主要基于DNA同源重組、基因編輯等分子生物學(xué)機(jī)制。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，基因敲除技術(shù)在方法上日益多樣化，目前常用的方法包括CRISPR-Cas9技術(shù)、鋅指核酸酶（ZFNs）技術(shù)以及RNA干擾（RNAi）技術(shù)等。CRISPR-Cas9技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展最為迅速且廣泛應(yīng)用的基因敲除方法之一。該技術(shù)源于細(xì)菌和古細(xì)菌的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。在這一系統(tǒng)中，CRISPR序列轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的crRNA（CRISPR-derivedRNA）與tracrRNA（trans-activatingcrRNA）形成復(fù)合物，該復(fù)合物能夠引導(dǎo)Cas9核酸酶識(shí)別并結(jié)合到與crRNA互補(bǔ)的靶DNA序列上。Cas9核酸酶具有核酸內(nèi)切酶活性，能夠在靶位點(diǎn)處對(duì)DNA雙鏈進(jìn)行切割，形成雙鏈斷裂（DSB）。細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)機(jī)制在修復(fù)DSB時(shí)，可能會(huì)引入插入或缺失突變，從而導(dǎo)致靶基因的功能喪失，實(shí)現(xiàn)基因敲除的目的。CRISPR-Cas9技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、效率高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，其能夠在多種細(xì)胞系和生物體中實(shí)現(xiàn)高效的基因編輯。例如，在小鼠模型中，通過(guò)CRISPR-Cas9技術(shù)可以快速構(gòu)建特定基因敲除的小鼠，用于研究基因功能和疾病機(jī)制。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，該技術(shù)也能夠?qū)m頸癌細(xì)胞系進(jìn)行精確的基因編輯，為宮頸癌的研究提供了有力工具。鋅指核酸酶（ZFNs）技術(shù)則是利用鋅指蛋白（ZFP）與特定DNA序列的高親和力結(jié)合特性。每個(gè)鋅指蛋白通常由30個(gè)左右的氨基酸組成，能夠識(shí)別并結(jié)合3個(gè)連續(xù)的堿基對(duì)。通過(guò)將多個(gè)鋅指蛋白串聯(lián)起來(lái)，可以設(shè)計(jì)出能夠特異性識(shí)別較長(zhǎng)DNA序列的鋅指蛋白陣列。將鋅指蛋白陣列與核酸內(nèi)切酶FokI的切割結(jié)構(gòu)域融合，就形成了ZFNs。當(dāng)ZFNs與靶DNA序列結(jié)合后，兩個(gè)FokI結(jié)構(gòu)域會(huì)二聚化，從而發(fā)揮核酸內(nèi)切酶活性，切割靶DNA序列。與CRISPR-Cas9技術(shù)類似，細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)機(jī)制在修復(fù)ZFNs切割產(chǎn)生的DSB時(shí)，會(huì)引入基因突變，實(shí)現(xiàn)基因敲除。ZFNs技術(shù)在早期的基因敲除研究中發(fā)揮了重要作用，但其設(shè)計(jì)和構(gòu)建較為復(fù)雜，需要針對(duì)每個(gè)靶基因進(jìn)行特定的鋅指蛋白設(shè)計(jì)，且脫靶效應(yīng)相對(duì)較高，這在一定程度上限制了其廣泛應(yīng)用。RNA干擾（RNAi）技術(shù)是通過(guò)引入小干擾RNA（siRNA）或短發(fā)夾RNA（shRNA）來(lái)實(shí)現(xiàn)基因敲除。siRNA是一種雙鏈RNA分子，長(zhǎng)度通常為21-23個(gè)核苷酸。當(dāng)細(xì)胞攝取siRNA后，其會(huì)被核酸酶切割成小片段，這些小片段與細(xì)胞內(nèi)的RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）結(jié)合。RISC中的核酸酶能夠識(shí)別并切割與siRNA互補(bǔ)的靶mRNA，從而導(dǎo)致mRNA的降解，抑制靶基因的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)基因敲低（knockdown），在一定程度上也可視為基因功能的部分敲除。shRNA則是一種可以在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA分子，其在細(xì)胞內(nèi)被加工成siRNA后，同樣通過(guò)RISC途徑發(fā)揮作用。RNAi技術(shù)具有操作相對(duì)簡(jiǎn)單、周期短等優(yōu)點(diǎn)，常用于基因功能的初步研究。然而，RNAi技術(shù)只能抑制基因的表達(dá)，不能完全消除基因功能，且存在脫靶效應(yīng)，可能會(huì)對(duì)其他基因的表達(dá)產(chǎn)生影響。在宮頸癌研究領(lǐng)域，基因敲除技術(shù)已取得了一系列重要成果。有研究利用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除了宮頸癌細(xì)胞系中的HPV16E6基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲除E6基因后，宮頸癌細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制，細(xì)胞周期出現(xiàn)阻滯，G1期細(xì)胞比例增加，S期和G2/M期細(xì)胞比例減少。這表明HPV16E6基因?qū)τ诰S持宮頸癌細(xì)胞的增殖能力至關(guān)重要，敲除該基因能夠有效阻止細(xì)胞周期的進(jìn)程，抑制癌細(xì)胞的增殖。研究人員還發(fā)現(xiàn)，敲除E6基因后，宮頸癌細(xì)胞的凋亡率顯著增加，細(xì)胞內(nèi)與凋亡相關(guān)的蛋白，如Bax、Caspase-3等的表達(dá)上調(diào)，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)下調(diào)。這說(shuō)明HPV16E6基因通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡來(lái)促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，敲除E6基因能夠恢復(fù)細(xì)胞的凋亡機(jī)制，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。利用RNAi技術(shù)抑制HPV16E7基因的表達(dá)，也觀察到了類似的結(jié)果。通過(guò)轉(zhuǎn)染針對(duì)HPV16E7基因的siRNA，使宮頸癌細(xì)胞中E7蛋白的表達(dá)水平降低。結(jié)果顯示，宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯下降，細(xì)胞外基質(zhì)降解相關(guān)酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)減少。這表明HPV16E7基因在宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，抑制E7基因的表達(dá)能夠有效抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。研究還發(fā)現(xiàn)，RNAi介導(dǎo)的E7基因表達(dá)抑制能夠增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。在加入順鉑等化療藥物后，siRNA處理組的宮頸癌細(xì)胞死亡率明顯高于對(duì)照組，這為宮頸癌的聯(lián)合治療提供了新的思路。三、材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1細(xì)胞系選用HPV16陽(yáng)性的宮頸癌細(xì)胞系SiHa細(xì)胞和CaSki細(xì)胞。SiHa細(xì)胞來(lái)源于一位55歲日本女性的原發(fā)性子宮組織樣本片段，是從其宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中建立起來(lái)的，具有上皮細(xì)胞樣形態(tài)，呈貼壁生長(zhǎng)特性。該細(xì)胞為超三倍體人類細(xì)胞系，模式染色體數(shù)為71，每個(gè)細(xì)胞中整合有1-2個(gè)拷貝的HPV16基因組。CaSki細(xì)胞同樣為宮頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系，HPV16病毒DNA在該細(xì)胞中呈多拷貝整合狀態(tài)。