夏龍方對NCI-N87胃癌生長轉(zhuǎn)移的作用剖析與機(jī)制探尋一、引言1.1研究背景胃癌作為全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)年全球胃癌新發(fā)病例約108.9萬例，死亡病例約76.9萬例，分別位居所有惡性腫瘤的第5位和第4位。在中國，胃癌同樣是發(fā)病率和死亡率均居前列的惡性腫瘤，由于人口基數(shù)大，中國的胃癌患者數(shù)量在全球占比較高，疾病負(fù)擔(dān)沉重。早期胃癌患者多無明顯癥狀，或僅有一些非特異性表現(xiàn)，如消化不良、上腹部隱痛等，容易被忽視。當(dāng)出現(xiàn)明顯癥狀時，如腹痛、消瘦、嘔血、黑便等，多數(shù)患者已處于中晚期。中晚期胃癌患者往往發(fā)生了局部浸潤或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，這極大地增加了治療難度，顯著降低了患者的5年生存率。目前，手術(shù)切除聯(lián)合化療仍是胃癌的主要治療策略。對于早期胃癌，根治性手術(shù)切除有可能實現(xiàn)臨床治愈，但術(shù)后仍存在一定的復(fù)發(fā)風(fēng)險。而對于中晚期胃癌，單純手術(shù)治療效果不佳，常需要結(jié)合化療、放療、靶向治療等綜合治療手段。然而，化療過程中面臨著諸多挑戰(zhàn)，其中藥物耐受性和腫瘤轉(zhuǎn)移是限制化療療效的關(guān)鍵因素。隨著化療療程的增加，腫瘤細(xì)胞對化療藥物逐漸產(chǎn)生耐藥性，使得藥物無法有效殺傷腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致化療失敗。腫瘤轉(zhuǎn)移更是導(dǎo)致胃癌患者預(yù)后不良的重要原因，一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，患者的生存時間和生活質(zhì)量會急劇下降。因此，尋找新的治療策略和藥物成為胃癌研究領(lǐng)域的迫切需求。近年來，中藥在抗腫瘤治療方面逐漸受到廣泛關(guān)注。中藥具有多成分、多靶點、整體調(diào)節(jié)的特點，在抑制腫瘤生長、轉(zhuǎn)移，提高機(jī)體免疫力，減輕放化療不良反應(yīng)等方面展現(xiàn)出獨特優(yōu)勢。夏龍方作為一種傳統(tǒng)中藥方劑，具有廣泛的藥理活性，前期研究已初步表明其具有一定的抗腫瘤作用。深入探討夏龍方對NCI-N87胃癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的影響，并闡明其作用機(jī)制，有望為胃癌的治療提供新的思路和潛在的治療藥物，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。1.2研究目的與問題提出本研究旨在深入探究夏龍方對NCI-N87胃癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的作用，并全面解析其潛在的作用機(jī)制。具體而言，主要圍繞以下幾個關(guān)鍵問題展開研究：夏龍方對NCI-N87胃癌細(xì)胞生長的影響：通過一系列體外細(xì)胞實驗，運用CCK-8法、EdU染色法等經(jīng)典實驗方法，精準(zhǔn)測定不同濃度的夏龍方在不同作用時間下，對NCI-N87胃癌細(xì)胞增殖能力的影響。同時，借助細(xì)胞周期分析技術(shù)，深入探究夏龍方是否通過調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程，從而抑制胃癌細(xì)胞的生長。例如，觀察夏龍方處理后，細(xì)胞在G0/G1期、S期、G2/M期的分布比例變化，明確其對細(xì)胞周期的阻滯作用階段。在體內(nèi)實驗方面，構(gòu)建NCI-N87胃癌細(xì)胞裸鼠移植瘤模型，給予不同劑量的夏龍方進(jìn)行干預(yù)，定期測量腫瘤體積和重量，繪制腫瘤生長曲線，直觀評估夏龍方對腫瘤生長的抑制效果，為其在體內(nèi)的抗胃癌作用提供直接證據(jù)。夏龍方對NCI-N87胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響：利用Transwell小室實驗，結(jié)合細(xì)胞遷移和侵襲實驗，詳細(xì)觀察夏龍方對NCI-N87胃癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。通過在小室上室接種胃癌細(xì)胞，下室加入含不同濃度夏龍方的培養(yǎng)基，培養(yǎng)一定時間后，計數(shù)穿過小室膜的細(xì)胞數(shù)量，以此量化細(xì)胞的遷移和侵襲能力變化。此外，采用劃痕愈合實驗，在細(xì)胞單層上制造劃痕，觀察在夏龍方作用下，細(xì)胞遷移填充劃痕的速度和程度，進(jìn)一步驗證其對細(xì)胞遷移能力的抑制作用。在體內(nèi)實驗中，觀察裸鼠移植瘤模型中腫瘤的轉(zhuǎn)移情況，如肺、肝等遠(yuǎn)處器官的轉(zhuǎn)移灶數(shù)量和大小，分析夏龍方對腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制效果。