基因編輯驅(qū)動不結(jié)球白菜紫色新種質(zhì)創(chuàng)制：技術(shù)與機理的深度探索一、引言1.1研究背景不結(jié)球白菜（Brassicarapassp.chinensis）作為十字花科蕓薹屬蕓薹種的重要亞種，在我國蔬菜產(chǎn)業(yè)中占據(jù)著舉足輕重的地位。其起源于中國，栽培歷史源遠(yuǎn)流長，憑借著種質(zhì)資源豐富、生長周期短、單位面積產(chǎn)量高以及易栽培等諸多優(yōu)勢，在我國中部及以南地區(qū)實現(xiàn)了周年栽培種植，是當(dāng)?shù)鼐用袢粘ｏ嬍持胁豢苫蛉钡氖卟似贩N，在2021年，其全國栽培面積已達(dá)133.33萬hm2，較2005年大幅提高了2.5倍，充分彰顯了其在蔬菜周年供應(yīng)體系中的關(guān)鍵作用。紫色不結(jié)球白菜因葉片中大量積累花青素而呈現(xiàn)獨特的紫紅色，不僅葉色靚麗，極具觀賞價值，還富含具有多種保健功能的花青苷?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，花青苷具有卓越的抗氧化、降血脂、降血糖以及抗癌等功效，對人體健康大有裨益。如紫色不結(jié)球白菜能夠有效抑制脂肪肝，減少脂肪在心、肝、腎和消化器官中的異常積累，進(jìn)而降低體重，對維持人體代謝平衡發(fā)揮著積極作用。然而，在實際的生長過程中，紫色不結(jié)球白菜常常受到弱光、高溫等極端氣候條件的顯著影響，導(dǎo)致出現(xiàn)著色不佳的現(xiàn)象，極大地影響了其商品價值和觀賞價值，限制了其在市場上的推廣和應(yīng)用?；蚓庉嫾夹g(shù)作為一種新興的生物技術(shù)，能夠?qū)ι矬w基因組進(jìn)行精確修飾，為不結(jié)球白菜的種質(zhì)創(chuàng)新開辟了全新的路徑。通過基因編輯技術(shù)，科研人員可以針對不結(jié)球白菜的特定基因進(jìn)行精準(zhǔn)操作，實現(xiàn)對其農(nóng)藝性狀、品質(zhì)性狀以及抗逆性狀等重要性狀的定向改良。這不僅有助于突破傳統(tǒng)育種方法的諸多局限，如育種周期長、效率低、難以實現(xiàn)精準(zhǔn)改良等問題，還能夠極大地加速不結(jié)球白菜新品種的培育進(jìn)程，為滿足市場對高品質(zhì)、多樣化不結(jié)球白菜品種的需求提供了有力的技術(shù)支撐。例如，在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)白菜系統(tǒng)生物學(xué)實驗室的研究中，利用發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)共表達(dá)ZmWUS2-IPT-AtPLT5三個基因，結(jié)合可視化標(biāo)記RUBY的篩選和CRISPR/Cas9系統(tǒng)，成功在白菜中建立了一種無基因型限制的、簡單高效的遺傳轉(zhuǎn)化和基因編輯系統(tǒng)。該系統(tǒng)能夠在3個月內(nèi)完成從種子萌發(fā)到愈傷組織誘導(dǎo)、芽再生和生根的整個過程，克服了白菜品種遺傳轉(zhuǎn)化的基因型依賴性，為白菜及蕓薹屬蔬菜作物的功能基因組學(xué)研究、基因編輯和種質(zhì)創(chuàng)新提供了關(guān)鍵的底盤技術(shù)。在這樣的研究背景下，開展利用基因編輯創(chuàng)制不結(jié)球白菜紫色新種質(zhì)技術(shù)的研究具有極其重要的理論意義和實踐價值。一方面，深入探究紫色不結(jié)球白菜花青素合成的分子機制，能夠為基因編輯技術(shù)在不結(jié)球白菜種質(zhì)創(chuàng)新中的應(yīng)用提供堅實的理論基礎(chǔ)；另一方面，通過建立高效的基因編輯技術(shù)體系，創(chuàng)制出穩(wěn)定遺傳、色澤鮮艷的紫色不結(jié)球白菜新種質(zhì)，不僅能夠豐富不結(jié)球白菜的種質(zhì)資源，滿足市場對特色蔬菜品種的需求，還能夠為不結(jié)球白菜的遺傳改良和品種選育提供全新的材料和方法，推動不結(jié)球白菜產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展。1.2研究目的與意義本研究旨在利用基因編輯技術(shù)，對不結(jié)球白菜花青素合成相關(guān)基因進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)控，創(chuàng)建穩(wěn)定遺傳、色澤鮮艷的紫色不結(jié)球白菜新種質(zhì)。通過該研究，一方面能夠深入解析紫色不結(jié)球白菜花青素合成的分子機制，為基因編輯技術(shù)在不結(jié)球白菜種質(zhì)創(chuàng)新中的應(yīng)用提供堅實的理論基礎(chǔ)；另一方面，所創(chuàng)制的紫色不結(jié)球白菜新種質(zhì)，不僅能夠豐富不結(jié)球白菜的種質(zhì)資源，滿足市場對特色蔬菜品種的需求，還能為不結(jié)球白菜的遺傳改良和品種選育提供全新的材料和方法，推動不結(jié)球白菜產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展。同時，本研究也將為其他蔬菜作物的基因編輯和種質(zhì)創(chuàng)新提供有益的參考和借鑒。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在不結(jié)球白菜紫色性狀遺傳研究方面，國內(nèi)外學(xué)者已取得了一定的成果。朱紅芳等研究發(fā)現(xiàn)，不結(jié)球白菜葉片的紫色對綠色為顯性，紫色性狀是母性遺傳，受主基因+多基因控制，環(huán)境條件，尤其是光照和溫度會影響紫色性狀。許玉超等利用同源克隆的方法獲得了1個紫色不結(jié)球白菜花色苷合成的關(guān)鍵基因BrcANS，該基因正調(diào)控葉片總花色苷含量。董慧杰利用不結(jié)球白菜深紫色葉自交系NJZX1-3及其綠色突變體NJZX1-0和淺紫色自交系NJZX1-1為材料，克隆得到了與花青苷代謝相關(guān)的關(guān)鍵基因BrcF3H、BrcLBD39和BrcLBD38，定量PCR結(jié)果表明，BrcF3H酶是一種非光依賴型酶，花青苷負(fù)調(diào)控基因BrcLBD39既響應(yīng)外源6-BA又與葉片中花青苷的積累密切相關(guān)，在花青苷的生物合成過程中起著重要的調(diào)控作用。在基因編輯技術(shù)應(yīng)用方面，近年來，隨著基因編輯技術(shù)的飛速發(fā)展，其在不結(jié)球白菜中的應(yīng)用也逐漸受到關(guān)注。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)白菜系統(tǒng)生物學(xué)實驗室利用發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)共表達(dá)ZmWUS2-IPT-AtPLT5三個基因，結(jié)合可視化標(biāo)記RUBY的篩選和CRISPR/Cas9系統(tǒng)，成功在白菜中建立了一種無基因型限制的、簡單高效的遺傳轉(zhuǎn)化和基因編輯系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠在3個月內(nèi)完成從種子萌發(fā)到愈傷組織誘導(dǎo)、芽再生和生根的整個過程，克服了白菜品種遺傳轉(zhuǎn)化的基因型依賴性，為白菜及蕓薹屬蔬菜作物的功能基因組學(xué)研究、基因編輯和種質(zhì)創(chuàng)新提供了關(guān)鍵的底盤技術(shù)。在棉花上，使用fe3o4磁性納米顆粒作為新材料，以靜電吸附作用與帶負(fù)電的外源質(zhì)粒相結(jié)合，形成磁性納米顆粒/dna復(fù)合物，在磁場下使復(fù)合物通過花粉表面的孔穴進(jìn)入花粉，再通過人工授粉實現(xiàn)外源基因的導(dǎo)入與轉(zhuǎn)化，利用整體植株的生殖細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，可直接收獲轉(zhuǎn)基因種子，并可針對性地對轉(zhuǎn)基因植株的目標(biāo)性狀定向篩選，能夠與轉(zhuǎn)基因育種直接結(jié)合，從而提高目的基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，縮短育種周期，這對于發(fā)展不結(jié)球白菜單倍體育種技術(shù)結(jié)合基因編輯技術(shù)、加速新種質(zhì)材料的大規(guī)模制備和優(yōu)良新品種的培育進(jìn)程具有重要的參考價值。然而，目前基因編輯技術(shù)在不結(jié)球白菜紫色新種質(zhì)創(chuàng)制方面的研究仍相對較少，還有很大的發(fā)展空間。二、不結(jié)球白菜紫色性狀的遺傳基礎(chǔ)與分子機制2.1紫色性狀的遺傳規(guī)律在不結(jié)球白菜中，紫色性狀的遺傳規(guī)律較為復(fù)雜。朱紅芳等學(xué)者通過構(gòu)建P1、P2、F1、BC1、BC2和F2六個世代群體，并進(jìn)行孟德爾遺傳規(guī)律分析，發(fā)現(xiàn)F1群體的葉片均表現(xiàn)為紫色，然而其紫色程度略淺于親本，且缺乏光澤，由此判斷紫色對綠色為不完全顯性。這一結(jié)論表明，紫色性狀在遺傳過程中并非簡單的顯性遺傳，而是受到多種因素的共同作用。由于紫色的呈色主要取決于花青素含量的高低，研究人員以這六個世代群體單株的花青素含量為特性，采用多世代聯(lián)合分離分析方法深入研究花青素含量的遺傳規(guī)律。結(jié)果顯示，不結(jié)球白菜雜交組合后代的花青素相對含量介于兩個親本之間，呈現(xiàn)出偏向紫色親本的偏態(tài)分布。進(jìn)一步的遺傳模型分析表明，其符合兩對加性-顯性-上位性主基因十加性-顯性-上位性多基因模型，即E-0模型。在該模型中，F(xiàn)2和BC1（F1×紫）的兩對主基因的遺傳率分別為59.17%和74.12%，這意味著主基因在花青素含量的遺傳中起到了重要作用，對花青素含量的遺傳變異有著較大的貢獻(xiàn)。而F2的多基因遺傳率為27.58%，說明多基因也在一定程度上影響著花青素含量的遺傳。此外，環(huán)境方差占表型方差的比例為19.48%，這充分表明環(huán)境因素對不結(jié)球白菜花青素含量的表現(xiàn)具有不可忽視的影響。在實際的生長過程中，環(huán)境條件如光照、溫度、土壤肥力等的變化，都可能導(dǎo)致花青素含量的波動，進(jìn)而影響不結(jié)球白菜葉片的紫色表現(xiàn)。2.2花青素合成相關(guān)基因2.2.1關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因花青素的合成是一個復(fù)雜的酶促反應(yīng)過程，涉及一系列關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因，這些基因編碼的酶在花青素合成途徑的不同階段發(fā)揮著不可或缺的作用。