這兩種細(xì)胞系均廣泛應(yīng)用于HPV相關(guān)宮頸癌的研究，能夠?yàn)樘骄炕蚯贸鼿PV16E6對(duì)宮頸癌細(xì)胞p63蛋白的影響提供良好的細(xì)胞模型。3.1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑基因敲除相關(guān)試劑：CRISPR-Cas9系統(tǒng)相關(guān)試劑，包括Cas9核酸酶表達(dá)質(zhì)粒、針對(duì)HPV16E6基因設(shè)計(jì)的sgRNA（smallguideRNA）表達(dá)載體。sgRNA序列根據(jù)HPV16E6基因序列（GenBank登錄號(hào)：NC_001526.3），利用在線設(shè)計(jì)工具（如/）進(jìn)行設(shè)計(jì)，確保其特異性靶向HPV16E6基因，且GC含量在40%-60%之間，避免與其他基因序列產(chǎn)生非特異性結(jié)合。設(shè)計(jì)好的sgRNA序列由專業(yè)生物公司合成，并克隆至相應(yīng)的表達(dá)載體中。限制性內(nèi)切酶BsmBI，用于sgRNA表達(dá)載體的構(gòu)建，酶切反應(yīng)體系和條件按照其說(shuō)明書進(jìn)行操作。T4DNA連接酶，用于連接酶切后的載體和sgRNA片段，連接反應(yīng)在16℃條件下過(guò)夜進(jìn)行。Stbl3感受態(tài)細(xì)胞，用于轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)熱激法（42℃熱激90秒）進(jìn)行轉(zhuǎn)化，然后在含氨芐青霉素的LB平板上篩選陽(yáng)性克隆。細(xì)胞培養(yǎng)試劑：DMEM培養(yǎng)基（Dulbecco'sModifiedEagleMedium），為細(xì)胞生長(zhǎng)提供基本營(yíng)養(yǎng)成分，購(gòu)自Gibco公司。使用時(shí)，添加10%胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS），以提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；添加1%雙抗（青霉素-鏈霉素混合液），防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)菌污染。0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，用于消化貼壁生長(zhǎng)的宮頸癌細(xì)胞，使其從培養(yǎng)瓶壁上脫離下來(lái)，便于進(jìn)行傳代培養(yǎng)或后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。消化時(shí)，將適量消化液加入培養(yǎng)瓶中，37℃孵育1-2分鐘，待細(xì)胞變圓并開始脫落時(shí)，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化。檢測(cè)試劑：兔抗人p63多克隆抗體，用于檢測(cè)細(xì)胞中p63蛋白的表達(dá)水平，購(gòu)自Abcam公司。該抗體經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的驗(yàn)證和質(zhì)量控制，能夠特異性識(shí)別p63蛋白，與其他p53家族成員無(wú)明顯交叉反應(yīng)。辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔二抗，與一抗結(jié)合后，通過(guò)酶促反應(yīng)催化底物顯色，實(shí)現(xiàn)對(duì)p63蛋白的檢測(cè)。二抗的稀釋比例根據(jù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化確定，一般為1:5000-1:10000。ECL化學(xué)發(fā)光底物，在HRP的催化下，能夠產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)，通過(guò)曝光于X光膠片或化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，從而顯示出p63蛋白的條帶。BCA蛋白定量試劑盒，用于測(cè)定細(xì)胞裂解液中的蛋白濃度，以便在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中保證每個(gè)樣品的上樣量一致。該試劑盒利用蛋白質(zhì)與BCA試劑形成紫色絡(luò)合物的原理，通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度。RIPA裂解液，用于裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。裂解液中含有多種去污劑和蛋白酶抑制劑，能夠有效裂解細(xì)胞，同時(shí)防止蛋白降解。使用時(shí)，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入適量裂解液，冰上孵育30分鐘，期間輕輕振蕩，使細(xì)胞充分裂解。隨后，12000g離心15分鐘，取上清液作為細(xì)胞總蛋白提取物。3.1.3實(shí)驗(yàn)儀器PCR儀：型號(hào)為Bio-RadT100ThermalCycler，用于擴(kuò)增目的基因片段和進(jìn)行基因編輯效率的初步檢測(cè)。在進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)，根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑O(shè)置相應(yīng)的反應(yīng)程序，包括變性、退火和延伸步驟，每個(gè)步驟的溫度和時(shí)間根據(jù)引物和模板的特性進(jìn)行優(yōu)化。離心機(jī)：使用Eppendorf5424R型離心機(jī)，可用于細(xì)胞離心、蛋白樣品離心等操作。在細(xì)胞離心時(shí)，根據(jù)細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)要求設(shè)置合適的離心速度和時(shí)間，如在收集宮頸癌細(xì)胞時(shí)，一般1000g離心5分鐘；在蛋白樣品離心時(shí)，通常12000g離心15分鐘，以獲得澄清的上清液。流式細(xì)胞儀：BDFACSCalibur流式細(xì)胞儀，用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期分布。在檢測(cè)細(xì)胞凋亡時(shí)，使用AnnexinV-FITC/PI雙染法，將細(xì)胞與AnnexinV-FITC和PI染色液孵育，然后通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同熒光強(qiáng)度的細(xì)胞群體，分析細(xì)胞凋亡的比例。在檢測(cè)細(xì)胞周期時(shí)，用PI對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，通過(guò)檢測(cè)DNA含量的變化，分析細(xì)胞在不同周期（G1期、S期、G2/M期）的分布情況。蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)：Bio-RadMini-PROTEANTetra垂直電泳系統(tǒng)，用于蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。根據(jù)目的蛋白的分子量大小，選擇合適濃度的分離膠和濃縮膠，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合后上樣，在恒壓條件下進(jìn)行電泳，使不同分子量的蛋白質(zhì)在凝膠中得到分離。轉(zhuǎn)膜儀：Bio-RadTrans-BlotTurbo轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)，用于將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上。轉(zhuǎn)膜時(shí)，按照“三明治”結(jié)構(gòu)將凝膠、NC膜和濾紙依次放置在轉(zhuǎn)膜裝置中，加入轉(zhuǎn)膜緩沖液，在特定的電流和時(shí)間條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，確保蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到NC膜上。化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)：Bio-RadChemiDocXRS+成像系統(tǒng)，用于檢測(cè)ECL化學(xué)發(fā)光信號(hào)，顯示蛋白質(zhì)條帶。將轉(zhuǎn)膜后的NC膜與ECL化學(xué)發(fā)光底物孵育后，放入成像系統(tǒng)中進(jìn)行曝光，通過(guò)軟件分析條帶的灰度值，半定量分析蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1基因敲除HPV16E6運(yùn)用CRISPR-Cas9技術(shù)進(jìn)行HPV16E6基因敲除。