學(xué)號(hào)16208040122超級(jí)核酸酶大腸桿菌高密度發(fā)酵工藝優(yōu)化研究【摘要】目的和意義非特異核酸內(nèi)切酶是一類高活性水解酶，具有廣闊的應(yīng)用前景，但由于目前商品化的核酸酶價(jià)格昂貴，其在生物制藥行業(yè)的大規(guī)模使用受到限制?？紤]到生產(chǎn)效率的提高和生產(chǎn)成本的降低，本實(shí)驗(yàn)主要是對實(shí)驗(yàn)室已建立的帶有SMNE融合蛋白的重組大腸桿菌進(jìn)行高密度發(fā)酵工藝優(yōu)化研究。方法與思路主要通過對重組大腸桿菌的培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)溫度、pH、誘導(dǎo)條件等進(jìn)行優(yōu)化，建立了重組大腸桿菌高密度發(fā)酵工藝。創(chuàng)新性本研究在大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)脫氧核糖核酸酶、大幅提高菌體密度及脫氧核糖核酸酶的表達(dá)量，實(shí)現(xiàn)了較高水平的重組大腸桿菌高密度培養(yǎng)，為重組大腸桿菌高密度培養(yǎng)在核酸酶中的應(yīng)用提供了新思路。【關(guān)鍵詞】重組大腸桿菌；高密度發(fā)酵；優(yōu)化；培養(yǎng)基；培養(yǎng)條件Studyonhighdensityfermentationtechnologyoptimizationofsupernucleaseescherichiacoli.[Abstract]Objectiveandsignificance：Non-specificendonucleaseisakindofhighlyactivehydrolase,whichhasabroadapplicationprospect.However,duetothehighpriceofcommercializednucleases,theirlarge-scaleuseinbiopharmaceuticalindustryislimited.Consideringtheimprovementofproductionefficiencyandthereductionofproductioncost,thisexperimentmainlystudiedthehighdensityfermentationprocessoptimizationofrecombinantescherichiacoliwithSMNEfusionproteinestablishedinthelaboratory.Methodsandideas：Thehighdensityfermentationtechnologyofrecombinantescherichiacoliwasestablishedbyoptimizingthemediumcompositionandcultureconditionsofrecombinantescherichiacoli.Innovation：Inthisstudy,theproductionofdeoxyribonucleaseinescherichiacolifermentationgreatlyincreasedthebacterialdensityandtheexpressionofdeoxyribonuclease,achievingahigherlevelofrecombinantescherichiacolihigh-densityculture,andprovidinganewideafortheapplicationofrecombinantescherichiacolihigh-densitycultureinnucleases[Keywords]RecombinantEscherichiacoli;Highdensityfermentation;culturemedium;Cultureconditions;optimize1立題依據(jù)1.1國內(nèi)外研究現(xiàn)狀分析非特異性核酸內(nèi)切酶是一類高活性水解酶，其最大特點(diǎn)是能夠非特異地降解幾乎所有類型的核酸，包括單鏈、雙鏈、線狀及環(huán)狀的DNA和RNA，且對核酸的序列沒有嚴(yán)格的要求[3]。到目前為止，研究人員已從病毒、細(xì)菌、真菌和動(dòng)物中分離得到30余種非特異性核酸酶[1]，其中，相對于核酸酶家族其他成員，粘質(zhì)沙雷氏菌胞外核酸酶（Serratiamarcescensnuclease，SMNE)的催化效率更快，是葡萄球菌核酸酶的4倍，牛胰DNase