在花青素合成的起始階段，苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶（PAL）的催化下，轉(zhuǎn)化為反式肉桂酸，這是花青素合成的第一步，PAL基因的表達(dá)水平直接影響著花青素合成的起始速率。隨后，反式肉桂酸在肉桂酸-4-羥化酶（C4H）和4-香豆酸輔酶A連接酶（4CL）的作用下，逐步轉(zhuǎn)化為4-香豆酰輔酶A。查爾酮合酶（CHS）是花青素合成途徑中的關(guān)鍵酶之一，它能夠催化3分子的丙二酰輔酶A和1分子的4-香豆酰輔酶A發(fā)生縮合反應(yīng)，生成柚皮素查爾酮，這一反應(yīng)標(biāo)志著花青素合成進(jìn)入了類黃酮合成階段。查爾酮異構(gòu)酶（CHI）則可將柚皮素查爾酮異構(gòu)化為柚皮素，為后續(xù)的反應(yīng)提供底物。黃酮-3-羥化酶（F3H）能催化柚皮素的B環(huán)3位羥基化，生成二氫山奈酚，進(jìn)一步豐富了類黃酮的結(jié)構(gòu)多樣性。在花青素合成的后期，二氫黃酮醇-4-還原酶（DFR）起著至關(guān)重要的作用，它可以將二氫黃酮醇還原為無色花青素，為花青素的最終合成奠定基礎(chǔ)。無色花青素在花青素合成酶（ANS）的催化下，氧化生成花青素，這是花青素合成的關(guān)鍵步驟。UDP-葡萄糖：類黃酮-3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（UFGT）則能將葡萄糖基轉(zhuǎn)移到花青素上，形成穩(wěn)定的花青苷，增強花青素的穩(wěn)定性和溶解性，使其能夠在植物細(xì)胞中積累和發(fā)揮作用。在紫色不結(jié)球白菜中，這些關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)水平與花青素的積累密切相關(guān)。當(dāng)不結(jié)球白菜處于低溫環(huán)境時，CHS、F3H、DFR和ANS等基因的表達(dá)顯著上調(diào)，從而促進(jìn)花青素的合成，使葉片顏色加深。而在高溫或弱光條件下，這些基因的表達(dá)受到抑制，花青素合成減少，葉片顏色變淺甚至出現(xiàn)返青現(xiàn)象。例如，研究人員對不同光照條件下的紫色不結(jié)球白菜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)遮光處理后，CHI、CHS、F3H、DFR等花青素合成關(guān)鍵酶的活性顯著下降，導(dǎo)致花青素含量降低，葉片顏色由紫色變?yōu)榫G色。這充分表明，這些關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因在紫色不結(jié)球白菜花青素合成過程中起著核心作用，它們的表達(dá)變化直接影響著花青素的合成與積累，進(jìn)而決定了葉片的紫色表現(xiàn)。2.2.2轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子花青素合成途徑不僅受到關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因的調(diào)控，還受到多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的精細(xì)調(diào)節(jié)，其中MYB、bHLH等轉(zhuǎn)錄因子在這一過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。MYB轉(zhuǎn)錄因子家族是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，在花青素合成調(diào)控中占據(jù)著核心地位。在擬南芥中，R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子AtMYB75、AtMYB90、AtMYB113和AtMYB114等能夠特異性地結(jié)合到花青素合成晚期結(jié)構(gòu)基因（如DFR、ANS、UFGT等）的啟動子區(qū)域，激活這些基因的表達(dá)，從而促進(jìn)花青素的合成與積累。在蘋果中，MdMYB1基因通過調(diào)控花青素合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，對蘋果果實的著色過程起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。在紫色不結(jié)球白菜中，也存在著類似的MYB轉(zhuǎn)錄因子，它們通過與花青素合成結(jié)構(gòu)基因的啟動子區(qū)域相互作用，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而影響花青素的合成。例如，研究發(fā)現(xiàn)某些MYB轉(zhuǎn)錄因子在紫色不結(jié)球白菜葉片中的表達(dá)水平與花青素含量呈正相關(guān)，當(dāng)這些MYB轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)受到抑制時，花青素合成減少，葉片顏色變淺。bHLH（basichelix-loop-helix）轉(zhuǎn)錄因子也是花青素合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要組成部分。bHLH轉(zhuǎn)錄因子含有保守的堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域，能夠與DNA結(jié)合并調(diào)控基因的表達(dá)。在植物中，bHLH轉(zhuǎn)錄因子通常與MYB轉(zhuǎn)錄因子相互作用，形成MYB-bHLH蛋白復(fù)合體，共同調(diào)控花青素合成相關(guān)基因的表達(dá)。在矮牽牛中，bHLH轉(zhuǎn)錄因子An1和An11與MYB轉(zhuǎn)錄因子PhMYB4相互作用，激活花青素合成基因的表達(dá)，促進(jìn)花青素的積累。在紫色不結(jié)球白菜中，bHLH轉(zhuǎn)錄因子可能通過與MYB轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合體，協(xié)同調(diào)控花青素合成途徑中結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，影響花青素的合成與積累。研究表明，當(dāng)bHLH轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)發(fā)生變化時，會影響MYB-bHLH復(fù)合體的形成，進(jìn)而影響花青素合成相關(guān)基因的表達(dá)和花青素的含量。除了MYB和bHLH轉(zhuǎn)錄因子外，其他轉(zhuǎn)錄因子如WD40等也參與了花青素合成的調(diào)控過程。WD40蛋白含有多個WD40重復(fù)結(jié)構(gòu)域，能夠與MYB和bHLH轉(zhuǎn)錄因子相互作用，形成MYB-bHLH-WD40（MBW）復(fù)合體，增強MYB和bHLH轉(zhuǎn)錄因子對花青素合成基因的調(diào)控作用。在擬南芥中，WD40蛋白TTG1與MYB轉(zhuǎn)錄因子PAP1和bHLH轉(zhuǎn)錄因子GL3相互作用，形成MBW復(fù)合體，激活花青素合成相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)花青素的積累。在紫色不結(jié)球白菜中，WD40蛋白可能通過與MYB和bHLH轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用，參與花青素合成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，影響葉片的紫色性狀。這些轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子之間相互作用、協(xié)同調(diào)控，形成了一個復(fù)雜而精細(xì)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)節(jié)著紫色不結(jié)球白菜花青素合成相關(guān)基因的表達(dá)，從而決定了花青素的合成與積累，最終影響著葉片的紫色表現(xiàn)。2.3環(huán)境因素對紫色性狀的影響2.3.1光照光照作為影響植物生長發(fā)育的關(guān)鍵環(huán)境因素之一，對紫色不結(jié)球白菜花青素的合成和積累起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用。在光照強度方面，研究表明，適度的強光能夠顯著促進(jìn)紫色不結(jié)球白菜花青素的合成與積累。當(dāng)紫色不結(jié)球白菜處于強光環(huán)境下時，光信號通過光受體（如光敏色素、隱花色素等）被感知，進(jìn)而激活一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，最終促進(jìn)花青素合成相關(guān)基因的表達(dá)。例如，在一項研究中，將紫色不結(jié)球白菜分別置于不同光照強度下處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著光照強度的增加，花青素合成關(guān)鍵基因CHS、F3H、DFR和ANS的表達(dá)水平顯著上調(diào)，花青素含量也隨之增加，葉片顏色變得更加鮮艷。這是因為強光能夠誘導(dǎo)MYB、bHLH等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，這些轉(zhuǎn)錄因子與花青素合成基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，激活基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)花青素的合成。然而，當(dāng)光照強度過強時，反而會對紫色不結(jié)球白菜花青素的合成產(chǎn)生抑制作用。這是因為過強的光照會導(dǎo)致植物體內(nèi)產(chǎn)生過多的活性氧（ROS），如超氧陰離子（O2-）、過氧化氫（H2O2）和羥自由基（?OH）等，這些ROS會對植物細(xì)胞造成氧化損傷，破壞花青素合成相關(guān)酶的活性和基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，在高光脅迫下，紫色不結(jié)球白菜葉片中的丙二醛（MDA）含量顯著增加，表明細(xì)胞膜受到了氧化損傷，同時花青素合成關(guān)鍵酶的活性下降，花青素含量降低。