基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑--1(TIMP--1)對人脂肪干細(xì)胞增殖的影響摘要本研究旨在探討基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）對人脂肪干細(xì)胞（hADSCs）增殖的影響。通過體外培養(yǎng)hADSCs，設(shè)置不同濃度TIMP-1處理組與對照組，利用CCK-8法、EdU標(biāo)記法檢測細(xì)胞增殖能力，并通過Westernblot和qRT-PCR檢測相關(guān)增殖信號通路蛋白及基因的表達(dá)。結(jié)果顯示，低濃度TIMP-1可顯著促進(jìn)hADSCs增殖，高濃度則表現(xiàn)出抑制作用，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)PI3K/AKT等增殖信號通路相關(guān)。本研究為深入理解TIMP-1在干細(xì)胞生物學(xué)中的作用及相關(guān)組織工程和再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用提供理論依據(jù)。關(guān)鍵詞基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1；人脂肪干細(xì)胞；細(xì)胞增殖；信號通路一、引言人脂肪干細(xì)胞（hADSCs）作為一種成體干細(xì)胞，具有來源廣泛、獲取相對容易、增殖能力強(qiáng)和多向分化潛能等優(yōu)勢，在組織工程、再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。細(xì)胞增殖是干細(xì)胞發(fā)揮其功能的基礎(chǔ)，受到多種細(xì)胞因子、生長因子及細(xì)胞外基質(zhì)成分的精細(xì)調(diào)控?；|(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）是TIMP家族中的重要成員，能夠特異性抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的活性。MMPs參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解與重塑，與細(xì)胞的增殖、遷移、分化等過程密切相關(guān)。已有研究表明，TIMP-1在多種細(xì)胞的生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用，但其對hADSCs增殖的影響尚未完全明確。深入探究TIMP-1對hADSCs增殖的影響，有助于揭示其在干細(xì)胞生物學(xué)中的作用機(jī)制，為hADSCs在組織修復(fù)與再生等方面的應(yīng)用提供新的理論基礎(chǔ)和潛在干預(yù)靶點(diǎn)。二、材料與方法（一）實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞來源：從健康志愿者腹部皮下脂肪組織中分離獲得hADSCs，志愿者均簽署知情同意書，該研究經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。主要試劑：DMEM/F12培養(yǎng)基（Gibco）、胎牛血清（FBS，Gibco）、青霉素-鏈霉素雙抗（Gibco）、TIMP-1重組蛋白（PeproTech）、CCK-8試劑盒（Dojindo）、EdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒（RiboBio）、RIPA裂解液（Beyotime）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（Beyotime）、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（Beyotime）、PVDF膜（Millipore）、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（ThermoFisherScientific）、TRIzol試劑（Invitrogen）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）、SYBRGreenPCRMasterMix（TaKaRa）。主要儀器：CO?培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific）、倒置相差顯微鏡（Olympus）、酶標(biāo)儀（BioTek）、低溫高速離心機(jī)（Eppendorf）、電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（AppliedBiosystems）。（二）實(shí)驗(yàn)方法hADSCs的分離與培養(yǎng)：將獲取的脂肪組織用PBS沖洗去除血液及雜質(zhì)，剪成約1mm3的小塊，加入0.1%Ⅰ型膠原酶，37℃振蕩消化1h。消化結(jié)束后，加入等體積含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，1000r/min離心5min，棄上清。沉淀用PBS重懸，過70μm細(xì)胞篩，去除未消化的組織塊。濾液1000r/min離心5min，棄上清，沉淀用含10%FBS、1%雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸，接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后更換培養(yǎng)基，去除未貼壁細(xì)胞，此后每2-3天換液一次，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。實(shí)驗(yàn)分組：將第3代hADSCs以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板和6孔板中，培養(yǎng)24h待細(xì)胞貼壁后，分為對照組（加入等量PBS）和TIMP-1處理組（TIMP-1濃度分別為1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL），每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。CCK-8法檢測細(xì)胞增殖：分別在處理后的24h、48h、72h，每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2h，用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定吸光度（OD值），根據(jù)OD值評估細(xì)胞增殖情況。EdU標(biāo)記法檢測細(xì)胞增殖：按照EdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒說明書操作，在TIMP-1處理48h后，向培養(yǎng)基中加入EdU工作液，繼續(xù)培養(yǎng)2h。棄去培養(yǎng)基，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min，0.5%TritonX-100通透細(xì)胞10min，然后加入Click反應(yīng)液避光孵育30min。最后用DAPI染核，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，計(jì)算EdU陽性細(xì)胞比例，反映細(xì)胞增殖情況。Westernblot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)：TIMP-1處理72h后，棄去培養(yǎng)基，用PBS沖洗細(xì)胞2次，每孔加入100μLRIPA裂解液，冰上裂解30min。收集細(xì)胞裂解液，4℃、12000r/min離心15min，取上清，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。