I的34倍，故稱SMNE為超級(jí)核酸酶，或全能核酸酶[1,2]。Serratiamarcescens非特異性核酸酶（SMNE）具有廣闊的應(yīng)用前景[1-7]，能在多個(gè)方面發(fā)揮作用，具有對工作環(huán)境要求不嚴(yán)等特點(diǎn)，其應(yīng)用包括：降低生物制品，尤其是病毒類產(chǎn)品外源性核酸的質(zhì)量，減少過敏反應(yīng)，提高安全性；細(xì)胞裂解，可降低樣品的粘度，縮短處理時(shí)間，提高蛋白產(chǎn)量，離心時(shí)有利于沉淀和上清液的分離，超濾時(shí)有利于成分的分離，提高柱層析純化時(shí)的有效性；顆粒（病毒、包涵體等）預(yù)處理：有助于顆粒的純化；生物分析：在ELISA、柱層析、二維電泳和印跡分析中，可提高分辨率和回收率[3]。在生物技術(shù)領(lǐng)域中，SMNE的功能正進(jìn)一步深入的研究，其催化的高效性在蛋白質(zhì)純化過程中有很大的積極應(yīng)用價(jià)值，在消除核酸污染方面效果更加顯著。SMNE最初是由可致病的粘質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)生獲得。目前國內(nèi)外有多篇文獻(xiàn)報(bào)道了通過大腸桿菌重組制備獲得SMNE[2,3,8-10]，但從目前的公開的文獻(xiàn)來看，用大腸桿菌表達(dá)的SMNE表達(dá)產(chǎn)量普遍很低[2,3,8-10]，可能由于核酸酶對大腸桿菌自身核酸產(chǎn)生了較大影響。1.2實(shí)驗(yàn)?zāi)康募耙饬x目前市場上商品化的核酸酶以DnaseⅠ和BenzonaseNuclease為代表，DnaseⅠ來源于牛的胰腺，通常純度不高，成分復(fù)雜，降解DNA的效率不理想，BenzonaseNuclease由德國默克公司開發(fā)，純度高并活性好，但其價(jià)格非常昂貴，因此在生物制藥行業(yè)的大規(guī)模使用受到了限制[11]。過去，生物制藥公司希望以抑制和削減原料成本來提高公司產(chǎn)品的市場競爭力，因此自主開發(fā)廉價(jià)、高效的核酸酶成了必然。圖圖1M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)（低）；1：IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)SMNE融合蛋白宿主菌；2：表達(dá)SMNE宿主菌破碎后沉淀；3：表達(dá)SMNE宿主菌破碎后上清在工程菌的大規(guī)模發(fā)酵過程中，外源基因表達(dá)水平以及菌體密度決定了重組異源蛋白產(chǎn)物的宏觀合成量，理論上來說，在保持相同的外源基因表達(dá)水平的前提下，增加工程菌的發(fā)酵密度可以大大提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量，提高發(fā)酵效率，縮短生產(chǎn)周期，減少設(shè)備投資，從而降低生產(chǎn)成本，大大提高市場競爭力[12-13]。而大腸桿菌工程菌的高密度培養(yǎng)技術(shù)(highcelldensitycultivation,HCDC)就為解決這一需要應(yīng)運(yùn)而生。高密度培養(yǎng)技術(shù)對于提高生產(chǎn)效率、降低生產(chǎn)成本、簡化產(chǎn)品純化工藝、節(jié)約能源消耗、減少污水排放以及擴(kuò)大生產(chǎn)投資都具有非常重要的意義。1.3創(chuàng)新點(diǎn)指導(dǎo)教師彭禮飛老師課題組已建立了SMNE融合蛋白的原核表達(dá)系統(tǒng)，該融合蛋白帶有一段促進(jìn)表達(dá)的分子伴侶、方便純化的組氨酸Tag及切割去掉融合伴侶的腸激酶酶切位點(diǎn)。經(jīng)過優(yōu)化后，該表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)SMNE的效率（圖1）顯著高于國內(nèi)外可檢索到的文獻(xiàn)[2,3,8-10]。老師項(xiàng)目組自產(chǎn)的SMNE自用于發(fā)酵產(chǎn)物破碎后的降解核酸酶，活性很高，顯著提高了目的產(chǎn)物的純化效率，并節(jié)省了大筆的核酸酶費(fèi)用。由于SMNE具有較好的應(yīng)用前景，因此，本課題的目的是在前述基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化SMNE高密度發(fā)酵的技術(shù)方案，為將來規(guī)?