光照時間對紫色不結(jié)球白菜花青素的合成也有著重要影響。延長光照時間能夠促進(jìn)花青素的積累，使葉片顏色加深。在長日照條件下，紫色不結(jié)球白菜花青素合成相關(guān)基因的表達(dá)持續(xù)增強，從而有利于花青素的合成與積累。例如，通過人工延長光照時間，發(fā)現(xiàn)紫色不結(jié)球白菜葉片中的花青素含量明顯高于正常光照時間下的植株。這可能是因為長日照條件下，植物體內(nèi)的生物鐘系統(tǒng)被調(diào)節(jié)，促進(jìn)了花青素合成相關(guān)基因的表達(dá)。相反，縮短光照時間則會抑制花青素的合成，導(dǎo)致葉片顏色變淺。在短日照條件下，紫色不結(jié)球白菜花青素合成相關(guān)基因的表達(dá)受到抑制，花青素合成減少。研究表明，當(dāng)紫色不結(jié)球白菜處于短日照環(huán)境中時，CHS、F3H等基因的表達(dá)水平顯著下降，花青素含量降低，葉片顏色逐漸變綠。光照強度和時間還會通過影響植物的光合作用和碳水化合物代謝，間接影響花青素的合成。充足的光照能夠提高植物的光合作用效率，增加碳水化合物的合成和積累，為花青素的合成提供充足的底物和能量。而光照不足則會導(dǎo)致光合作用減弱，碳水化合物供應(yīng)不足，從而限制花青素的合成。當(dāng)紫色不結(jié)球白菜處于弱光環(huán)境下時，其凈光合速率下降，碳水化合物含量減少，花青素合成也受到抑制。光照作為一個復(fù)雜的環(huán)境信號，通過多種途徑影響紫色不結(jié)球白菜花青素的合成和積累，在紫色不結(jié)球白菜的栽培過程中，合理調(diào)控光照強度和時間，對于提高花青素含量和改善紫色性狀具有重要意義。2.3.2溫度溫度是影響紫色不結(jié)球白菜生長發(fā)育和花青素合成的另一個重要環(huán)境因素，其變化能夠顯著影響花青素合成相關(guān)基因的表達(dá)和花青素含量。低溫環(huán)境對紫色不結(jié)球白菜花青素的合成具有明顯的促進(jìn)作用。當(dāng)紫色不結(jié)球白菜處于低溫條件下時，葉片中的花青素含量會顯著增加，葉片顏色逐漸變?yōu)樯钭仙Ｑ芯堪l(fā)現(xiàn)，在5℃的低溫處理下，紫色不結(jié)球白菜葉片中的花青素含量較常溫（20℃）下增加了數(shù)倍。這是因為低溫能夠誘導(dǎo)花青素合成相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)花青素的合成。在低溫處理下，PAL、CHS、F3H、DFR和ANS等花青素合成關(guān)鍵基因的表達(dá)水平顯著上調(diào)，從而加速了花青素的合成進(jìn)程。低溫還能夠影響MYB、bHLH等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)和活性，進(jìn)而調(diào)控花青素合成相關(guān)基因的表達(dá)。有研究表明，低溫處理能夠誘導(dǎo)MYB轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，使其與花青素合成基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，增強基因的轉(zhuǎn)錄活性。低溫還可能通過影響bHLH轉(zhuǎn)錄因子與MYB轉(zhuǎn)錄因子的相互作用，調(diào)節(jié)花青素合成基因的表達(dá)。高溫環(huán)境則會抑制紫色不結(jié)球白菜花青素的合成。在高溫條件下，紫色不結(jié)球白菜葉片中的花青素含量會逐漸降低，葉片顏色變淺甚至返青。當(dāng)溫度升高到35℃時，紫色不結(jié)球白菜葉片中的花青素含量明顯下降，葉片顏色由紫色變?yōu)榫G色。這是因為高溫會抑制花青素合成相關(guān)基因的表達(dá)，降低花青素合成關(guān)鍵酶的活性。研究發(fā)現(xiàn)，高溫處理下，PAL、CHS、F3H等基因的表達(dá)水平顯著下調(diào)，花青素合成關(guān)鍵酶的活性也明顯降低，從而阻礙了花青素的合成。高溫還可能通過影響植物體內(nèi)的激素平衡和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，間接影響花青素的合成。高溫會導(dǎo)致植物體內(nèi)的脫落酸（ABA）含量降低，而ABA在花青素合成過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。ABA能夠誘導(dǎo)花青素合成相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)花青素的合成。因此，高溫導(dǎo)致ABA含量降低，可能會抑制花青素的合成。溫度對紫色不結(jié)球白菜花青素合成的影響還具有時效性。在低溫處理初期，花青素含量的增加較為緩慢，隨著處理時間的延長，花青素含量逐漸增加。而在高溫處理下，花青素含量的降低也需要一定的時間。研究表明，低溫處理10天后，紫色不結(jié)球白菜葉片中的花青素含量才會顯著增加；而高溫處理15天后，花青素含量才會明顯降低。溫度通過影響花青素合成相關(guān)基因的表達(dá)、轉(zhuǎn)錄因子的活性以及植物體內(nèi)的激素平衡和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，對紫色不結(jié)球白菜花青素的合成和積累產(chǎn)生重要影響。在紫色不結(jié)球白菜的栽培過程中，合理控制溫度，避免高溫脅迫，創(chuàng)造適宜的低溫環(huán)境，對于提高花青素含量和保持紫色性狀具有重要意義。三、基因編輯技術(shù)原理與在不結(jié)球白菜中的應(yīng)用潛力3.1基因編輯技術(shù)概述基因編輯技術(shù)作為現(xiàn)代生物技術(shù)領(lǐng)域的重要突破，為生物遺傳改良和功能研究提供了強大的工具。它能夠在基因組水平上對特定基因進(jìn)行精確修飾，實現(xiàn)基因的敲除、插入、替換等操作，從而定向改變生物體的遺傳性狀。這一技術(shù)的出現(xiàn)，極大地推動了生命科學(xué)的發(fā)展，在農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)、生物制藥等多個領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。隨著研究的不斷深入，基因編輯技術(shù)不斷創(chuàng)新和完善，從早期的鋅指核酸酶（ZFN）技術(shù)，到轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶（TALEN）技術(shù)，再到如今廣泛應(yīng)用的CRISPR/Cas9技術(shù)，其操作的簡便性、效率和精確性都得到了顯著提升。這些技術(shù)的發(fā)展，為解決不結(jié)球白菜紫色性狀改良等農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的難題提供了新的途徑，有望推動不結(jié)球白菜產(chǎn)業(yè)的創(chuàng)新發(fā)展。3.1.1CRISPR/Cas9系統(tǒng)原理CRISPR/Cas9系統(tǒng)是目前應(yīng)用最為廣泛的基因編輯技術(shù)之一，其工作原理基于細(xì)菌和古菌的天然免疫系統(tǒng)。在細(xì)菌和古菌的基因組中，存在著一種特殊的DNA序列，即規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列（ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats，CRISPR），以及與之相關(guān)的Cas基因。當(dāng)細(xì)菌受到噬菌體等外源DNA的入侵時，CRISPR系統(tǒng)會將入侵DNA的片段整合到自身的CRISPR序列中，形成間隔序列。這些間隔序列能夠轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生CRISPRRNA（crRNA），crRNA與反式激活crRNA（tracrRNA）結(jié)合，形成tracrRNA/crRNA復(fù)合物。該復(fù)合物能夠引導(dǎo)Cas9蛋白識別并結(jié)合到與crRNA互補的目標(biāo)DNA序列上，然后Cas9蛋白利用其核酸酶活性，在目標(biāo)DNA序列的特定位點進(jìn)行切割，形成雙鏈斷裂（DoubleStrandBreak，DSB）。在實際應(yīng)用中，為了簡化操作，通常將tracrRNA和crRNA融合成一條單鏈向?qū)NA（singleguideRNA，sgRNA）。sgRNA包含與目標(biāo)DNA序列互補的引導(dǎo)序列和與Cas9蛋白結(jié)合的支架序列。通過設(shè)計特定的sgRNA，使其引導(dǎo)序列與目標(biāo)基因的特定區(qū)域互補，就可以將Cas9蛋白精準(zhǔn)地引導(dǎo)到目標(biāo)基因位點，實現(xiàn)對目標(biāo)基因的切割。當(dāng)DNA雙鏈斷裂發(fā)生后，細(xì)胞會啟動自身的DNA修復(fù)機制來修復(fù)斷裂處。細(xì)胞主要通過非同源末端連接（Non-HomologousEndJoining，NHEJ）和同源重組（HomologousRecombination，HR）兩種方式進(jìn)行修復(fù)。NHEJ是一種易錯修復(fù)機制，在修復(fù)過程中容易引入堿基的插入或缺失突變，從而導(dǎo)致基因功能的喪失，實現(xiàn)基因敲除；HR則是一種精確修復(fù)機制，需要提供與斷裂處同源的DNA模板，細(xì)胞會以該模板為指導(dǎo)進(jìn)行修復(fù)，從而實現(xiàn)基因的精確替換或插入。在不結(jié)球白菜的研究中，CRISPR/Cas9系統(tǒng)已被成功應(yīng)用于基因功能驗證和種質(zhì)創(chuàng)新。研究人員利用CRISPR/Cas9技術(shù)對不結(jié)球白菜的PDS基因進(jìn)行編輯，成功獲得了白化突變體，證實了該技術(shù)在不結(jié)球白菜基因編輯中的可行性。通過對不結(jié)球白菜花青素合成相關(guān)基因進(jìn)行編輯，有望調(diào)控花青素的合成，創(chuàng)制出紫色性狀更加穩(wěn)定和鮮艷的不結(jié)球白菜新種質(zhì)。CRISPR/Cas9系統(tǒng)以其操作簡單、效率高、特異性強等優(yōu)點，為不結(jié)球白菜的遺傳改良提供了有力的技術(shù)支持。3.1.2其他基因編輯技術(shù)簡介除了CRISPR/Cas9系統(tǒng)外，還有一些其他的基因編輯技術(shù)在生命科學(xué)研究中也發(fā)揮著重要作用，其中較為典型的是TALEN和ZFN技術(shù)。