夏龍方影響NCI-N87胃癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制：運用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)和實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-timePCR）技術(shù)，檢測與腫瘤生長、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的信號通路蛋白和基因的表達(dá)變化。重點關(guān)注PI3K/Akt、MAPK等經(jīng)典信號通路，以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。例如，檢測在夏龍方處理后，PI3K、Akt、p-Akt、ERK、p-ERK等蛋白的磷酸化水平變化，以及E-cadherin、N-cadherin、Vimentin等EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)改變，深入揭示夏龍方抑制胃癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。1.3研究創(chuàng)新點與價值1.3.1創(chuàng)新點研究視角創(chuàng)新：本研究聚焦于傳統(tǒng)中藥方劑夏龍方對NCI-N87胃癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制探究。目前，雖然中藥在抗腫瘤領(lǐng)域的研究逐漸增多，但針對夏龍方這一特定方劑對胃癌細(xì)胞作用機(jī)制的深入研究仍相對匱乏。從這一獨特視角出發(fā)，有望為中藥抗胃癌研究開拓新的思路和方向，填補(bǔ)該方劑在胃癌作用機(jī)制研究方面的空白。實驗設(shè)計創(chuàng)新：采用體外細(xì)胞實驗與體內(nèi)動物實驗相結(jié)合的方式，全面、系統(tǒng)地評估夏龍方的抗胃癌效果。在體外實驗中，運用多種經(jīng)典實驗方法，如CCK-8法、EdU染色法、Transwell小室實驗、劃痕愈合實驗等，從細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等多個層面研究夏龍方對NCI-N87胃癌細(xì)胞的影響，確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。在體內(nèi)實驗中，構(gòu)建NCI-N87胃癌細(xì)胞裸鼠移植瘤模型，觀察夏龍方對腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的抑制作用，使研究更貼近臨床實際情況。此外，通過檢測與腫瘤生長、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的信號通路蛋白和基因的表達(dá)變化，深入揭示夏龍方的作用機(jī)制，這種多維度、多層次的實驗設(shè)計有助于更全面地了解夏龍方的抗胃癌作用。機(jī)制研究創(chuàng)新：在探究夏龍方作用機(jī)制時，不僅關(guān)注常見的PI3K/Akt、MAPK等信號通路，還深入研究其對上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。EMT在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中起著關(guān)鍵作用，目前中藥對胃癌細(xì)胞EMT影響的研究尚處于探索階段。本研究從這一關(guān)鍵環(huán)節(jié)入手，有望發(fā)現(xiàn)夏龍方抑制胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的新機(jī)制，為中藥抗胃癌轉(zhuǎn)移研究提供新的靶點和理論依據(jù)。1.3.2研究價值理論價值：本研究將為胃癌的發(fā)病機(jī)制研究提供新的視角和理論依據(jù)。通過深入探究夏龍方對NCI-N87胃癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制，有助于進(jìn)一步揭示胃癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，豐富對胃癌生物學(xué)行為的認(rèn)識。同時，研究結(jié)果也將為中藥抗腫瘤作用機(jī)制的研究提供有益的參考，推動中藥抗腫瘤理論的發(fā)展，為后續(xù)相關(guān)研究奠定堅實的理論基礎(chǔ)。實踐價值：從臨床實踐角度來看，本研究成果具有潛在的應(yīng)用價值。如果夏龍方被證實能夠有效抑制NCI-N87胃癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，那么它有可能成為一種新的胃癌治療藥物或輔助治療手段。這將為胃癌患者提供更多的治療選擇，有助于提高胃癌的治療效果，改善患者的預(yù)后和生活質(zhì)量。此外，本研究中所采用的實驗方法和研究思路，也可為其他中藥方劑的抗腫瘤研究提供借鑒和參考，促進(jìn)中藥在腫瘤治療領(lǐng)域的臨床應(yīng)用和推廣。二、夏龍方與NCI-N87胃癌細(xì)胞概述2.1夏龍方的成分與藥理特性夏龍方是一種傳統(tǒng)中藥方劑，其成分復(fù)雜，包含多種天然藥材，主要成分有黃芪、當(dāng)歸、地龍、水蛭等。這些藥材在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中均具有獨特的藥用價值，它們相互配伍，協(xié)同發(fā)揮作用，賦予了夏龍方廣泛的藥理活性。