；苽涓呒兌龋兌?gt;95%、內(nèi)毒素<1.0U/mg）的rSMNE以應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。2.實(shí)驗(yàn)方案2.1發(fā)酵培養(yǎng)基成分的優(yōu)化目前大腸桿菌高密度發(fā)酵所使用的培養(yǎng)基一般為半合成培養(yǎng)基[14]。半合成培養(yǎng)基是在合成培養(yǎng)基中添加了適量的碳、氮、無機(jī)鹽、維生素等基質(zhì)而形成的，這些基質(zhì)有促進(jìn)細(xì)胞生長代謝或形成產(chǎn)物的作用。在使用半合成培養(yǎng)基進(jìn)行大腸桿菌高密度發(fā)酵時(shí)，通常需要加入其他營養(yǎng)物質(zhì)來促進(jìn)菌體生長及代謝產(chǎn)物的形成[15]。培養(yǎng)基中通常含有碳源和氮源，以及維生素和微量元素等營養(yǎng)物，這些營養(yǎng)物的濃度與比例對重組微生物的高密度發(fā)酵具有重要意義。培養(yǎng)基各組分的濃度和比例要適當(dāng)，各組分的濃度上限分別為：葡萄糖48g/L、氮2.9g/L、Mg2+8.8g/L、Fe2+1.13g/L、PO43-9.5g/L、Zn2+0.039g/L[16]。本次實(shí)驗(yàn)選取基礎(chǔ)培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，然后以此為基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)一系列優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，確定培養(yǎng)基中各組分的最優(yōu)配比。2.2重組大腸桿菌發(fā)酵條件的優(yōu)化通過優(yōu)化一系列相關(guān)的發(fā)酵因素來實(shí)現(xiàn)經(jīng)過高密度發(fā)酵得到高濃度產(chǎn)品的目標(biāo)。在最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基配方確定的條件下，利用單因素法分別對培養(yǎng)基初始pH值、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間和接種量等進(jìn)行優(yōu)化，分析相應(yīng)因素對發(fā)酵菌液的影響，確定最優(yōu)發(fā)酵參數(shù)[17]。以及探究誘導(dǎo)時(shí)機(jī)和誘導(dǎo)時(shí)長對重組大腸桿菌高密度發(fā)酵的影響。2.3重組大腸桿菌高密度發(fā)酵條件摸索及驗(yàn)證結(jié)合上述內(nèi)容2.1的優(yōu)化培養(yǎng)基和內(nèi)容2.2所探究的最佳發(fā)酵條件進(jìn)行高密度發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的摸索及驗(yàn)證，以提高發(fā)酵效率。2.4技術(shù)路線甘油菌的活化以及擴(kuò)大培養(yǎng)甘油菌的活化以及擴(kuò)大培養(yǎng)擴(kuò)大培養(yǎng)菌液的誘導(dǎo)表達(dá)和產(chǎn)物電泳檢測擴(kuò)大培養(yǎng)菌液的誘導(dǎo)表達(dá)和產(chǎn)物電泳檢測發(fā)酵罐和發(fā)酵培養(yǎng)基的滅菌發(fā)酵罐和發(fā)酵培養(yǎng)基的滅菌使用發(fā)酵罐進(jìn)行高密度培養(yǎng)使用發(fā)酵罐進(jìn)行高密度培養(yǎng)菌液的誘導(dǎo)表達(dá)菌液的誘導(dǎo)表達(dá)收菌收菌3.發(fā)酵培養(yǎng)基成分的優(yōu)化3.1實(shí)驗(yàn)材料與儀器3.1.1菌種來源彭禮飛教授課題組保存的已構(gòu)建好的菌株pstaby1.2-trx-Nuclease3.1.2主要試劑微量元素溶液（1L）:2.5mgCocl2.H20、1.5mgCuCl2.2H2O、3mgH3BO3、2.5mgNa2MoO4.H2O、8mgZn(CH3COO)2.2H2O、804mgFitriplexⅢ、60mgFe(Ⅲ)citrate、12.3mgMnCl2.2H2O、15.04mgMnCl2.4H2O、4.5mg維生素B(4℃保存)氨芐青霉素（Amp）:制備濃度為100mg/mL，過濾除菌，-20℃分裝保存3.1.3主