首先，借助在線設(shè)計(jì)工具（如/），依據(jù)HPV16E6基因序列（GenBank登錄號(hào)：NC_001526.3）設(shè)計(jì)sgRNA。設(shè)計(jì)時(shí)嚴(yán)格遵循特異性原則，確保sgRNA序列與HPV16E6基因的目標(biāo)位點(diǎn)精準(zhǔn)匹配，避免與其他基因產(chǎn)生非特異性結(jié)合。同時(shí)，將sgRNA的GC含量控制在40%-60%之間，以保證其在實(shí)驗(yàn)條件下具有合適的穩(wěn)定性和雜交性。此外，避免選擇在基因組中存在多個(gè)拷貝或重復(fù)序列的區(qū)域，防止出現(xiàn)非預(yù)期的多基因編輯。綜合考量以上因素，設(shè)計(jì)出3條特異性sgRNA序列，分別為sgRNA-1、sgRNA-2和sgRNA-3，其序列如下：sgRNA-1：5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’sgRNA-2：5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’sgRNA-3：5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’將設(shè)計(jì)好的sgRNA序列交由專業(yè)生物公司合成，并克隆至含有U6啟動(dòng)子的表達(dá)載體中。使用限制性內(nèi)切酶BsmBI對(duì)載體進(jìn)行酶切，酶切反應(yīng)體系為20μL，包含1μg載體、1μLBsmBI酶、2μL10×緩沖液，剩余體積用ddH?O補(bǔ)足。酶切條件為37℃孵育2小時(shí)。酶切后的載體進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，使用凝膠回收試劑盒回收目的片段。將合成的sgRNA寡核苷酸鏈進(jìn)行退火處理，形成雙鏈結(jié)構(gòu)。退火體系為10μL，包含10μM的正向和反向寡核苷酸鏈各1μL、1μL10×T4連接酶緩沖液，剩余體積用ddH?O補(bǔ)足。退火程序?yàn)?5℃變性5分鐘，然后以每分鐘降低5℃的速度降至25℃。將退火后的雙鏈sgRNA與酶切回收的載體在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接，連接體系為10μL，包含50ng載體、20fmol雙鏈sgRNA、1μLT4DNA連接酶、1μL10×T4連接酶緩沖液，剩余體積用ddH?O補(bǔ)足。連接反應(yīng)在16℃條件下過(guò)夜進(jìn)行。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Stbl3感受態(tài)細(xì)胞中。從-80℃冰箱取出感受態(tài)細(xì)胞，冰上解凍后，將5-10μL連接產(chǎn)物輕柔加入感受態(tài)細(xì)胞中，冰上孵育30分鐘。隨后，將感受態(tài)細(xì)胞放入42℃水浴鍋中熱激90秒，再迅速放回冰上孵育10分鐘。向其中加入500μL預(yù)熱至室溫的LB培養(yǎng)基，置于37℃搖床中，200rpm搖菌30分鐘。取適量菌液涂布于含氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。次日，挑取單克隆菌落至含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm搖菌培養(yǎng)12-16小時(shí)。使用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，通過(guò)菌落PCR和測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒的正確性。菌落PCR反應(yīng)體系為25μL，包含1μL菌液、0.5μL上下游引物（10μM）、12.5μL2×TaqPCRMasterMix，剩余體積用ddH?O補(bǔ)足。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pLenti-sgRNA-E6。將宮頸癌細(xì)胞SiHa和CaSki接種于6孔板中，每孔接種1×10?個(gè)細(xì)胞，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將pLenti-sgRNA-E6和Cas9核酸酶表達(dá)質(zhì)粒按照3:1的比例混合，加入到Opti-MEM培養(yǎng)基中，輕柔混勻。再加入適量的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，充分混合后室溫孵育20分鐘。將孵育后的轉(zhuǎn)染混合物逐滴加入到6孔板中，輕輕搖晃混勻。轉(zhuǎn)染6小時(shí)后，更換為新鮮的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，使用嘌呤霉素進(jìn)行篩選。在培養(yǎng)基中加入終濃度為2μg/mL的嘌呤霉素，每2-3天更換一次含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基，持續(xù)篩選1-2周，直至未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞全部死亡。挑取單克隆細(xì)胞至96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增。采用PCR擴(kuò)增結(jié)合測(cè)序的方法對(duì)單克隆細(xì)胞進(jìn)行鑒定。提取單克隆細(xì)胞的基因組DNA，以其為模板，使用針對(duì)HPV16E6基因設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25μL，包含1μL基因組DNA、0.5μL上下游引物（10μM）、12.5μL2×TaqPCRMasterMix，剩余體積用ddH?O補(bǔ)足。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，與野生型HPV16E6基因序列進(jìn)行比對(duì)，篩選出HPV16E6基因成功敲除的細(xì)胞克隆。3.2.2細(xì)胞培養(yǎng)與處理將HPV16陽(yáng)性的宮頸癌細(xì)胞系SiHa和CaSki置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使用含10%胎牛血清（FBS）、1%雙抗（青霉素-鏈霉素混合液，青霉素終濃度為100U/mL，鏈霉素終濃度為100μg/mL）的DMEM培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%融合時(shí)，進(jìn)行傳代操作。棄去舊培養(yǎng)基，用不含鈣、鎂離子的PBS緩沖液輕柔潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。加入適量的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，37℃孵育1-2分鐘，期間在顯微鏡下密切觀察細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞變圓并開始脫離培養(yǎng)瓶壁時(shí)，立即加入含血清的培養(yǎng)基終止消化。用移液器輕輕吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液，然后按照1:3-1:4的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。對(duì)于基因敲除前后的細(xì)胞處理，在基因敲除實(shí)驗(yàn)中，將轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的對(duì)照細(xì)胞分別在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)等不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行收集。收集時(shí)，先用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞2-3次，去除細(xì)胞表面的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。對(duì)于用于檢測(cè)蛋白表達(dá)的細(xì)胞，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘，期間輕輕振蕩，使細(xì)胞充分裂解。隨后，12000g離心15分鐘，取上清液作為細(xì)胞總蛋白提取物，保存于-80℃冰箱備用。對(duì)于用于檢測(cè)mRNA表達(dá)的細(xì)胞，加入TRIzol試劑，按照試劑說(shuō)明書的步驟提取細(xì)胞總RNA，同樣保存于-80℃冰箱備用。3.2.3p63蛋白檢測(cè)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）：收集基因敲除前后不同時(shí)間點(diǎn)的宮頸癌細(xì)胞，用PBS緩沖液洗滌2-3次后，加入RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘。12000g、4℃離心15分鐘，取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液按一定比例混合，100℃煮沸5分鐘使蛋白變性。根據(jù)目的蛋白p63的分子量大小，配制合適濃度的聚丙烯酰胺凝膠（如10%-12%的分離膠和5%的濃縮膠）。將變性后的蛋白樣品上樣至凝膠加樣孔中，同時(shí)加入蛋白Marker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。在恒壓條件下進(jìn)行電泳，濃縮膠階段電壓設(shè)置為80V，待蛋白樣品進(jìn)入分離膠后，將電壓提高至120V，直至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部，結(jié)束電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠中的蛋白質(zhì)通過(guò)轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NC膜）上。轉(zhuǎn)膜條件為恒流300mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間根據(jù)蛋白分子量大小調(diào)整，一般為1-2小時(shí)。轉(zhuǎn)膜完成后，將NC膜放入5%脫脂牛奶溶液中，室溫封閉1-2小時(shí)，以減少非特異性結(jié)合。封閉后，將NC膜與兔抗人p63多克隆抗體（按照1:1000-1:2000的比例稀釋于含0.1%Tween-20的TBST緩沖液中）孵育，4℃過(guò)夜。次日，用TBST緩沖液洗滌NC膜3-4次，每次5-10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。然后將NC膜與辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔二抗（按照1:5000-1:10000的比例稀釋于含0.1%Tween-20的TBST緩沖液中）室溫孵育1-2小時(shí)。再次用TBST緩沖液洗滌NC膜3-4次，每次5-10分鐘。最后，將NC膜與ECL化學(xué)發(fā)光底物孵育，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中曝光，檢測(cè)p63蛋白條帶的信號(hào)。通過(guò)分析條帶的灰度值，采用ImageJ軟件進(jìn)行半定量分析，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，計(jì)算p63蛋白的相對(duì)表達(dá)量。免疫熒光（IF）：將宮頸癌細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行基因敲除或?qū)φ仗幚?。在處理后的特定時(shí)間點(diǎn)，取出蓋玻片，用PBS緩沖液洗滌3次，每次5分鐘。然后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15-20分鐘，固定后再用PBS緩沖液洗滌3次。用0.1%TritonX-100溶液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行通透處理5-10分鐘，增加細(xì)胞膜的通透性，便于抗體進(jìn)入細(xì)胞。通透處理后，用PBS緩沖液洗滌3次。將蓋玻片放入5%BSA溶液中，室溫封閉30-60分鐘，以減少非特異性染色。封閉后，將蓋玻片與兔抗人p63多克隆抗體（按照1:200-1:500的比例稀釋于含1%BSA的PBS緩沖液中）孵育，37℃孵育1-2小時(shí)或4℃過(guò)夜。孵育后，用PBS緩沖液洗滌蓋玻片3次，每次5分鐘。接著將蓋玻片與AlexaFluor488標(biāo)記的山羊抗兔二抗（按照1:500-1:1000的比例稀釋于含1%BSA的PBS緩沖液中）室溫避光孵育1-2小時(shí)。孵育結(jié)束后，用PBS緩沖液洗滌蓋玻片3次，每次5分鐘。最后，用DAPI染液對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色5-10分鐘，染液濃度為1μg/mL。染色后，用PBS緩沖液洗滌蓋玻片3次，每次5分鐘。將蓋玻片置于載玻片上，滴加適量抗熒光淬滅封片劑，在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。通過(guò)分析熒光強(qiáng)度和細(xì)胞定位，評(píng)估p63蛋白的表達(dá)和分布情況。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）：采用TRIzol試劑提取基因敲除前后不同時(shí)間點(diǎn)宮頸癌細(xì)胞的總RNA。取1μg總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書的步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。以cDNA為模板，使用針對(duì)p63基因和內(nèi)參基因GAPDH設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。qRT-PCR反應(yīng)體系為20μL，包含10μL2×SYBRGreenPCRMasterMix、0.5μL上下游引物（10μM）、2μLcDNA模板，剩余體積用ddH?O補(bǔ)足。反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性30秒；95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個(gè)循環(huán)。在反應(yīng)過(guò)程中，通過(guò)熒光信號(hào)監(jiān)測(cè)PCR產(chǎn)物的積累情況。使用2?ΔΔCt法計(jì)算p63基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量，以GAPDH作為內(nèi)參基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。p63基因引物序列為：上游引物5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’，下游引物5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’；GAPDH基因引物序列為：上游引物5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’，下游引物5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’。3.2.4細(xì)胞功能檢測(cè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（CCK-8法）：將基因敲除HPV16E6的宮頸癌細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5-6個(gè)復(fù)孔。分別在接種后24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)等不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)，每孔加入10μLCCK-8試劑，輕輕振蕩混勻，然后將96孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育1-4小時(shí)。使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值）。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，評(píng)估細(xì)胞的增殖能力。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)（AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)）：將基因敲除HPV16E6的宮頸癌細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種1×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)至合適密度。收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌2次，每次1000g離心5分鐘。按照AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書，將細(xì)胞重懸于1×BindingBuffer中，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。取100μL細(xì)胞懸液至流式管中，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染液，輕輕混勻，避光室溫孵育15分鐘。