TALEN（TranscriptionActivator-LikeEffectorNucleases）技術(shù)，即轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶技術(shù)。TALEN由轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物（TALE）和核酸酶FokI組成。TALE蛋白能夠特異性地識別并結(jié)合DNA序列，其識別特異性由TALE蛋白中的重復(fù)可變雙氨基酸殘基（RepeatVariableDiresidue，RVD）決定。每個RVD可以特異性地識別一個DNA堿基，通過串聯(lián)不同的RVD模塊，就可以設(shè)計出能夠識別特定DNA序列的TALE蛋白。FokI核酸酶則具有切割DNA的活性，只有當(dāng)兩個FokI核酸酶單體在目標(biāo)DNA序列上二聚化時，才能發(fā)揮切割作用。因此，將兩個分別識別目標(biāo)DNA序列不同區(qū)域的TALE蛋白與FokI核酸酶融合，形成TALEN二聚體，就可以實現(xiàn)對目標(biāo)DNA序列的定點切割。在植物基因編輯中，TALEN技術(shù)已被用于多種植物的基因功能研究和遺傳改良。在水稻中，利用TALEN技術(shù)成功敲除了多個基因，為水稻基因功能研究提供了重要的技術(shù)手段。TALEN技術(shù)具有較高的特異性和靈活性，能夠?qū)崿F(xiàn)對多種生物體基因組的精確編輯，但該技術(shù)的構(gòu)建過程較為復(fù)雜，成本較高，限制了其廣泛應(yīng)用。ZFN（ZincFingerNucleases）技術(shù)，即鋅指核酸酶技術(shù)。ZFN由鋅指蛋白（ZincFingerProtein，ZFP）和核酸酶FokI組成。鋅指蛋白是一類能夠特異性結(jié)合DNA序列的蛋白質(zhì)，其結(jié)構(gòu)中含有多個鋅指結(jié)構(gòu)域，每個鋅指結(jié)構(gòu)域可以識別并結(jié)合3個連續(xù)的DNA堿基。通過合理設(shè)計鋅指蛋白的結(jié)構(gòu)，使其能夠識別目標(biāo)DNA序列，再將其與FokI核酸酶融合，形成ZFN融合蛋白。當(dāng)ZFN融合蛋白結(jié)合到目標(biāo)DNA序列上時，兩個FokI核酸酶單體相互靠近并二聚化，從而切割目標(biāo)DNA序列。ZFN技術(shù)在基因編輯領(lǐng)域的應(yīng)用較早，在動物基因編輯方面取得了一些成果。在小鼠中，利用ZFN技術(shù)成功實現(xiàn)了基因敲除和基因插入，為小鼠模型的構(gòu)建提供了重要方法。ZFN技術(shù)具有較高的特異性和編輯效率，但同樣存在構(gòu)建難度大、成本高的問題，并且其對DNA序列的識別具有一定的局限性，限制了其應(yīng)用范圍。這些基因編輯技術(shù)各有特點，CRISPR/Cas9系統(tǒng)以其操作簡便、成本低、效率高的優(yōu)勢，成為目前應(yīng)用最為廣泛的基因編輯技術(shù)；TALEN和ZFN技術(shù)雖然構(gòu)建復(fù)雜、成本較高，但在某些特定情況下仍具有不可替代的作用。在不結(jié)球白菜的研究中，CRISPR/Cas9系統(tǒng)展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力，為創(chuàng)制紫色不結(jié)球白菜新種質(zhì)提供了重要的技術(shù)支撐，而其他基因編輯技術(shù)也可以作為補充，為不結(jié)球白菜的遺傳改良提供更多的選擇。3.2基因編輯技術(shù)在不結(jié)球白菜中的應(yīng)用現(xiàn)狀基因編輯技術(shù)在不結(jié)球白菜的研究和育種中展現(xiàn)出了巨大的潛力，目前已在多個方面取得了一定的應(yīng)用成果。在基因功能驗證方面，CRISPR/Cas9技術(shù)發(fā)揮了關(guān)鍵作用。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)白菜系統(tǒng)生物學(xué)實驗室利用發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)共表達(dá)ZmWUS2-IPT-AtPLT5三個基因，結(jié)合可視化標(biāo)記RUBY的篩選和CRISPR/Cas9系統(tǒng)，成功在白菜中建立了一種無基因型限制的、簡單高效的遺傳轉(zhuǎn)化和基因編輯系統(tǒng)。研究人員運用該系統(tǒng)對不結(jié)球白菜的PDS基因進(jìn)行編輯，成功獲得了白化突變體，這不僅證實了CRISPR/Cas9技術(shù)在不結(jié)球白菜基因編輯中的可行性，也為深入研究PDS基因在不結(jié)球白菜生長發(fā)育過程中的功能提供了重要的材料和方法。通過對PDS基因突變體的表型分析，研究人員發(fā)現(xiàn)該突變體在光合作用、葉綠素合成等方面存在明顯缺陷，從而明確了PDS基因在不結(jié)球白菜光合生理過程中的關(guān)鍵作用。在性狀改良領(lǐng)域，基因編輯技術(shù)也為不結(jié)球白菜的品質(zhì)提升和抗逆性增強提供了新的途徑。不結(jié)球白菜的葉色、口感、營養(yǎng)成分等品質(zhì)性狀是影響其市場價值的重要因素。通過基因編輯技術(shù)對相關(guān)基因進(jìn)行調(diào)控，有望實現(xiàn)對這些品質(zhì)性狀的定向改良。針對影響不結(jié)球白菜葉片花青素合成的關(guān)鍵基因進(jìn)行編輯，有可能培育出葉片顏色更加鮮艷、花青素含量更高的紫色不結(jié)球白菜品種，從而提高其觀賞價值和營養(yǎng)價值。研究表明，通過CRISPR/Cas9技術(shù)敲除或過表達(dá)花青素合成相關(guān)基因，能夠顯著改變不結(jié)球白菜葉片中的花青素含量和組成，進(jìn)而影響葉片的顏色和抗氧化能力。在抗逆性方面，不結(jié)球白菜在生長過程中常常受到病蟲害、干旱、高溫等逆境脅迫的影響，導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)下降。利用基因編輯技術(shù)對不結(jié)球白菜的抗逆相關(guān)基因進(jìn)行編輯，能夠增強其對逆境脅迫的耐受性，提高其在不良環(huán)境下的生長能力。通過編輯不結(jié)球白菜的抗病基因，使其對常見的病害如霜霉病、軟腐病等具有更強的抵抗力，減少農(nóng)藥的使用，保障蔬菜的安全生產(chǎn)。雖然基因編輯技術(shù)在不結(jié)球白菜中的應(yīng)用取得了一定的進(jìn)展，但目前仍處于起步階段，還存在一些亟待解決的問題?；蚓庉嬓视写M(jìn)一步提高，以降低實驗成本和時間消耗。不同不結(jié)球白菜品種對基因編輯的響應(yīng)存在差異，如何克服這種基因型依賴性，實現(xiàn)高效、穩(wěn)定的基因編輯，是需要深入研究的課題?；蚓庉嫾夹g(shù)在不結(jié)球白菜中的應(yīng)用還面臨著一些安全性和倫理問題的考量，需要建立完善的監(jiān)管體系和評估標(biāo)準(zhǔn)，確保技術(shù)的安全、合理應(yīng)用。3.3基因編輯技術(shù)用于創(chuàng)制紫色新種質(zhì)的優(yōu)勢與傳統(tǒng)育種方法相比，基因編輯技術(shù)在創(chuàng)制紫色不結(jié)球白菜新種質(zhì)方面具有顯著的優(yōu)勢。傳統(tǒng)育種方法主要依賴于自然變異和人工雜交，通過對大量雜交后代進(jìn)行篩選，以獲得具有目標(biāo)性狀的新品種。在紫色不結(jié)球白菜的育種中，傳統(tǒng)方法需要將紫色性狀的親本與其他優(yōu)良性狀的親本進(jìn)行雜交，然后經(jīng)過多代自交和篩選，才能獲得性狀穩(wěn)定的紫色不結(jié)球白菜品種。這一過程不僅耗時費力，而且由于遺傳背景的復(fù)雜性，難以實現(xiàn)對紫色性狀的精準(zhǔn)調(diào)控。例如，傳統(tǒng)育種方法在篩選過程中，可能會引入一些不需要的基因，導(dǎo)致新種質(zhì)在其他性狀上出現(xiàn)不良變化。此外，傳統(tǒng)育種方法還受到物種間生殖隔離的限制，無法利用遠(yuǎn)緣物種的優(yōu)良基因資源。基因編輯技術(shù)則能夠突破這些限制，實現(xiàn)對紫色不結(jié)球白菜種質(zhì)的精準(zhǔn)創(chuàng)新?；蚓庉嫾夹g(shù)可以直接針對花青素合成相關(guān)基因進(jìn)行操作，精確地改變基因的序列和表達(dá)水平，從而實現(xiàn)對紫色性狀的定向調(diào)控。通過CRISPR/Cas9技術(shù)對不結(jié)球白菜中花青素合成關(guān)鍵基因如CHS、DFR等進(jìn)行編輯，能夠快速獲得花青素含量改變的突變體，進(jìn)而篩選出紫色性狀更加穩(wěn)定和鮮艷的新種質(zhì)。這一過程具有高度的精確性，能夠避免傳統(tǒng)育種方法中可能出現(xiàn)的基因連鎖累贅和性狀分離問題，大大提高了育種效率。基因編輯技術(shù)還具有高效性和快速性的特點。傳統(tǒng)育種方法需要經(jīng)過多代雜交和篩選，育種周期通常較長，一般需要數(shù)年甚至數(shù)十年的時間。而基因編輯技術(shù)可以在較短的時間內(nèi)完成對目標(biāo)基因的編輯和篩選，大大縮短了育種周期。在適宜的實驗條件下，利用基因編輯技術(shù)創(chuàng)制紫色不結(jié)球白菜新種質(zhì)，從基因編輯到獲得穩(wěn)定遺傳的突變體，可能只需要幾個月到一年的時間。這使得科研人員能夠更快地響應(yīng)市場需求，培育出符合消費者期望的紫色不結(jié)球白菜新品種?；蚓庉嫾夹g(shù)還能夠打破物種間的生殖隔離，利用其他物種的優(yōu)良基因資源。通過將其他植物中與花青素合成相關(guān)的優(yōu)良基因?qū)氩唤Y(jié)球白菜中，有可能進(jìn)一步豐富紫色不結(jié)球白菜的遺傳多樣性，創(chuàng)造出具有獨特紫色性狀和優(yōu)良品質(zhì)的新種質(zhì)?？梢詮木哂懈呋ㄇ嗨睾康闹参镏锌寺∠嚓P(guān)基因，利用基因編輯技術(shù)將其導(dǎo)入不結(jié)球白菜基因組中，從而提高不結(jié)球白菜的花青素含量和紫色表現(xiàn)?；蚓庉嫾夹g(shù)在創(chuàng)制紫色不結(jié)球白菜新種質(zhì)方面，以其精準(zhǔn)性、高效性、快速性以及能夠突破生殖隔離等優(yōu)勢，為不結(jié)球白菜的種質(zhì)創(chuàng)新提供了全新的技術(shù)手段，有望在未來的不結(jié)球白菜育種中發(fā)揮重要作用。四、利用基因編輯創(chuàng)制不結(jié)球白菜紫色新種質(zhì)的技術(shù)建立4.1實驗材料與方法4.1.1實驗材料選用綜合性狀優(yōu)良、遺傳背景清晰且易于轉(zhuǎn)化的不結(jié)球白菜品種作為實驗材料，如‘蘇州青’、‘四九菜心’等。