要儀器超凈工作臺(tái)、高壓滅菌鍋、恒溫振蕩培養(yǎng)箱、紫外分光光度計(jì)、PH計(jì)、超低溫冰箱、5L發(fā)酵罐、超速冷凍離心機(jī)3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1培養(yǎng)基配制（1）活化培養(yǎng)基氨芐青霉素抗性固體LB培養(yǎng)基（1L）：蛋白胨10g/L、NaCl10g/L、酵母粉5g/L、瓊脂粉15g/L、2.5mL氨芐青霉素（2）種子培養(yǎng)基氨芐青霉素抗性LB培養(yǎng)基（1L）：蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、NaCl10g/l、2.5mL氨芐青霉素（3）搖瓶培養(yǎng)基氨芐青霉素抗性LB培養(yǎng)基（1L）：蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、NaCl10g/l、2.5mL氨芐青霉素（4）優(yōu)化培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基磷酸二氫鉀13.3g/L、磷酸氫二銨4g/L、檸檬酸1.7g/L、葡萄糖10g/L、七水合硫酸鎂1.2g/L以上培養(yǎng)基配置完后均高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)121℃滅菌25min3.2.2發(fā)酵培養(yǎng)（1）菌種活化實(shí)驗(yàn)室將菌種保存于-80℃菌株管（含甘油，）內(nèi)，由于其活性低，需要先將菌種活化。取實(shí)驗(yàn)室保存的菌種接種于含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h。（2）種子培養(yǎng)用接種環(huán)在含有氨芐青霉素的平板上挑取3個(gè)單菌落，于3支標(biāo)號(hào)為①②③的分別裝有3mlLB培養(yǎng)基的試管中，37℃、150r/min振蕩培養(yǎng)6h。（3）搖瓶培養(yǎng)觀察三支試管，選取菌體濃度較大的兩支試管，將其轉(zhuǎn)入裝有250mlLB液體培養(yǎng)基（含2.5微升氨芐青霉素）的錐形瓶中，標(biāo)號(hào)④⑤，37℃220r/min振蕩過夜培養(yǎng)。（4）發(fā)酵罐發(fā)酵發(fā)酵罐空罐洗凈后，裝入配制好的發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中加入500uL消泡劑，在高壓蒸汽滅菌鍋里121℃滅菌30min。滅菌完成后裝配好發(fā)酵罐，選取兩搖瓶中菌體密度大的一瓶接入發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，并且在重組菌培養(yǎng)過程中每隔1小時(shí)使用紫外分光光度儀測定一次OD600值，在發(fā)酵罐中細(xì)菌生長達(dá)到菌體濃度OD600值適當(dāng)時(shí)加入誘導(dǎo)劑IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。（5）發(fā)酵罐補(bǔ)料方式重組菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)外源蛋白的關(guān)鍵技術(shù)是補(bǔ)料策略,不同的補(bǔ)料流加方式對同一種菌的生長以及外源蛋白的表達(dá)影響不同[18]。目前,人們在葡萄糖對質(zhì)粒產(chǎn)量和穩(wěn)定性方面進(jìn)行了深入的研究。一般認(rèn)為葡萄糖是一種比較理想的碳源[19]。本實(shí)驗(yàn)以葡萄糖作為補(bǔ)料，采用恒速流加補(bǔ)料培養(yǎng)方式。以20%氨水自動(dòng)調(diào)節(jié)pH。（6）收集菌體誘導(dǎo)結(jié)束后收集菌液，將菌液在超速冷凍離心機(jī)以4℃、8000×g離心20min，棄上清，收集菌體沉淀，準(zhǔn)確稱取后分裝與-20℃保存。3.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.3.1不同碳源對重組大腸桿菌生長的影響選取葡萄糖、乳糖和蔗糖三種做為常見碳源，將這三種常見碳源分別以10g/L加入LB培養(yǎng)基中，接種重組菌并在37℃、220r/min條件下培養(yǎng)8h，測定菌體濕重和OD600，實(shí)驗(yàn)結(jié)果做表如表1表1.