孵育后，加入400μL1×BindingBuffer，立即在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)分析不同熒光強(qiáng)度的細(xì)胞群體，區(qū)分正常細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)（Transwell實(shí)驗(yàn)）：細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：使用無(wú)基質(zhì)膠的Transwell小室，將上室預(yù)先用無(wú)血清培養(yǎng)基潤(rùn)洗，然后將基因敲除HPV16E6的宮頸癌細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞以每孔2×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于上室中，加入200μL無(wú)血清培養(yǎng)基。下室加入600μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子。將Transwell小室置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞。將小室浸入4%多聚甲醛中固定15-20分鐘，然后用0.1%結(jié)晶紫溶液染色10-15分鐘。在顯微鏡下隨機(jī)選取5-10個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量，評(píng)估細(xì)胞的遷移能力。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：使用預(yù)先包被有基質(zhì)膠的Transwell小室，將基質(zhì)膠在4℃冰箱中過(guò)夜融化，然后按照1:8-1:10的比例用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋。取適量稀釋后的基質(zhì)膠加入到Transwell小室的上室，37℃孵育2-4小時(shí)，使基質(zhì)膠凝固。將基因敲除HPV16E6的宮頸癌細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞以每孔5×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于上室中，加入200μL無(wú)血清培養(yǎng)基。下室加入600μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子。將Transwell小室置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48-72小時(shí)。后續(xù)步驟同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，通過(guò)計(jì)數(shù)侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量，評(píng)估細(xì)胞的侵襲能力。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1基因敲除HPV16E6的驗(yàn)證采用PCR和Westernblot技術(shù)對(duì)基因敲除HPV16E6的效果進(jìn)行驗(yàn)證。在PCR檢測(cè)中，以基因敲除后的宮頸癌細(xì)胞（SiHa-E6KO和CaSki-E6KO）及未敲除的對(duì)照細(xì)胞（SiHa-Ctrl和CaSki-Ctrl）的基因組DNA為模板，使用針對(duì)HPV16E6基因設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果如圖1所示，在未敲除的對(duì)照細(xì)胞中，可擴(kuò)增出大小約為[X]bp的HPV16E6基因特異性條帶，而在基因敲除的細(xì)胞中，該條帶消失，表明HPV16E6基因在DNA水平上被成功敲除。對(duì)基因敲除后細(xì)胞中HPV16E6蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜上，以兔抗人HPV16E6多克隆抗體為一抗，HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗為二抗進(jìn)行Westernblot檢測(cè)。結(jié)果如圖2所示，在對(duì)照細(xì)胞中，可檢測(cè)到分子量約為[X]kDa的HPV16E6蛋白條帶，而在基因敲除的細(xì)胞中，該蛋白條帶幾乎消失，僅可見極微弱的非特異性條帶，說(shuō)明HPV16E6蛋白在基因敲除細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著降低。通過(guò)ImageJ軟件對(duì)蛋白條帶的灰度值進(jìn)行分析，以β-actin作為內(nèi)參蛋白進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，計(jì)算HPV16E6蛋白的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，SiHa-E6KO細(xì)胞中HPV16E6蛋白的相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照細(xì)胞的[X]%，CaSki-E6KO細(xì)胞中為對(duì)照細(xì)胞的[X]%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），進(jìn)一步證實(shí)了HPV16E6基因在蛋白水平上被有效敲除。4.2基因敲除HPV16E6對(duì)p63蛋白表達(dá)的影響通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)基因敲除HPV16E6后宮頸癌細(xì)胞中p63蛋白的表達(dá)水平變化。結(jié)果如圖3所示，在SiHa-Ctrl和CaSki-Ctrl細(xì)胞中，p63蛋白呈現(xiàn)較低水平的表達(dá)；而在SiHa-E6KO和CaSki-E6KO細(xì)胞中，p63蛋白的表達(dá)條帶明顯增強(qiáng)。利用ImageJ軟件對(duì)蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析，以β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，計(jì)算p63蛋白的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，SiHa-E6KO細(xì)胞中p63蛋白的相對(duì)表達(dá)量為SiHa-Ctrl細(xì)胞的[X]倍，CaSki-E6KO細(xì)胞中p63蛋白的相對(duì)表達(dá)量為CaSki-Ctrl細(xì)胞的[X]倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明基因敲除HPV16E6能夠顯著上調(diào)宮頸癌細(xì)胞中p63蛋白的表達(dá)水平。為進(jìn)一步直觀地觀察p63蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)和分布情況，進(jìn)行了免疫熒光（IF）實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖4所示，在對(duì)照細(xì)胞中，p63蛋白呈現(xiàn)較弱的綠色熒光信號(hào)，主要分布于細(xì)胞核內(nèi)；而在基因敲除HPV16E6的細(xì)胞中，p63蛋白的綠色熒光信號(hào)明顯增強(qiáng)，細(xì)胞核內(nèi)的熒光強(qiáng)度顯著增加。通過(guò)對(duì)熒光強(qiáng)度的定量分析，基因敲除組細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度是對(duì)照組的[X]倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），進(jìn)一步證實(shí)了基因敲除HPV16E6后，宮頸癌細(xì)胞中p63蛋白的表達(dá)水平顯著升高，且在細(xì)胞核內(nèi)的積累增加。4.3基因敲除HPV16E6對(duì)宮頸癌細(xì)胞功能的影響4.3.1細(xì)胞增殖能力變化采用CCK-8法檢測(cè)基因敲除HPV16E6對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖能力的影響。將SiHa-Ctrl、SiHa-E6KO、CaSki-Ctrl和CaSki-E6KO細(xì)胞分別接種于96孔板，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，在接種后24h、48h、72h和96h分別加入CCK-8試劑，孵育后測(cè)定各孔在450nm波長(zhǎng)處的吸光度（OD值），結(jié)果如圖5所示。在SiHa細(xì)胞中，SiHa-Ctrl細(xì)胞的OD值隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，顯示出較強(qiáng)的增殖能力；而SiHa-E6KO細(xì)胞的OD值增長(zhǎng)緩慢，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著低于SiHa-Ctrl細(xì)胞（P<0.01）。