黃芪，作為夏龍方中的重要成分之一，富含黃芪皂苷、黃芪多糖等多種活性成分。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃芪具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用，它可以促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖和分化，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力，從而提高機(jī)體的抵抗力，幫助機(jī)體抵御腫瘤細(xì)胞的侵襲。黃芪還具有抗氧化作用，能夠清除體內(nèi)過多的自由基，減少氧化應(yīng)激對細(xì)胞的損傷，維持細(xì)胞的正常生理功能。在心血管系統(tǒng)方面，黃芪可以擴(kuò)張血管，降低血液黏稠度，改善血液循環(huán)，對心血管疾病具有一定的預(yù)防和治療作用。當(dāng)歸含有揮發(fā)油、阿魏酸、多糖等多種化學(xué)成分。其揮發(fā)油成分具有調(diào)節(jié)血脂的作用，能夠降低血液中膽固醇、甘油三酯等脂質(zhì)的含量，減少動脈粥樣硬化的發(fā)生風(fēng)險。阿魏酸則具有抗血小板聚集的作用，可抑制血小板的活化和聚集，防止血栓形成，對心腦血管疾病的預(yù)防和治療具有重要意義。當(dāng)歸多糖能夠調(diào)節(jié)免疫功能，增強(qiáng)機(jī)體的抗病能力，同時還具有一定的抗腫瘤活性，能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長和增殖。地龍主要含有氨基酸類、多肽類、核苷類和脂肪酸類等化學(xué)成分。其中，氨基酸類成分包括人體必需氨基酸在內(nèi)的20余種氨基酸，這些氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，參與機(jī)體的各種生理代謝過程。多肽類成分如蚓激酶、蚯蚓素等具有抗炎、抗血栓等藥理活性。蚓激酶能夠溶解血栓，改善血液循環(huán)，對血栓性疾病的治療具有重要作用；蚯蚓素則具有抗菌、抗炎的功效，能夠減輕炎癥反應(yīng)，緩解疼痛。核苷類成分如腺苷、尿苷等在臨床上常被用于治療病毒性疾病，具有抗病毒、調(diào)節(jié)免疫等作用。地龍中的脂肪酸類成分，如不飽和脂肪酸，具有顯著的抗炎、抗腫瘤和調(diào)節(jié)血脂的藥理活性，能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，降低血脂水平，預(yù)防心血管疾病。水蛭富含水蛭素、肝素等多種生物活性物質(zhì)。水蛭素是一種天然的凝血酶抑制劑，具有很強(qiáng)的抗凝血作用，能夠抑制凝血酶的活性，阻止血液凝固，從而預(yù)防和治療血栓性疾病。肝素也具有抗凝血、降血脂等作用，能夠降低血液黏稠度，改善血液循環(huán)，減少血栓形成的風(fēng)險。從整體上看，夏龍方中多種藥材的活性成分相互協(xié)同，使其具有抗炎、抗血栓、調(diào)節(jié)免疫和抗腫瘤等多種藥理作用。在抗炎方面，方中的地龍、當(dāng)歸等成分通過抑制炎癥因子的釋放和炎癥細(xì)胞的浸潤，減輕炎癥反應(yīng)，緩解炎癥相關(guān)的癥狀。在抗血栓方面，水蛭、地龍等成分通過抑制血小板聚集、溶解血栓等機(jī)制，改善血液的高凝狀態(tài)，預(yù)防和治療血栓性疾病。在調(diào)節(jié)免疫方面，黃芪、當(dāng)歸等成分能夠增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，提高機(jī)體對病原體和腫瘤細(xì)胞的抵抗力。在抗腫瘤方面，夏龍方可能通過多種途徑發(fā)揮作用，如抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移等。相關(guān)研究表明，夏龍方能夠抑制某些腫瘤細(xì)胞的生長，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，并且能夠調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，抑制腫瘤血管生成，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。這些藥理作用為夏龍方在腫瘤治療領(lǐng)域的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。2.2NCI-N87胃癌細(xì)胞特性NCI-N87細(xì)胞是一種人胃癌細(xì)胞系，源于肝轉(zhuǎn)移胃癌。該細(xì)胞呈現(xiàn)上皮細(xì)胞樣形態(tài)，在體外培養(yǎng)時表現(xiàn)為貼壁生長特性。其生長需要特定的培養(yǎng)條件，通常使用RPMI-1640培養(yǎng)基，并添加10%的優(yōu)質(zhì)胎牛血清以及1%的雙抗，在37℃、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱環(huán)境中培養(yǎng)。在生物學(xué)特性方面，NCI-N87細(xì)胞表達(dá)表面糖蛋白癌胚抗原（CEA）和TAG72，這兩種標(biāo)志物在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及診斷中具有重要意義。