不同碳源對重組大腸桿菌生長的影響碳源種類菌體濕重OD600葡萄糖乳糖蔗糖3.3.2不同氮源對重組大腸桿菌生長的影響將濃度為10g/L的葡萄糖作為培養(yǎng)基的碳源，添加量以氮元素摩爾數(shù)相等為依據(jù)[20]，將牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、硫酸銨作為不同氮源加入到培養(yǎng)基中，接種重組菌，并在37℃、220r/min培養(yǎng)8h，測定菌體濕重和OD600，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2表2.不同氮源對重組大腸桿菌生長的影響氮源種類菌體濕重OD600蛋白胨 牛肉膏酵母粉硫酸銨3.3.3微量元素對重組大腸桿菌生長的影響選取微量元素混合液的量分別為0、0.25mL/L、0.5mL/L、0.75mL/L、1.0mL/L、1.25mL/L、1.50mL/L，添加到培養(yǎng)基中，接種重組菌，并在37℃、220r/min培養(yǎng)8h，測定菌體濕重和OD600，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為表3表3.微量元素對重組大腸桿菌生長的影響微量元素菌體濕重OD60000.25mL/L0.5mL/L0.75mL/L1.0mL/L1.25mL/L1.50mL/L3.3.4不同無機(jī)鹽對重組大腸桿菌生長的影響一些無機(jī)鹽與合成胞外產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)平衡有關(guān)，起到穩(wěn)定目標(biāo)產(chǎn)物的作用。加入K+，Cu2+，Co2+，Mn2+，Zn2+等可以促進(jìn)細(xì)胞代謝，有利于細(xì)菌的生長和外源蛋白的高表達(dá)[21]。本實(shí)驗(yàn)選取硫酸鎂、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀和氯化鈣四種無機(jī)鹽分別添加到培養(yǎng)基中，接種重組菌，并在37℃、220r/min培養(yǎng)8h，并測定菌體濕重和OD600，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4表4.不同無機(jī)鹽對重組大腸桿菌生長的影響無機(jī)鹽種類菌體濕重OD600硫酸鎂磷酸氫二鈉磷酸二氫鉀氯化鈣3.3.5基礎(chǔ)培養(yǎng)基、優(yōu)化培養(yǎng)基對重組大腸桿菌生長的影響選擇基礎(chǔ)培養(yǎng)基和優(yōu)化培養(yǎng)基分別接種重組菌，在37℃、220r/min培養(yǎng)8h，進(jìn)行菌體生長密度比較實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證優(yōu)化培養(yǎng)基對重組大腸桿菌生長的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5表5.不同培養(yǎng)基對重組大腸桿菌生長的影響培養(yǎng)基種類菌體濕重OD600基礎(chǔ)培養(yǎng)基 優(yōu)化培養(yǎng)基4重組大腸桿菌發(fā)酵條件的優(yōu)化4.1實(shí)驗(yàn)材料與儀器同3.1實(shí)驗(yàn)材料與儀器4.2實(shí)驗(yàn)方法同3.2實(shí)驗(yàn)方法通過培養(yǎng)基的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)獲得了重組大腸桿菌發(fā)酵的優(yōu)化培養(yǎng)基，以此培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，用搖瓶培養(yǎng)方式進(jìn)行重組大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)條件關(guān)于接種量、初始pH值、發(fā)酵溫度、誘導(dǎo)劑濃度以及誘導(dǎo)時(shí)機(jī)和誘導(dǎo)時(shí)長的研究。4.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.3.1不同接種量對重組大腸桿菌生長的影響選取接種量分別為2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%進(jìn)行發(fā)酵，測定培養(yǎng)時(shí)間為0h、2h、4h、6h、8h時(shí)的菌體密度，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果表6，對比確定最佳接種量。