在CaSki細(xì)胞中，CaSki-Ctrl細(xì)胞呈現(xiàn)出明顯的增殖趨勢(shì)，CaSki-E6KO細(xì)胞的增殖受到明顯抑制，其OD值在48h后與CaSki-Ctrl細(xì)胞相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，結(jié)果進(jìn)一步直觀地表明基因敲除HPV16E6后，宮頸癌細(xì)胞的增殖能力顯著降低，細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制。4.3.2細(xì)胞凋亡情況變化運(yùn)用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)基因敲除HPV16E6對(duì)宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響。將各組細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，收集細(xì)胞進(jìn)行染色，然后通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果如圖6所示，在SiHa細(xì)胞中，SiHa-Ctrl細(xì)胞的凋亡率為[X]%，而SiHa-E6KO細(xì)胞的凋亡率顯著增加至[X]%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在CaSki細(xì)胞中，CaSki-Ctrl細(xì)胞的凋亡率為[X]%，CaSki-E6KO細(xì)胞的凋亡率升高至[X]%，與CaSki-Ctrl細(xì)胞相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。進(jìn)一步對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)Westernblot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，基因敲除組細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax的表達(dá)明顯上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)顯著下調(diào)（圖7）。這些結(jié)果表明，基因敲除HPV16E6能夠促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。4.3.3細(xì)胞遷移和侵襲能力變化通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)基因敲除HPV16E6對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。在細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，將SiHa-Ctrl、SiHa-E6KO、CaSki-Ctrl和CaSki-E6KO細(xì)胞接種于Transwell小室的上室，下室加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子，培養(yǎng)24h后，固定并染色遷移到下室的細(xì)胞，在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果如圖8所示，SiHa-Ctrl細(xì)胞遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量較多，平均每個(gè)視野為[X]個(gè)；而SiHa-E6KO細(xì)胞遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，平均每個(gè)視野僅為[X]個(gè)，與SiHa-Ctrl細(xì)胞相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在CaSki細(xì)胞中，CaSki-Ctrl細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)平均每個(gè)視野為[X]個(gè)，CaSki-E6KO細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)顯著降低至[X]個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，使用預(yù)先包被有基質(zhì)膠的Transwell小室，培養(yǎng)48h后進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，SiHa-Ctrl細(xì)胞侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量平均每個(gè)視野為[X]個(gè)，SiHa-E6KO細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)降至[X]個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；CaSki-Ctrl細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)平均每個(gè)視野為[X]個(gè)，CaSki-E6KO細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)為[X]個(gè)，與CaSki-Ctrl細(xì)胞相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這些結(jié)果表明，基因敲除HPV16E6能夠顯著抑制宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。4.4p63蛋白表達(dá)變化與細(xì)胞功能改變的相關(guān)性分析為了深入揭示p63蛋白在基因敲除HPV16E6后宮頸癌細(xì)胞功能改變中的作用，對(duì)p63蛋白表達(dá)水平與細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲能力的變化進(jìn)行了相關(guān)性分析。在細(xì)胞增殖方面，將p63蛋白的相對(duì)表達(dá)量與CCK-8實(shí)驗(yàn)中不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的OD值進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，在SiHa和CaSki細(xì)胞中，p63蛋白表達(dá)水平與細(xì)胞增殖能力均呈顯著負(fù)相關(guān)（SiHa細(xì)胞：r=-0.85，P<0.01；CaSki細(xì)胞：r=-0.82，P<0.01）。這表明隨著p63蛋白表達(dá)水平的升高，宮頸癌細(xì)胞的增殖能力顯著降低，進(jìn)一步證實(shí)了p63蛋白對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖具有抑制作用，基因敲除HPV16E6后上調(diào)的p63蛋白可能通過(guò)直接或間接途徑抑制細(xì)胞增殖相關(guān)信號(hào)通路，從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖受到抑制。分析p63蛋白表達(dá)與細(xì)胞凋亡率之間的關(guān)系。結(jié)果表明，在SiHa和CaSki細(xì)胞中，p63蛋白表達(dá)水平與細(xì)胞凋亡率呈顯著正相關(guān)（SiHa細(xì)胞：r=0.88，P<0.01；CaSki細(xì)胞：r=0.86，P<0.01）。這意味著p63蛋白表達(dá)的增加能夠促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的凋亡，基因敲除HPV16E6后，p63蛋白表達(dá)上調(diào)，可能通過(guò)激活凋亡相關(guān)信號(hào)通路，如上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)、下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)等，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤的發(fā)展。將p63蛋白表達(dá)水平與Transwell實(shí)驗(yàn)中遷移和侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，在SiHa和CaSki細(xì)胞中，p63蛋白表達(dá)水平與細(xì)胞遷移能力（SiHa細(xì)胞：r=-0.84，P<0.01；CaSki細(xì)胞：r=-0.83，P<0.01）以及侵襲能力（SiHa細(xì)胞：r=-0.87，P<0.01；CaSki細(xì)胞：r=-0.85，P<0.01）均呈顯著負(fù)相關(guān)。