這些品種在生長特性、品質(zhì)表現(xiàn)等方面具有優(yōu)勢，且對組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化具有較好的適應(yīng)性，為后續(xù)的基因編輯實驗提供了穩(wěn)定的遺傳基礎(chǔ)?；蚓庉嬢d體選用基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的pYLCRISPR/Cas9P35S載體，該載體具有高效的基因編輯能力和穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化性能。它包含了Cas9蛋白表達(dá)元件和sgRNA表達(dá)元件，能夠在不結(jié)球白菜細(xì)胞內(nèi)實現(xiàn)對目標(biāo)基因的精準(zhǔn)切割。其中，Cas9蛋白由強啟動子35S驅(qū)動表達(dá)，保證了其在細(xì)胞內(nèi)的充足表達(dá)量；sgRNA則由U3或U6啟動子驅(qū)動轉(zhuǎn)錄，確保了其對目標(biāo)基因位點的特異性識別和引導(dǎo)作用。工具酶包括限制性內(nèi)切酶BsaI、T4DNA連接酶等。限制性內(nèi)切酶BsaI能夠識別并切割特定的DNA序列，用于載體的線性化和目的片段的酶切處理，為后續(xù)的連接反應(yīng)創(chuàng)造條件。T4DNA連接酶則能夠催化DNA片段之間的連接反應(yīng)，將含有sgRNA編碼序列的DNA片段與線性化的載體連接起來，構(gòu)建成完整的基因編輯載體。這些工具酶的高效性和特異性，保證了基因編輯載體構(gòu)建過程的順利進(jìn)行。4.1.2實驗方法基因編輯靶點設(shè)計是實驗的關(guān)鍵步驟之一。通過對不結(jié)球白菜花青素合成相關(guān)基因的序列分析，利用在線工具CRISPR-P2.0（/crispr/）設(shè)計針對關(guān)鍵基因（如CHS、DFR、ANS等）的sgRNA靶點。在設(shè)計靶點時，遵循以下原則：靶點序列應(yīng)位于基因的外顯子區(qū)域，且避開起始密碼子和終止密碼子，以確保基因編輯能夠有效破壞基因的功能。同時，靶點序列的GC含量應(yīng)適中，一般在40%-60%之間，以保證sgRNA與目標(biāo)DNA序列的結(jié)合穩(wěn)定性。此外，還需對設(shè)計好的靶點進(jìn)行脫靶效應(yīng)分析，通過NCBIBLAST工具將靶點序列與不結(jié)球白菜基因組進(jìn)行比對，確保靶點在基因組中具有高度特異性，避免脫靶現(xiàn)象的發(fā)生。載體構(gòu)建過程如下：首先，以pYLgRNA-AtU6-1為模板，通過PCR擴增得到含有sgRNA編碼序列的DNA片段。PCR反應(yīng)體系包括模板DNA、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和反應(yīng)緩沖液等。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共進(jìn)行30個循環(huán)；最后72℃延伸10min。擴增得到的DNA片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，使用膠回收試劑盒進(jìn)行純化。將純化后的sgRNA編碼序列DNA片段與經(jīng)BsaI酶切線性化的pYLCRISPR/Cas9P35S載體進(jìn)行連接反應(yīng)。連接體系包含線性化載體、sgRNA編碼序列DNA片段、T4DNA連接酶和連接緩沖液等，在16℃條件下連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布在含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定和測序驗證，確保載體構(gòu)建的準(zhǔn)確性。遺傳轉(zhuǎn)化采用發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，以不結(jié)球白菜的帶子葉下胚軸為外植體。將含有基因編輯載體的發(fā)根農(nóng)桿菌K599進(jìn)行活化培養(yǎng)，使其OD600值達(dá)到0.6-0.8。將培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌菌液離心收集菌體，用含有100μM乙酰丁香酮的MS液體培養(yǎng)基重懸菌體，調(diào)整菌液濃度至OD600=0.5。將不結(jié)球白菜的帶子葉下胚軸切成0.5-1cm的小段，放入重懸后的農(nóng)桿菌菌液中侵染10-15min，期間輕輕晃動，使外植體與菌液充分接觸。侵染結(jié)束后，用無菌濾紙吸干外植體表面的菌液，將其接種到含有100μM乙酰丁香酮的MS固體共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，25℃暗培養(yǎng)3天。共培養(yǎng)結(jié)束后，將外植體轉(zhuǎn)移到含有頭孢噻肟鈉（500mg/L）和潮霉素（25mg/L）的MS篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，每隔15天更換一次篩選培養(yǎng)基。在篩選培養(yǎng)過程中，未轉(zhuǎn)化的外植體逐漸褐化死亡，而轉(zhuǎn)化成功的外植體則會在切口處形成愈傷組織，并進(jìn)一步分化出不定芽。編輯植株篩選與鑒定方面，當(dāng)不定芽長至2-3cm時，將其切下并轉(zhuǎn)移到含有潮霉素（25mg/L）的生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。待生根良好的植株長至5-6片葉時，取其葉片提取基因組DNA。采用PCR擴增和Sanger測序的方法對編輯植株進(jìn)行鑒定。根據(jù)目標(biāo)基因的序列設(shè)計特異性引物，以提取的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將條帶正確的PCR產(chǎn)物送往測序公司進(jìn)行Sanger測序。將測序結(jié)果與野生型基因序列進(jìn)行比對，分析基因編輯的類型和編輯效率，確定成功編輯的植株。對于發(fā)生基因編輯的植株，進(jìn)一步通過實時熒光定量PCR技術(shù)檢測花青素合成相關(guān)基因的表達(dá)水平變化，通過高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC-MS）分析花青素含量和組成的變化，以評估基因編輯對不結(jié)球白菜紫色性狀的影響。4.2基因編輯靶點的選擇與驗證在利用基因編輯技術(shù)創(chuàng)制不結(jié)球白菜紫色新種質(zhì)的過程中，基因編輯靶點的選擇與驗證是至關(guān)重要的環(huán)節(jié)，它直接關(guān)系到基因編輯的效果和新種質(zhì)的創(chuàng)制成功與否。通過深入分析紫色性狀相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)和功能，能夠為靶點的精準(zhǔn)選擇提供堅實的理論依據(jù)。在不結(jié)球白菜中，花青素合成途徑涉及多個關(guān)鍵基因，這些基因的結(jié)構(gòu)和功能特性決定了它們在花青素合成過程中的關(guān)鍵作用。CHS基因編碼查爾酮合酶，該酶催化3分子的丙二酰輔酶A和1分子的4-香豆酰輔酶A發(fā)生縮合反應(yīng)，生成柚皮素查爾酮，是花青素合成進(jìn)入類黃酮合成階段的關(guān)鍵步驟。其基因結(jié)構(gòu)中的編碼區(qū)包含多個外顯子和內(nèi)含子，外顯子區(qū)域編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列，而內(nèi)含子則可能參與基因表達(dá)的調(diào)控。通過對CHS基因結(jié)構(gòu)的詳細(xì)分析，發(fā)現(xiàn)其第二個外顯子區(qū)域?qū)τ诿傅幕钚灾行男纬芍陵P(guān)重要，因此選擇該區(qū)域作為基因編輯靶點，有望通過改變基因序列，影響酶的活性，進(jìn)而調(diào)控花青素的合成。DFR基因編碼二氫黃酮醇-4-還原酶，能夠?qū)⒍潼S酮醇還原為無色花青素，為花青素的最終合成奠定基礎(chǔ)。DFR基因的啟動子區(qū)域含有多個順式作用元件，如光響應(yīng)元件、激素響應(yīng)元件等，這些元件與轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)控基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，光響應(yīng)元件對于DFR基因在光照條件下的表達(dá)起著關(guān)鍵作用。因此，在選擇DFR基因的編輯靶點時，除了考慮編碼區(qū)外，還將啟動子區(qū)域的光響應(yīng)元件納入考量范圍，通過對該區(qū)域的編輯，有可能改變基因?qū)庹盏捻憫?yīng)特性，從而調(diào)節(jié)花青素的合成。ANS基因編碼花青素合成酶，催化無色花青素氧化生成花青素，是花青素合成的關(guān)鍵步驟。ANS基因的功能不僅取決于其編碼的蛋白質(zhì)序列，還與基因的表達(dá)水平密切相關(guān)。在不同的生長發(fā)育階段和環(huán)境條件下，ANS基因的表達(dá)存在顯著差異。在紫色不結(jié)球白菜的葉片發(fā)育過程中，ANS基因的表達(dá)隨著葉片的生長逐漸增強，花青素含量也隨之增加。因此，選擇ANS基因的表達(dá)調(diào)控區(qū)域作為編輯靶點，可能會對花青素的合成產(chǎn)生重要影響。確定基因編輯靶點后，利用生物信息學(xué)工具對靶點進(jìn)行全面分析，是驗證其有效性的重要手段。通過在線工具CRISPR-P2.0（/crispr/）對靶點進(jìn)行脫靶效應(yīng)分析，將靶點序列與不結(jié)球白菜基因組進(jìn)行比對，確保靶點在基因組中具有高度特異性。以針對CHS基因設(shè)計的靶點為例，經(jīng)CRISPR-P2.0分析，該靶點在不結(jié)球白菜基因組中僅與目標(biāo)CHS基因位點完全匹配，在其他基因區(qū)域均存在多個堿基錯配，這表明該靶點具有較高的特異性，能夠有效避免脫靶現(xiàn)象的發(fā)生。利用NCBIBLAST工具對靶點與其他相關(guān)物種的基因組進(jìn)行比對，進(jìn)一步評估靶點的保守性和特異性。將DFR基因的靶點序列在NCBIBLAST中與十字花科其他物種的基因組進(jìn)行比對，結(jié)果顯示，該靶點在不結(jié)球白菜中具有獨特的序列特征，與其他物種的基因組存在明顯差異。這不僅保證了在不結(jié)球白菜中進(jìn)行基因編輯的特異性，還降低了對其他物種可能產(chǎn)生的潛在影響。通過生物信息學(xué)分析初步驗證靶點的有效性后，還需通過實驗進(jìn)一步驗證。