表6.不同接種量時(shí)重組大腸桿菌的菌體密度接種量OD6000h2h4h6h8h2% 3%4%5%6%7%8%4.3.2不同初始pH值對重組大腸桿菌生長的影響選取不同初始pH值，分別設(shè)置為6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6進(jìn)行發(fā)酵，測定培養(yǎng)時(shí)間為0h、2h、4h、6h、8h時(shí)的菌體密度，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果為表7，確定培養(yǎng)基最佳初始pH值。表7.不同初始pH值時(shí)重組大腸桿菌的菌體密度pH值OD6000h2h4h6h8h4.3.3不同發(fā)酵溫度對重組大腸桿菌生長的影響將發(fā)酵溫度維持在33℃、34℃、35℃、36℃、37℃，測定培養(yǎng)時(shí)間為0h、2h、4h、6h、8h時(shí)菌體的生長密度，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果為表8，確定最佳培養(yǎng)溫度表8.不同發(fā)酵溫度時(shí)重組大腸桿菌的菌體密度發(fā)酵溫度OD6000h2h4h6h8h33℃ 34℃35℃36℃37℃4.3.4不同誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對重組大腸桿菌生長的影響在菌體生長時(shí)，選擇OD600值為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0時(shí)，使用IPTG（濃度為100mg/mL）進(jìn)行誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)5h候測定菌體密度。記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果為表9，對比選取最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)。表9.不同OD600值誘導(dǎo)5h后菌體密度OD6002.02.53.03.54.04.55.05h后菌體密度4.3.5不同誘導(dǎo)時(shí)長對重組大腸桿菌生長的影響在菌體生長達(dá)到最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)時(shí)，使用誘導(dǎo)劑IPTG（濃度為）進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時(shí)長分別為2h、4h、6h、8h、10h和12h，分別測定OD600。記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果表10.，對比選取最佳誘導(dǎo)時(shí)長。表10.不同誘導(dǎo)時(shí)長時(shí)菌體密度OD600誘導(dǎo)時(shí)長2h4h6h8h10h12hOD6004.3.6不同濃度誘導(dǎo)劑對重組大腸桿菌生長表達(dá)的影響在菌體生長達(dá)到最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)時(shí)，選取濃度分別為50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL、100mg/mL的誘導(dǎo)劑IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)5小時(shí)候測定菌體密度。記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果為表11，對比選取最佳誘導(dǎo)劑濃度。表11.加入不同誘導(dǎo)劑濃度培養(yǎng)5h后OD600IPTG濃度5060708090100（mg/mL）OD600根據(jù)以上研究實(shí)驗(yàn)，最終確定重組大腸桿菌的高密度發(fā)酵的最佳培養(yǎng)條件。5.