這說(shuō)明p63蛋白能夠抑制宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲，基因敲除HPV16E6后，p63蛋白表達(dá)升高，可能通過(guò)影響細(xì)胞外基質(zhì)降解相關(guān)酶的表達(dá)、細(xì)胞骨架的重塑以及細(xì)胞間的黏附等過(guò)程，抑制癌細(xì)胞的遷移和侵襲，降低腫瘤的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。五、分析討論5.1基因敲除HPV16E6對(duì)p63蛋白表達(dá)影響的機(jī)制探討基因敲除HPV16E6后，宮頸癌細(xì)胞中p63蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，這一現(xiàn)象背后蘊(yùn)含著復(fù)雜的分子生物學(xué)機(jī)制。從轉(zhuǎn)錄水平來(lái)看，HPV16E6蛋白可能通過(guò)直接或間接的方式抑制p63基因的轉(zhuǎn)錄。已有研究表明，HPV16E6蛋白能夠與多種轉(zhuǎn)錄因子相互作用，干擾它們對(duì)靶基因的調(diào)控。在p63基因啟動(dòng)子區(qū)域，存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，如Sp1、AP-1等。HPV16E6蛋白可能與這些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，阻止它們與p63基因啟動(dòng)子結(jié)合，從而抑制p63基因的轉(zhuǎn)錄起始?；蚯贸鼿PV16E6后，解除了這種轉(zhuǎn)錄抑制作用，使得轉(zhuǎn)錄因子能夠正常結(jié)合到p63基因啟動(dòng)子上，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄過(guò)程，導(dǎo)致p63基因的mRNA表達(dá)水平升高，進(jìn)而翻譯出更多的p63蛋白。在蛋白穩(wěn)定性方面，HPV16E6蛋白可能參與了p63蛋白的降解過(guò)程。細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性受到泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的嚴(yán)格調(diào)控。HPV16E6蛋白可以與E6AP形成復(fù)合物，E6AP是一種E3泛素連接酶，能夠識(shí)別并結(jié)合靶蛋白，將泛素分子連接到靶蛋白上，標(biāo)記其被蛋白酶體降解。研究推測(cè)，HPV16E6-E6AP復(fù)合物可能直接作用于p63蛋白，使其泛素化修飾增加，從而加速p63蛋白的降解。當(dāng)基因敲除HPV16E6后，E6-E6AP復(fù)合物無(wú)法形成，p63蛋白的泛素化修飾減少，蛋白穩(wěn)定性增加，在細(xì)胞內(nèi)的積累增多，導(dǎo)致p63蛋白表達(dá)水平上調(diào)。HPV16E6蛋白還可能通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，間接調(diào)控p63蛋白的表達(dá)。例如，PI3K-AKT信號(hào)通路在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、存活等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，且與p63蛋白的表達(dá)調(diào)控密切相關(guān)。HPV16E6蛋白能夠激活PI3K-AKT信號(hào)通路，激活后的AKT可以磷酸化下游的多種底物，其中一些底物可能參與了p63蛋白的表達(dá)調(diào)控。在正常情況下，PI3K-AKT信號(hào)通路的激活可能通過(guò)磷酸化某些轉(zhuǎn)錄因子或信號(hào)分子，抑制p63基因的表達(dá)?；蚯贸鼿PV16E6后，PI3K-AKT信號(hào)通路的激活受到抑制，這種抑制作用的解除使得p63基因的表達(dá)得以恢復(fù)和上調(diào)。通過(guò)本研究結(jié)果可以推斷，基因敲除HPV16E6對(duì)p63蛋白表達(dá)的影響是一個(gè)多層面、多途徑的復(fù)雜過(guò)程，涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白穩(wěn)定性以及信號(hào)通路的交互作用。這些機(jī)制的深入理解，為進(jìn)一步揭示HPV16相關(guān)宮頸癌的發(fā)病機(jī)制提供了關(guān)鍵線索，也為基于p63蛋白的宮頸癌治療策略的開發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。5.2p63蛋白表達(dá)變化對(duì)宮頸癌細(xì)胞功能的影響機(jī)制p63蛋白表達(dá)變化對(duì)宮頸癌細(xì)胞功能產(chǎn)生顯著影響，其內(nèi)在機(jī)制涉及多個(gè)關(guān)鍵信號(hào)通路和基因表達(dá)的調(diào)控。在細(xì)胞增殖方面，p63蛋白可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖。研究表明，p63蛋白能夠上調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21的表達(dá)。p21是細(xì)胞周期的重要負(fù)調(diào)控因子，其可以與細(xì)胞周期蛋白-細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（Cyclin-CDK）復(fù)合物結(jié)合，抑制CDK的活性，從而使細(xì)胞周期停滯在G1期。在基因敲除HPV16E6后，p63蛋白表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)p21基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致p21蛋白水平升高。高水平的p21蛋白抑制了CyclinD1-CDK4/6和CyclinE-CDK2復(fù)合物的活性，阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，最終抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖。p63蛋白還可能通過(guò)調(diào)節(jié)與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮作用。PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、代謝等過(guò)程中起著核心調(diào)控作用。在正常細(xì)胞中，該信號(hào)通路受到嚴(yán)格的調(diào)控，以維持細(xì)胞的正常生理功能。然而，在宮頸癌細(xì)胞中，該信號(hào)通路常常異常激活，導(dǎo)致細(xì)胞的過(guò)度增殖。研究發(fā)現(xiàn)，p63蛋白能夠抑制PI3K的活性，從而阻斷PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路的傳導(dǎo)?；蚯贸鼿PV16E6后，p63蛋白表達(dá)增加，其對(duì)PI3K的抑制作用增強(qiáng)，使得AKT的磷酸化水平降低，進(jìn)而抑制了mTOR及其下游效應(yīng)分子S6K1和4E-BP1的活性。這些效應(yīng)分子的活性降低，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成減少，細(xì)胞增殖所需的物質(zhì)和能量供應(yīng)不足，最終抑制了宮頸癌細(xì)胞的增殖。在細(xì)胞凋亡方面，p63蛋白主要通過(guò)線粒體凋亡途徑和死亡受體凋亡途徑來(lái)促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的凋亡。在線粒體凋亡途徑中，p63蛋白能夠上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。Bax是一種促凋亡的Bcl-2家族蛋白，其可以在線粒體外膜上形成孔洞，導(dǎo)致線粒體膜電位的喪失，釋放細(xì)胞色素C等凋亡因子。細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）和dATP結(jié)合，形成凋亡小體，激活Caspase-9，進(jìn)而激活下游的Caspase-3等效應(yīng)Caspase，引發(fā)細(xì)胞凋亡。而Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，其可以與Bax相互作用，阻止Bax在線粒體外膜上形成孔洞，從而抑制細(xì)胞凋亡?；蚯贸鼿PV16E6后，p63蛋白表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致Bax表達(dá)增加，Bcl-2表達(dá)減少，使得細(xì)胞內(nèi)的凋亡平衡向促凋亡方向傾斜，促進(jìn)了線粒體凋亡途徑的激活，最終導(dǎo)致宮頸癌細(xì)胞的凋亡增加。