將等量蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉2h，加入一抗（β-actin、PCNA、CyclinD1、PI3K、AKT、p-AKT，均為1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，TBST洗膜3次，每次10min，加入二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1h。再次用TBST洗膜3次，每次10min，最后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光拍照，并用ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白與β-actin的灰度比值。qRT-PCR檢測相關(guān)基因表達(dá)：TIMP-1處理72h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入1mLTRIzol試劑，按照說明書提取總RNA。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，使用SYBRGreenPCRMasterMix進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。引物序列如下：β-actin（上游：5’-GAGCTACGAGCTGCCTGAC-3’，下游：5’-CAGCGGAACCGCTCATTG-3’）；PCNA（上游：5’-CAGCAGCAGAACGAGATGAA-3’，下游：5’-GTCATCCATCTTCTCCACCA-3’）；CyclinD1（上游：5’-GCTGGAGAACATCGAGAAGA-3’，下游：5’-AGGACCTGCTGATGTTCTGG-3’）；PI3K（上游：5’-GACCTGAAGGACGACATCAA-3’，下游：5’-CTGCTGTCAGCTGTCAGTTC-3’）；AKT（上游：5’-CTGGAGAAGATGGCGTTCTG-3’，下游：5’-GCGATGGATGTAGCCACAGA-3’）。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用2^-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。（三）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPadPrism8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），組間兩兩比較采用Tukey’s檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。三、結(jié)果（一）TIMP-1對hADSCs增殖的影響CCK-8檢測結(jié)果顯示（圖1），在處理24h時(shí)，各TIMP-1處理組與對照組相比，OD值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；處理48h后，1ng/mL和10ng/mLTIMP-1處理組OD值顯著高于對照組（P<0.05），且10ng/mL處理組效果更明顯，而100ng/mL和1000ng/mLTIMP-1處理組OD值與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；處理72h后，1ng/mL、10ng/mLTIMP-1處理組OD值仍顯著高于對照組（P<0.05），100ng/mL處理組OD值與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），1000ng/mLTIMP-1處理組OD值顯著低于對照組（P<0.05）。EdU標(biāo)記法檢測結(jié)果（圖2）與CCK-8法一致，48h時(shí)，1ng/mL和10ng/mLTIMP-1處理組EdU陽性細(xì)胞比例顯著高于對照組（P<0.05），100ng/mL和1000ng/mLTIMP-1處理組與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。（二）TIMP-1對hADSCs增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Westernblot檢測結(jié)果顯示（圖3），與對照組相比，10ng/mLTIMP-1處理組PCNA、CyclinD1蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），1000ng/mLTIMP-1處理組PCNA、CyclinD1蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。同時(shí)，10ng/mLTIMP-1處理組PI3K、p-AKT/AKT蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），1000ng/mLTIMP-1處理組PI3K、p-AKT/AKT蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。（三）TIMP-1對hADSCs增殖相關(guān)基因表達(dá)的影響qRT-PCR檢測結(jié)果顯示（圖4），與對照組相比，10ng/mLTIMP-1處理組PCNA、CyclinD1、PI3K、AKT基因表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），1000ng/mLTIMP-1處理組PCNA、CyclinD1、PI3K、AKT基因表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。四、討論本研究結(jié)果表明，TIMP-1對hADSCs的增殖具有濃度依賴性影響。低濃度（1ng/mL、10ng/mL）的TIMP-1能夠顯著促進(jìn)hADSCs的增殖，而高濃度（1000ng/mL）的TIMP-1則表現(xiàn)出抑制作用。CCK-8法和EdU標(biāo)記法從不同角度檢測細(xì)胞增殖，均驗(yàn)證了這一結(jié)果，說明TIMP-1對hADSCs增殖的影響具有可靠性。細(xì)胞增殖過程受到多種信號通路的調(diào)控，PI3K/AKT信號通路在細(xì)胞增殖、存活和代謝等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。本研究中，Westernblot和qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，低濃度TIMP-1處理能夠上調(diào)PI3K、AKT蛋白及基因的表達(dá)，同時(shí)增加p-AKT/AKT的比值，表明低濃度TIMP-1可能通過激活PI3K/AKT信號通路，促進(jìn)下游增殖相關(guān)蛋白PCNA、CyclinD1的表達(dá)，從而促進(jìn)hADSCs的增殖。而高濃度TIMP-1處理則下調(diào)PI3K、AKT蛋白及基因的表達(dá)，抑制PI3K/AKT信號通路的激活，進(jìn)而抑制hADSCs的增殖。TIMP-1作為MMPs的抑制劑，其對細(xì)胞增殖的影響可能還與細(xì)胞外基質(zhì)的調(diào)節(jié)有關(guān)。MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，影響細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的行為。TIMP-1抑制MMPs的活性后，可能改變細(xì)胞外基質(zhì)的組成和結(jié)構(gòu)，影響細(xì)胞的黏附、遷移和增殖等過程。在本研究中，TIMP-1對hADSCs增殖的影響是否與細(xì)胞外基質(zhì)的調(diào)節(jié)相關(guān)，還需要進(jìn)一步深入研究。此外，本研究僅探討了TIMP-1在體外對hADSCs增殖的影響，在體內(nèi)環(huán)境中，TIMP-1還可能受到多種因素的影響，其對hADSCs增殖的作用機(jī)制可能更為復(fù)雜。后續(xù)研究可以通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步探究TIMP-1在體內(nèi)對hADSCs增殖的影響及其作用機(jī)制，為hADSCs在組織工程和再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用提供更充分的理論依據(jù)。五、結(jié)論低濃度TIMP-1可通過激活PI3