重組大腸桿菌高密度發(fā)酵條件摸索及驗(yàn)證5.1實(shí)驗(yàn)材料與儀器同3.1實(shí)驗(yàn)材料與儀器5.2實(shí)驗(yàn)方法同3.2實(shí)驗(yàn)材料與儀器發(fā)酵罐中裝入3L發(fā)酵罐培養(yǎng)基，通氣量1L/min，初始溫度35℃、pH6.8、溶氧在20%-50%范圍內(nèi)時(shí)接種種子液5%，初始攪拌速率為50rpm，攪拌速率根據(jù)溶氧變化進(jìn)行調(diào)節(jié)。5.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果5.3.1pH值對重組大腸桿菌高密度發(fā)酵的影響設(shè)定溶氧為40%，發(fā)酵溫度為35℃，選取pH值分別為6.6、6.8、7.0、7.2、7.4培養(yǎng)，每隔2h測定一次菌體密度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄表12表12.pH值對高密度培養(yǎng)重組大腸桿菌生長的影響pHOD6004h6h8h10h12h14h16h18h20h.2發(fā)酵溫度對重組大腸桿菌高密度發(fā)酵的影響設(shè)定溶氧為40%，pH值為6.8，選取發(fā)酵溫度分別為34℃、35℃、36℃、37℃、38℃培養(yǎng)，并每隔2h測定菌體密度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄表13表13.發(fā)酵溫度對高密度培養(yǎng)重組大腸桿菌生長的影響發(fā)酵溫度OD6004h6h8h10h12h14h16h18h20h34℃35℃36℃37℃38℃5.3.3不同溶氧量對重組大腸桿菌高密度發(fā)酵的影響設(shè)定發(fā)酵溫度為35℃，pH值為6.8，選取10%、20%、30%、40%、50%培養(yǎng)，并每隔2h測定一次菌體密度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄表14表14.溶氧量對高密度培養(yǎng)重組大腸桿菌生長的影響溶氧量OD6004h6h8h10h12h14h16h18h20h10%20%30%40%50%根據(jù)表12、13、14，最終可確定發(fā)酵罐中重組大腸桿菌高密度發(fā)酵的最佳培養(yǎng)條件。6前期研究基礎(chǔ)指導(dǎo)教師彭禮飛老師課題組已建立了SMNE融合蛋白的原核表達(dá)系統(tǒng)，該融合蛋白帶有一段促進(jìn)表達(dá)的分子伴侶、方便純化的組氨酸Tag及切割去掉融合伴侶的腸激酶酶切位點(diǎn)。并且項(xiàng)目組內(nèi)已經(jīng)成功發(fā)酵收獲了該工程菌。7可行性分析7.1理論可行性已通過查閱文獻(xiàn)資料了解了大腸桿菌工程菌的高密度培養(yǎng)技術(shù)，并根據(jù)資料設(shè)計(jì)了一系列對高密度發(fā)酵工藝的優(yōu)化方案。7.2技術(shù)可行性本人已在彭禮飛教授課題組受到了關(guān)于發(fā)酵的科研訓(xùn)練，已熟練掌握細(xì)菌培養(yǎng)等基本技術(shù)。且目前仍在彭禮飛老師指導(dǎo)下開展本項(xiàng)研究。7.3條件可行性項(xiàng)目組指導(dǎo)教師彭禮飛老師課題組已建立了SMNE融合蛋白的原核表達(dá)系統(tǒng)，并且本實(shí)驗(yàn)依托廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室及彭禮飛老師課題組，開展實(shí)驗(yàn)所需儀器設(shè)備條件實(shí)驗(yàn)室均能提供。8創(chuàng)新性分析本實(shí)驗(yàn)使用了指導(dǎo)教師彭禮飛教授課題組已構(gòu)建的帶有SMNE融合蛋白的重組大腸桿菌進(jìn)行高密度發(fā)酵工藝的優(yōu)化，包括對培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，從而達(dá)到目的。9預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果（1）確定了重組大腸桿菌高密度發(fā)酵的培養(yǎng)基配方（2）確定了重組大腸桿菌發(fā)酵的最佳培養(yǎng)條件（3）采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件對重組大腸桿菌進(jìn)行高密度發(fā)酵從而得高產(chǎn)量的重組菌。參考文獻(xiàn)[1]張瑜,鄭偉,顧劍飛,等.Serratia

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