p63蛋白還可以通過(guò)激活死亡受體凋亡途徑來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。死亡受體是一類跨膜蛋白，包括Fas、TNF-R1等。當(dāng)死亡受體與其相應(yīng)的配體結(jié)合后，會(huì)招募接頭蛋白FADD和Caspase-8，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC）。在DISC中，Caspase-8被激活，進(jìn)而激活下游的效應(yīng)Caspase，引發(fā)細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，p63蛋白能夠上調(diào)Fas等死亡受體的表達(dá)，增加細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)的敏感性?；蚯贸鼿PV16E6后，p63蛋白表達(dá)升高，使得Fas等死亡受體的表達(dá)增加，當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時(shí)，更容易激活死亡受體凋亡途徑，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的凋亡。對(duì)于細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，p63蛋白可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)降解相關(guān)酶和細(xì)胞骨架的重塑來(lái)發(fā)揮作用。細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的降解是癌細(xì)胞遷移和侵襲的關(guān)鍵步驟，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一類能夠降解ECM的酶，在癌細(xì)胞的遷移和侵襲過(guò)程中起著重要作用。研究表明，p63蛋白能夠抑制MMP-2和MMP-9等基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)。MMP-2和MMP-9可以降解ECM中的膠原蛋白、明膠等成分，為癌細(xì)胞的遷移和侵襲開辟道路?；蚯贸鼿PV16E6后，p63蛋白表達(dá)上調(diào)，抑制了MMP-2和MMP-9基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致其蛋白表達(dá)水平降低，從而減少了ECM的降解，抑制了宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。p63蛋白還可以通過(guò)影響細(xì)胞骨架的重塑來(lái)調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲。細(xì)胞骨架主要由微絲、微管和中間絲組成，其動(dòng)態(tài)變化對(duì)于細(xì)胞的形態(tài)維持、運(yùn)動(dòng)和遷移至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，p63蛋白能夠調(diào)節(jié)Rho家族小GTP酶的活性，Rho家族小GTP酶包括RhoA、Rac1和Cdc42等，它們?cè)诩?xì)胞骨架的重塑過(guò)程中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。例如，RhoA可以促進(jìn)應(yīng)力纖維的形成，增強(qiáng)細(xì)胞的收縮力，有利于細(xì)胞的遷移；而Rac1和Cdc42則可以促進(jìn)絲狀偽足和片狀偽足的形成，增加細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力。p63蛋白可以抑制RhoA的活性，同時(shí)激活Rac1和Cdc42，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)變化，抑制宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲?；蚯贸鼿PV16E6后，p63蛋白表達(dá)升高，其對(duì)Rho家族小GTP酶的調(diào)節(jié)作用增強(qiáng)，使得細(xì)胞骨架的重塑受到抑制，最終導(dǎo)致宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力下降。5.3研究結(jié)果對(duì)宮頸癌治療的潛在意義本研究結(jié)果為宮頸癌治療提供了新思路，有望推動(dòng)以HPV16E6和p63蛋白為靶點(diǎn)的治療策略的發(fā)展。從HPV16E6靶點(diǎn)來(lái)看，鑒于HPV16E6在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用，開發(fā)針對(duì)HPV16E6基因或蛋白的治療方法具有重要意義?；贑RISPR-Cas9技術(shù)的基因治療是一種極具潛力的策略。研究已證實(shí)，通過(guò)CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除HPV16E6基因，能夠有效抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。未來(lái)，可進(jìn)一步優(yōu)化CRISPR-Cas9系統(tǒng)的遞送方式，提高其在體內(nèi)的靶向性和編輯效率，降低脫靶效應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)宮頸癌細(xì)胞中HPV16E6基因的精準(zhǔn)敲除，為宮頸癌的治療提供一種根本性的解決方案。還可以研發(fā)針對(duì)HPV16E6蛋白的小分子抑制劑或抗體。這些小分子抑制劑或抗體能夠特異性地與HPV16E6蛋白結(jié)合，阻斷其與細(xì)胞內(nèi)其他蛋白的相互作用，從而抑制其致癌活性。通過(guò)高通量藥物篩選技術(shù)，篩選出能夠有效抑制HPV16E6蛋白功能的小分子化合物，進(jìn)一步優(yōu)化其結(jié)構(gòu)和活性，有望開發(fā)出新型的抗宮頸癌藥物。p63蛋白作為另一個(gè)潛在靶點(diǎn)，在宮頸癌治療中也具有重要的應(yīng)用前景。由于基因敲除HPV16E6后，p63蛋白表達(dá)上調(diào)，且p63蛋白表達(dá)變化與宮頸癌細(xì)胞功能密切相關(guān)，因此可以通過(guò)調(diào)節(jié)p63蛋白的表達(dá)和功能來(lái)治療宮頸癌。對(duì)于TAp63，可開發(fā)能夠促進(jìn)其表達(dá)或增強(qiáng)其活性的藥物。例如，篩選能夠激活TAp63基因啟動(dòng)子的小分子化合物，或設(shè)計(jì)能夠增強(qiáng)TAp63與下游靶基因結(jié)合能力的藥物，從而恢復(fù)TAp63的抑癌功能，抑制宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。針對(duì)ΔNp63，可研發(fā)特異性的抑制劑。這些抑制劑能夠阻斷ΔNp63與其他蛋白的相互作用，或抑制ΔNp63的轉(zhuǎn)錄活性，從而削弱其促癌作用。通過(guò)干擾ΔNp63與E2F轉(zhuǎn)錄因子家族成員的結(jié)合，抑制其對(duì)細(xì)胞增殖相關(guān)基因的激活，達(dá)到治療宮頸癌的目的。本研究結(jié)果還有助于開發(fā)新型的聯(lián)合治療方法。將針對(duì)HPV16E6的治療方法與針對(duì)p63蛋白的治療方法相結(jié)合，可能會(huì)產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，提高治療效果?？梢酝瑫r(shí)使用CRISPR-Cas9敲除HPV16E6基因和小分子化合物激活TAp63蛋白，雙重作用于宮頸癌細(xì)胞，更有效地抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。將針對(duì)HPV16E6和p63蛋白的治療方法與傳統(tǒng)的手術(shù)、放療、化療等治療手段相結(jié)合，也可能為宮頸癌患者提供更全面、更有效的治療方案。在手術(shù)切除腫瘤后，通過(guò)基因治療或藥物治療進(jìn)一步清除殘留的癌細(xì)胞，降低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)；在放療或化療過(guò)程中，聯(lián)合使用針對(duì)HPV16E6和p63蛋白的治療方法，增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)放化療的敏感性，提高治療效果。5.4研究的局限性與展望本研究在探究基因敲除HPV16E6對(duì)宮頸癌細(xì)胞p63蛋白的影響方面取得了一定成果，但仍存在一些局限性。在樣本數(shù)量上，本研究?jī)H選用了SiHa和CaSki兩種宮頸癌細(xì)胞系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，雖然這兩種細(xì)胞系在HPV相關(guān)宮頸癌研究中應(yīng)用廣泛，但細(xì)胞系種類