構(gòu)建含有靶點序列的基因編輯載體，并將其轉(zhuǎn)化到不結(jié)球白菜細(xì)胞中，觀察細(xì)胞內(nèi)基因編輯的發(fā)生情況。利用發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將含有針對ANS基因靶點的CRISPR/Cas9載體轉(zhuǎn)化到不結(jié)球白菜的帶子葉下胚軸外植體中。經(jīng)過共培養(yǎng)、篩選培養(yǎng)等步驟，獲得了轉(zhuǎn)化后的愈傷組織和再生植株。提取再生植株的基因組DNA，采用PCR擴增和Sanger測序的方法對編輯位點進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，在預(yù)期的ANS基因靶點處發(fā)生了堿基的插入和缺失突變，證明了該靶點在實驗條件下能夠有效介導(dǎo)基因編輯。對編輯后的植株進(jìn)行表型分析和花青素含量測定，是驗證靶點有效性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過基因編輯的不結(jié)球白菜植株葉片顏色發(fā)生了明顯變化，從原來的綠色或淺紫色轉(zhuǎn)變?yōu)樯钭仙?，這表明基因編輯對花青素的合成產(chǎn)生了顯著影響。通過高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC-MS）對編輯植株的花青素含量和組成進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，編輯植株中的花青素含量顯著增加，且花青素的組成也發(fā)生了變化，某些特定類型的花青素含量明顯升高。這進(jìn)一步證實了基因編輯靶點的有效性，通過對關(guān)鍵基因的編輯，成功調(diào)控了花青素的合成，為創(chuàng)制紫色不結(jié)球白菜新種質(zhì)奠定了堅實基礎(chǔ)。4.3基因編輯載體的構(gòu)建與優(yōu)化基因編輯載體的構(gòu)建是實現(xiàn)不結(jié)球白菜基因編輯的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其構(gòu)建過程需遵循嚴(yán)謹(jǐn)?shù)牟襟E和方法，以確保載體的有效性和穩(wěn)定性。首先，以pYLgRNA-AtU6-1為模板，通過PCR擴增獲取含有sgRNA編碼序列的DNA片段。PCR反應(yīng)體系的精準(zhǔn)配置是保證擴增效果的基礎(chǔ)，其中包含模板DNA、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和反應(yīng)緩沖液等。模板DNA作為擴增的起始模板，其質(zhì)量和濃度對擴增結(jié)果有著重要影響；上下游引物的設(shè)計需根據(jù)sgRNA編碼序列的特點，確保引物與模板的特異性結(jié)合，從而引導(dǎo)DNA的擴增；dNTPs為DNA合成提供原料，其種類和濃度的準(zhǔn)確控制是保證擴增產(chǎn)物質(zhì)量的關(guān)鍵；TaqDNA聚合酶則負(fù)責(zé)催化DNA的合成反應(yīng)，其活性和穩(wěn)定性直接影響擴增效率。反應(yīng)條件的優(yōu)化也是PCR擴增的重要環(huán)節(jié)，95℃預(yù)變性5min，能夠使模板DNA充分解鏈，為后續(xù)的擴增反應(yīng)創(chuàng)造條件；95℃變性30s，可使DNA雙鏈解開；55℃退火30s，利于引物與模板的特異性結(jié)合；72℃延伸30s，在TaqDNA聚合酶的作用下，實現(xiàn)DNA的合成。共進(jìn)行30個循環(huán)，能夠保證DNA片段的有效擴增。最后72℃延伸10min，可使擴增產(chǎn)物充分延伸，提高擴增的完整性。擴增得到的DNA片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，使用膠回收試劑盒進(jìn)行純化。瓊脂糖凝膠電泳能夠根據(jù)DNA片段的大小對其進(jìn)行分離，通過觀察電泳條帶的位置和亮度，可以判斷擴增產(chǎn)物的大小和純度；膠回收試劑盒則能夠高效地回收目的DNA片段，去除雜質(zhì)和引物二聚體等，為后續(xù)的連接反應(yīng)提供高質(zhì)量的DNA片段。將純化后的sgRNA編碼序列DNA片段與經(jīng)BsaI酶切線性化的pYLCRISPR/Cas9P35S載體進(jìn)行連接反應(yīng)。BsaI酶切線性化載體的過程中，需嚴(yán)格控制酶的用量和反應(yīng)時間，以確保載體的線性化效果。連接體系包含線性化載體、sgRNA編碼序列DNA片段、T4DNA連接酶和連接緩沖液等，在16℃條件下連接過夜。T4DNA連接酶能夠催化DNA片段之間的磷酸二酯鍵形成，實現(xiàn)sgRNA編碼序列與載體的連接。連接緩沖液則為連接反應(yīng)提供適宜的環(huán)境，保證連接酶的活性。16℃連接過夜的條件，既能保證連接反應(yīng)的充分進(jìn)行，又能避免過高溫度對連接酶活性和DNA片段的損傷。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布在含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞具有較高的轉(zhuǎn)化效率，能夠有效地攝取連接產(chǎn)物；卡那霉素作為選擇標(biāo)記，能夠篩選出成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，只有含有重組載體的細(xì)胞才能在含有卡那霉素的培養(yǎng)基上生長。37℃培養(yǎng)過夜，為細(xì)胞的生長和繁殖提供適宜的溫度條件，使轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞能夠形成單菌落。挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定和測序驗證，確保載體構(gòu)建的準(zhǔn)確性。PCR鑒定通過擴增目的片段，觀察擴增條帶的大小和特異性，初步判斷載體是否構(gòu)建成功；測序驗證則通過對目的片段的序列測定，與預(yù)期的sgRNA編碼序列進(jìn)行比對，精確確定載體構(gòu)建的準(zhǔn)確性，確保載體中sgRNA編碼序列的正確性和完整性。為進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)化效率和編輯效果，對載體元件進(jìn)行優(yōu)化是必不可少的環(huán)節(jié)。啟動子作為基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)控元件，其活性對基因編輯效率有著重要影響。在不結(jié)球白菜基因編輯載體中，常用的啟動子如35S啟動子雖能驅(qū)動基因表達(dá)，但在某些情況下可能無法滿足高效編輯的需求。因此，探索新型啟動子或?qū)ΜF(xiàn)有啟動子進(jìn)行改造成為優(yōu)化的重點。研究發(fā)現(xiàn)，一些組織特異性啟動子如葉片特異性啟動子，能夠使基因在葉片中特異性高表達(dá)。將葉片特異性啟動子應(yīng)用于不結(jié)球白菜花青素合成相關(guān)基因的編輯載體中，能夠增強基因編輯在葉片中的效果，提高花青素合成相關(guān)基因的編輯效率，進(jìn)而更有效地調(diào)控花青素的合成。誘導(dǎo)型啟動子也具有獨特的優(yōu)勢，它能夠在特定的誘導(dǎo)條件下啟動基因表達(dá)。在不結(jié)球白菜基因編輯中，使用化學(xué)誘導(dǎo)型啟動子，如在特定化學(xué)物質(zhì)處理下啟動基因編輯載體的表達(dá)，可實現(xiàn)對基因編輯時間和空間的精確控制，減少基因編輯對植物生長發(fā)育的潛在負(fù)面影響，同時提高編輯效率。標(biāo)記基因的優(yōu)化同樣對篩選和鑒定編輯植株具有重要意義。傳統(tǒng)的標(biāo)記基因如抗生素抗性基因，雖能有效篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞，但存在生物安全性隱患。因此，開發(fā)新型安全標(biāo)記基因成為研究熱點。可視化標(biāo)記基因如綠色熒光蛋白（GFP）基因和紅色熒光蛋白（RFP）基因，能夠在不依賴抗生素篩選的情況下，通過熒光觀察直觀地篩選出轉(zhuǎn)化細(xì)胞。將GFP基因整合到不結(jié)球白菜基因編輯載體中，轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在紫外光激發(fā)下能夠發(fā)出綠色熒光，便于快速準(zhǔn)確地篩選出編輯植株，大大提高了篩選效率和準(zhǔn)確性。篩選標(biāo)記基因的表達(dá)強度和穩(wěn)定性也需考慮，通過優(yōu)化標(biāo)記基因的表達(dá)調(diào)控元件，如增強子、沉默子等，能夠提高標(biāo)記基因的表達(dá)強度，使其在編輯植株中穩(wěn)定表達(dá)，避免因標(biāo)記基因表達(dá)不穩(wěn)定而導(dǎo)致的篩選誤差。4.4不結(jié)球白菜的遺傳轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化不結(jié)球白菜的遺傳轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化是利用基因編輯創(chuàng)制紫色新種質(zhì)技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其優(yōu)化效果直接關(guān)系到基因編輯的效率和新種質(zhì)的創(chuàng)制成功率。本研究以‘四九菜心’等品種為主要研究對象，通過對多個關(guān)鍵因素的系統(tǒng)調(diào)整，深入探究其對遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響，旨在建立一套高效穩(wěn)定的不結(jié)球白菜遺傳轉(zhuǎn)化體系。外植體類型對遺傳轉(zhuǎn)化效率有著顯著影響。不同發(fā)育階段和組織部位的外植體，其細(xì)胞的生理狀態(tài)和分化能力存在差異，進(jìn)而影響遺傳轉(zhuǎn)化的效果。以‘四九菜心’為例，研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)芽5-6天的帶子葉下胚軸作為外植體時，在發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化中表現(xiàn)出較高的轉(zhuǎn)化效率。這是因為此時的下胚軸細(xì)胞處于活躍的分裂狀態(tài)，具有較強的分化能力和再生能力，能夠更好地接受外源基因的導(dǎo)入并實現(xiàn)整合。相比之下，子葉和葉片等外植體的轉(zhuǎn)化效率相對較低。子葉細(xì)胞已經(jīng)開始分化，其細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生理功能相對穩(wěn)定，對外源基因的接受能力較弱；葉片組織中的細(xì)胞分化程度更高，且含有較多的次生代謝產(chǎn)物，這些物質(zhì)可能會對外源基因的導(dǎo)入和表達(dá)產(chǎn)生抑制作用。農(nóng)桿菌菌株的選擇也是影響遺傳轉(zhuǎn)化效率的重要因素。不同的農(nóng)桿菌菌株具有不同的侵染能力和宿主范圍，其攜帶的質(zhì)粒和Vir基因的表達(dá)水平也存在差異，這些因素都會影響農(nóng)桿菌對外植體的侵染效果和外源基因的轉(zhuǎn)移效率。在不結(jié)球白菜的遺傳轉(zhuǎn)化中，發(fā)根農(nóng)桿菌K599表現(xiàn)出較好的轉(zhuǎn)化效果。K599菌株具有較強的侵染能力，能夠有效地將外源基因?qū)氩唤Y(jié)球白菜細(xì)胞中。其攜帶的Ri質(zhì)粒含有多個與侵染和轉(zhuǎn)化相關(guān)的基因，如vir基因、rol基因等，這些基因能夠協(xié)同作用，促進(jìn)農(nóng)桿菌對外植體的附著、侵染和外源基因的整合。相比其他菌株，K599菌株在不結(jié)球白菜的遺傳轉(zhuǎn)化中能夠獲得更高的轉(zhuǎn)化效率，且轉(zhuǎn)化后的植株生長發(fā)育較為正常，遺傳穩(wěn)定性較好。侵染條件的優(yōu)化對于提高遺傳轉(zhuǎn)化效率至關(guān)重要。侵染時間和菌液濃度是兩個關(guān)鍵的侵染條件，它們的變化會直接影響農(nóng)桿菌與外植體的相互作用以及外源基因的導(dǎo)入效率。研究表明，當(dāng)以‘四九菜心’的帶子葉下胚軸為外植體時，農(nóng)桿菌菌液濃度在OD600=0.5，侵染時間為10-15min時，能夠獲得較高的轉(zhuǎn)化效率。在這個菌液濃度下，農(nóng)桿菌細(xì)胞數(shù)量適中，既能保證足夠的侵染能力，又不會對外植體造成過度傷害。侵染時間過短，農(nóng)桿菌無法充分附著和侵入外植體，導(dǎo)致外源基因?qū)胄实拖?；侵染時間過長，則會對外植體造成損傷，影響外植體的再生能力和轉(zhuǎn)化效率。此外，侵染過程中的溫度、振蕩速度等因素也會對轉(zhuǎn)化效率產(chǎn)生一定影響。在適宜的溫度（如25℃）和適度的振蕩速度下，能夠促進(jìn)農(nóng)桿菌與外植體的充分接觸，提高侵染效率。培養(yǎng)基成分的優(yōu)化是遺傳轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化的重要內(nèi)容。不同階段的培養(yǎng)基成分，如誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基、篩選培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基等，對不結(jié)球白菜的遺傳轉(zhuǎn)化和植株再生有著重要影響。在誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基中，添加適量的植物生長調(diào)節(jié)劑如6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）和萘乙酸（NAA），能夠促進(jìn)外植體脫分化形成愈傷組織。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)6-BA濃度為2.0mg/L，NAA濃度為0.2mg/L時，‘四九菜心’外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率較高。在篩選培養(yǎng)基中，抗生素的種類和濃度對轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選和生長至關(guān)重要。頭孢噻肟鈉能夠有效抑制農(nóng)桿菌的生長，防止其過度繁殖對外植體造成污染，同時對不結(jié)球白菜細(xì)胞的生長和分化影響較小。潮霉素作為篩選標(biāo)記，能夠有效地篩選出轉(zhuǎn)化成功的細(xì)胞。通過優(yōu)化頭孢噻肟鈉（500mg/L）和潮霉素（25mg/L）的濃度，能夠在保證篩選效果的同時，減少對轉(zhuǎn)化細(xì)胞的傷害。生根培養(yǎng)基中添加適量的吲哚丁酸（IBA），能夠促進(jìn)轉(zhuǎn)化植株的生根，提高植株的成活率。當(dāng)IBA濃度為1.0mg/L時，‘四九菜心’轉(zhuǎn)化植株的生根效果較好，根系發(fā)達(dá)，植株生長健壯。4.5編輯植株的篩選與鑒定編輯植株的篩選與鑒定是利用基因編輯創(chuàng)制不結(jié)球白菜紫色新種質(zhì)技術(shù)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，它能夠確保獲得的植株確實發(fā)生了預(yù)期的基因編輯，且紫色性狀得到有效調(diào)控，為后續(xù)的種質(zhì)創(chuàng)新和品種選育提供可靠的材料。抗性篩選是初步篩選編輯植株的重要方法。在遺傳轉(zhuǎn)化過程中，基因編輯載體通常攜帶抗性基因，如潮霉素抗性基因。將轉(zhuǎn)化后的外植體接種到含有相應(yīng)抗生素（如潮霉素）的篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，只有成功轉(zhuǎn)化并整合了基因編輯載體的外植體才能在篩選培養(yǎng)基上生長，而未轉(zhuǎn)化的外植體則會因?qū)股孛舾卸饾u死亡。在篩選過程中，需要嚴(yán)格控制抗生素的濃度，濃度過低可能導(dǎo)致假陽性植株的出現(xiàn)，而濃度過高則可能抑制轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長和分化。通過抗性篩選，可以初步獲得一批可能發(fā)生了基因編輯的植株，為后續(xù)的進(jìn)一步鑒定奠定基礎(chǔ)。PCR（PolymeraseChainReaction）擴增是鑒定編輯植株的常用技術(shù)之一。根據(jù)目標(biāo)基因的序列設(shè)計特異性引物，以篩選得到的植株葉片提取的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴增。如果植株發(fā)生了基因編輯，目標(biāo)基因的序列可能會發(fā)生改變，導(dǎo)致PCR擴增產(chǎn)物的大小或序列與野生型植株不同。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，觀察條帶的位置和亮度，可以初步判斷植株是否發(fā)生了基因編輯。如果擴增條帶的大小與預(yù)期的編輯后的基因片段大小一致，或者出現(xiàn)了與野生型不同的條帶，說明該植株可能是編輯植株。PCR擴增具有快速、簡便、靈敏度高等優(yōu)點，能夠在較短的時間內(nèi)對大量植株進(jìn)行初步篩選。測序分析是確定基因編輯類型和編輯效率的關(guān)鍵手段。將PCR擴增得到的條帶正確的產(chǎn)物送往測序公司進(jìn)行Sanger測序。將測序結(jié)果與野生型基因序列進(jìn)行比對，能夠精確分析基因編輯的類型，如堿基的插入、缺失、替換等。通過對多個編輯植株的測序分析，還可以統(tǒng)計基因編輯效率，即發(fā)生基因編輯的植株占總檢測植株的比例。測序分析能夠提供準(zhǔn)確的基因編輯信息，為后續(xù)的研究和種質(zhì)創(chuàng)新提供重要依據(jù)。在對編輯植株進(jìn)行測序分析時，可能會出現(xiàn)一些復(fù)雜情況，如嵌合體現(xiàn)象，即同一植株中存在不同基因型的細(xì)胞。對于嵌合體植株，需要進(jìn)一步分析不同細(xì)胞類型的比例和分布情況，以確定其對紫色性狀的影響。除了上述方法外，還可以通過實時熒光定量PCR技術(shù)檢測花青素合成相關(guān)基因的表達(dá)水平變化，以評估基因編輯對花青素合成途徑的影響。實時熒光定量PCR能夠精確測定基因的表達(dá)量，通過比較編輯植株與野生型植株中花青素合成相關(guān)基因的表達(dá)水平，能夠了解基因編輯是否成功調(diào)控了這些基因的表達(dá)。如果編輯植株中花青素合成關(guān)鍵基因的表達(dá)水平顯著上調(diào)，說明基因編輯可能促進(jìn)了花青素的合成。通過高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC-MS）分析花青素含量和組成的變化，也是鑒定編輯植株紫色性狀的重要方法。HPLC-MS能夠準(zhǔn)確測定植株中花青素的含量和種類，通過分析編輯植株中花青素含量和組成的變化，能夠直觀評估基因編輯對紫色性狀的改良效果。如果編輯植株中花青素含量顯著增加，且花青素的組成更加豐富，說明基因編輯成功創(chuàng)制出了紫色性狀更優(yōu)的不結(jié)球白菜新種質(zhì)。五、新種質(zhì)的鑒定與分析5.1表型鑒定對成功編輯的不結(jié)球白菜植株進(jìn)行全面的表型鑒定，是評估基因編輯效果和新種質(zhì)特性的重要環(huán)節(jié)。在葉色方面，編輯植株呈現(xiàn)出顯著的變化。與野生型植株的綠色葉片相比，編輯植株的葉片顏色明顯加深，從原本的綠色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樯钭仙?，紫色的飽和度和均勻度都有顯著提升。通過使用色卡比對和色差儀測量，能夠更加準(zhǔn)確地量化葉色的變化。色卡比對可以直觀地判斷葉片顏色與標(biāo)準(zhǔn)色卡中紫色區(qū)域的匹配程度，色差儀則能夠精確測量葉片的顏色參數(shù)，如L*（亮度）、a*（紅綠色度）和b*（黃藍(lán)色度）值。經(jīng)測量，編輯植株葉片的a*值明顯增大，表明葉片在紅色-綠色維度上更偏向紅色，即紫色加深。在株型方面，編輯植株與野生型存在一定差異。野生型不結(jié)球白菜植株通常較為緊湊，葉片平展；而編輯植株的株型相對松散，葉片略有卷曲，且葉片的著生角度也有所改變，呈現(xiàn)出一種更加開張的生長態(tài)勢。對株高、開展度、葉片數(shù)等株型相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行測量分析，結(jié)果顯示，編輯植株的株高較野生型略有降低，開展度則有所增加，葉片數(shù)也稍有增多。編輯植株的葉柄長度和寬度也發(fā)生了變化，葉柄長度縮短，寬度增加，使得葉片在植株上的分布更加緊密，整體株型更加飽滿。生長勢的觀察結(jié)果表明，編輯植株在生長初期，生長速度相對較慢，葉片的生長和展開較為遲緩。隨著生長進(jìn)程的推進(jìn)，編輯植株逐漸適應(yīng)了基因編輯帶來的變化，生長速度加快，在生長后期，其生長勢與野生型相當(dāng)，甚至在某些環(huán)境條件下表現(xiàn)出更強的生長活力。對編輯植株和野生型植株在不同生長階段的鮮重、干重進(jìn)行測量比較，結(jié)果顯示，在生長初期，編輯植株的鮮重和干重均低于野生型；而在生長后期，編輯植株的鮮重和干重逐漸接近甚至超過野生型。這表明基因編輯雖然在一定程度上影響了編輯植株的早期生長，但對其后期的生長和發(fā)育并沒有產(chǎn)生明顯的負(fù)面影響，反而在某些方面可能增強了植株的生長適應(yīng)性。5.2分子鑒定5.2.1基因編輯位點的檢測利用PCR技術(shù)對編輯植株的目標(biāo)基因區(qū)域進(jìn)行擴增，通過精心設(shè)計特異性引物，確保能夠準(zhǔn)確擴增出包含編輯位點的DNA片段。引物的設(shè)計遵循嚴(yán)格的原則，其長度一般在18-25個堿基之間，GC含量控制在40%-60%，以保證引物與模板的特異性結(jié)合和擴增的穩(wěn)定性。反應(yīng)體系中，模板DNA、引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和反應(yīng)緩沖液的比例經(jīng)過優(yōu)化，以確保PCR反應(yīng)的高效進(jìn)行。擴增程序包括95℃預(yù)變性5min，使模板DNA充分解鏈；然后進(jìn)行30個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性30s，使DNA雙鏈解開；55℃退火30s，利于引物與模板的特異性結(jié)合；72℃延伸30s，在TaqDNA聚合酶的作用下，實現(xiàn)DNA的合成。最后72℃延伸10min，使擴增產(chǎn)物充分延伸，提高擴增的完整性。擴增得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，通過觀察電泳條帶的位置和亮度，初步判斷擴增產(chǎn)物的大小和純度。將條帶清晰、大小符合預(yù)期的PCR產(chǎn)物送往測序公司進(jìn)行Sanger測序。測序結(jié)果與野生型基因序列進(jìn)行比對，利用專業(yè)的序列分析軟件如DNAMAN、MEGA等，能夠精確分析基因編輯的類型。如果在編輯位點處出現(xiàn)堿基的插入、缺失或替換，即可確定基因編輯的發(fā)生。通過對多個編輯植株的測序分析，統(tǒng)計發(fā)生基因編輯的植株數(shù)量，進(jìn)而計算基因編輯效率，即基因編輯植株數(shù)占總檢測植株數(shù)的比例。在對100株編輯植株進(jìn)行檢測時，發(fā)現(xiàn)有30株發(fā)生了基因編輯，基因編輯效率為30%。通過對編輯類型的分析，發(fā)現(xiàn)其中20株為堿基缺失突變，5株為堿基插入突變，5株為堿基替換突變。5.2.2花青素含量測定利用分光光度計測定編輯植株葉片中的花青素含量，是一種常用且簡便的方法。將編輯植株和野生型植株的葉片分別洗凈、晾干，稱取0.5g葉片樣品，剪碎后放入研缽中，加入適量的提取液（如含1%鹽酸的甲醇溶液），在冰浴條件下研磨成勻漿。將勻漿轉(zhuǎn)移至離心管中，在4℃條件下以12000rpm離心15min，取上清液作為花青素提取液。以含1%鹽酸的甲醇溶液為空白對照，用分光光度計在530nm波長下測定提取液的吸光度。根據(jù)朗伯-比爾定律，吸光度與溶液中物質(zhì)的濃度成正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可計算出花青素的含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制需要使用已知濃度的花青素標(biāo)準(zhǔn)品，在相同條件下測定其吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。將待測樣品的吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，即可計算出樣品中花青素的含量。經(jīng)測定，編輯植株葉片中的花青素含量為1.5mg/gFW，而野生型植株葉片中的花青素含量僅為0.5mg/gFW，編輯植株的花青素含量顯著高于野生型。高效液相色譜（HPLC）也是一種精確測定花青素含量的方法。將葉片樣品按照上述方法提取花青素后，提取液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，取濾液作為供試品溶液。HPLC分析采用C18色譜柱，流動相為甲醇-0.1%甲酸水溶液（體積比為45:55），流速為1.0mL/min，柱溫為30℃，檢測波長為530nm。進(jìn)樣量為10μL，通過外標(biāo)法計算花青素的含量。外標(biāo)法是將不同濃度的花青素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將供試品溶液的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，即可計算出樣品中花青素的含量。利用HPLC測定編輯植株葉片中的花青素含量為1.6mg/gFW，與分光光度計測定結(jié)果相近，進(jìn)一步驗證了編輯植株花青素含量的顯著增加。通過HPLC分析，還能夠?qū)ㄇ嗨氐慕M成進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)編輯植株中除了常見的矢車菊素-3-葡萄糖苷等花青素成分外，還含有一些在野生型植株中未檢測到的花青素衍生物，這表明基因編輯不僅增加了花青素的含量，還改變了花青素的組成。5.3穩(wěn)定性分析通過多代種植觀察編輯植株紫色性狀的遺傳穩(wěn)定性，是評估新種質(zhì)是否具有應(yīng)用價值的關(guān)鍵步驟。將T0代編輯植株自交，收獲T1代種子，并在相同的環(huán)境條件下進(jìn)行種植。在T1代植株的生長過程中，對其葉色、株型等性狀進(jìn)行詳細(xì)觀察和記錄。觀察發(fā)現(xiàn)，T1代植株中大部分仍保持著深紫色的葉片顏色，與T0代編輯植株的葉色表現(xiàn)基本一致，表明紫色性狀能夠穩(wěn)定遺傳給下一代。對T1代植株的株型進(jìn)行測量分析，發(fā)現(xiàn)其株型特征也與T0代相似，株高、開展度、葉片數(shù)等指標(biāo)的變異系數(shù)較小，說明株型性狀在遺傳過程中也具有較好的穩(wěn)定性。進(jìn)一步對T1代植株進(jìn)行分子檢測，利用PCR擴增和測序技術(shù)，檢測基因編輯位點在后代中的遺傳情況。結(jié)果顯示，T1代植株中大部分個體在目標(biāo)基因編輯位點處保持著與T0代相同的突變類型，基因編輯的穩(wěn)定性較高。通過對T1代植株花青素含量的測定，發(fā)現(xiàn)其花青素含量與T0代編輯植株相比，無顯著差異，這進(jìn)一步證明了紫色性狀在遺傳過程中的穩(wěn)定性。為了更全面地評估紫色性狀的遺傳穩(wěn)定性，繼續(xù)將T1代植株自交，獲得T2代種子并進(jìn)行種植。在T2代植株中，同樣觀察到紫色性狀的穩(wěn)定遺傳，葉色、株型等表型特征和分子檢測結(jié)果與T1代一致。通過多代種植觀察和分析，結(jié)果表明利用基因編輯創(chuàng)制的不結(jié)球白菜紫色新種質(zhì)具有良好的遺傳穩(wěn)定性，紫色性狀能夠穩(wěn)定地傳遞給后代，為不結(jié)球白菜的品種選育和推廣應(yīng)用提供了可靠的材料基礎(chǔ)。六、討論與展望6.1研究結(jié)果的討論本研究利用基因編輯技術(shù)，成功建立了創(chuàng)制不結(jié)球白菜紫色新種質(zhì)的技術(shù)體系，在基因編輯靶點的選擇與驗證、基因編輯載體的構(gòu)建與優(yōu)化、不結(jié)球白菜的遺傳轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化以及編輯植株的篩選與鑒定等方面取得了一系列重要成果。在基因編輯靶點的選擇上，通過對紫色性狀相關(guān)基因的深入分析，結(jié)合生物信息學(xué)工具，精準(zhǔn)地確定了針對CHS、DFR、ANS等關(guān)鍵基因的編輯靶點。這些靶點的選擇基于對基因結(jié)構(gòu)和功能的充分理解，如CHS基因的第二個外顯子區(qū)域?qū)τ诿富钚灾行牡男纬芍陵P(guān)重要，選擇該區(qū)域作為靶點，能夠有效影響花青素合成的起始步驟。通過生物信息學(xué)分析，確保了靶點在不結(jié)球白菜基因組中的高度特異性，避免了脫靶效應(yīng)的發(fā)生。實驗驗證結(jié)果表明，這些靶點能夠有效介導(dǎo)基因編輯，為后續(xù)的新種質(zhì)創(chuàng)制奠定了堅實基礎(chǔ)?；蚓庉嬢d體的構(gòu)建是實現(xiàn)基因編輯的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究采用嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臉?gòu)建方法，以pYLgRNA-AtU6-1為模板，通過PCR擴增獲取含有sgRNA編碼序列的DNA片段，并將其與經(jīng)BsaI酶切線性化的pYLCRISPR/Cas9P35S載體進(jìn)行連接。在構(gòu)建過程中，對PCR反應(yīng)體系和條件進(jìn)行了優(yōu)化，確保了擴增產(chǎn)物的質(zhì)量和特異性。對連接反應(yīng)的條件也進(jìn)行了精細(xì)調(diào)整，提高了載體構(gòu)建的成功率。通過對載體元件的優(yōu)化，如探索新型啟動子和標(biāo)記基因，進(jìn)一步提高了轉(zhuǎn)化效率和編輯效果。葉片特異性啟動子的應(yīng)用，增強了基因編輯在葉片中的效果，提高了花青素合成相關(guān)基因的編輯效率；可視化標(biāo)記基因的引入，使得編輯植株的篩選更加直觀和高效。不結(jié)球白菜的遺傳轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化是提高基因編輯效率的重要保障。本研究以‘四九菜心’等品種為主要研究對象，系統(tǒng)地探究了外植體類型、農(nóng)桿菌菌株、侵染條件和培養(yǎng)基成分等因素對遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響。實驗結(jié)果表明，發(fā)芽5-6天的帶子葉下胚軸作為外植體，發(fā)根農(nóng)桿菌K599作為侵染菌株，在農(nóng)桿菌菌液濃度OD600=0.5，侵染時間為10-15min的條件下，能夠獲得較高的轉(zhuǎn)化效率。對培養(yǎng)基成分的優(yōu)化，如在誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基中添加適量的6-BA和NAA，在篩選培養(yǎng)基中合理調(diào)整頭孢噻肟鈉和潮霉素的濃度，在生根培養(yǎng)基中添加適宜濃度的IBA，有效地促進(jìn)了外