CEA是一種廣譜腫瘤標(biāo)志物，在多種惡性腫瘤中表達(dá)升高，其在NCI-N87細(xì)胞中的表達(dá)，提示該細(xì)胞具有一定的腫瘤生物學(xué)行為特征。TAG72同樣是一種與腫瘤相關(guān)的抗原，它在腫瘤細(xì)胞的黏附、轉(zhuǎn)移等過程中可能發(fā)揮作用。NCI-N87細(xì)胞沒有左旋多巴胺脫羧酶（DDC）活性，其血管活性的腸肽（VIP）受體活性極低并缺乏胃泌激素受體，但表達(dá)蕈毒堿膽堿受體。從基因表達(dá)層面來看，沒有證據(jù)表明存在N-myc、L-myc、myb和EGF受體基因的重組，該細(xì)胞株表達(dá)的c-myc和c-erb-B2RNA水平與其它細(xì)胞株相當(dāng)，且N-myc、L-myc、c-cis、IGF-2或胃泌激素釋放肽等基因不表達(dá)。據(jù)報道，NCI-N87細(xì)胞的植板率為4.3%，這一特性對于研究細(xì)胞的克隆形成能力以及在體外構(gòu)建細(xì)胞模型具有重要參考價值。由于NCI-N87細(xì)胞具有典型的胃癌細(xì)胞生物學(xué)特性，在胃癌研究領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。在研究胃癌的發(fā)病機(jī)制方面，通過對NCI-N87細(xì)胞的基因表達(dá)譜分析、信號通路研究等，可以深入了解胃癌細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等過程的調(diào)控機(jī)制，為揭示胃癌的發(fā)病機(jī)制提供重要線索。在治療方法研究中，NCI-N87細(xì)胞可用于評估各種抗癌藥物的療效和作用機(jī)制。例如，研究新型化療藥物對NCI-N87細(xì)胞的增殖抑制作用、誘導(dǎo)凋亡作用，以及對細(xì)胞周期的影響等，為篩選和開發(fā)有效的胃癌治療藥物提供實驗依據(jù)。它還可用于研究中藥對胃癌細(xì)胞的作用，如探究某些中藥提取物或復(fù)方對NCI-N87細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)移的抑制作用及其機(jī)制，為中藥抗胃癌的研究提供細(xì)胞模型。在胃癌的靶向治療研究中，以NCI-N87細(xì)胞為研究對象，探索針對其特異性分子靶點的治療策略，有助于開發(fā)更加精準(zhǔn)、有效的靶向治療藥物。三、研究設(shè)計與方法3.1實驗材料準(zhǔn)備3.1.1細(xì)胞株人胃癌細(xì)胞系NCI-N87購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）。收到細(xì)胞后，立即將其復(fù)蘇并培養(yǎng)于含有10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清（FBS，購自Gibco公司）、1%雙抗（青霉素-鏈霉素混合液，購自Solarbio公司）的RPMI-1640培養(yǎng)基（購自Hyclone公司）中。將細(xì)胞置于37℃、5%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱（購自ThermoFisherScientific公司）中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至對數(shù)期時，進(jìn)行傳代或凍存。傳代時，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液（購自Solarbio公司）消化細(xì)胞，按照1:3-1:4的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。定期對細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和支原體檢測，確保細(xì)胞狀態(tài)良好且無支原體污染。3.1.2試劑夏龍方：按照傳統(tǒng)方劑的配伍比例，稱取黃芪、當(dāng)歸、地龍、水蛭等藥材，委托專業(yè)中藥制劑公司進(jìn)行提取和濃縮，制成含生藥濃度為1g/mL的夏龍方濃縮液，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用時，用無菌PBS將其稀釋至所需濃度。CCK-8試劑盒：購自Dojindo公司。該試劑盒用于檢測細(xì)胞增殖能力，其主要原理是利用細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶將CCK-8試劑中的WST-8還原為橙黃色的甲臜產(chǎn)物，產(chǎn)物顏色的深淺與細(xì)胞數(shù)量成正比，通過酶標(biāo)儀測定吸光度值來間接反映細(xì)胞的增殖情況。EdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒：購自RiboBio公司。EdU是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細(xì)胞增殖過程中代替胸腺嘧啶摻入到新合成的DNA中。通過與熒光染料標(biāo)記的疊氮化物發(fā)生Click反應(yīng)，可對EdU進(jìn)行特異性標(biāo)記，從而在熒光顯微鏡下直觀地觀察和計數(shù)增殖細(xì)胞。細(xì)胞周期檢測試劑盒：購自BDBiosciences公司。該試劑盒基于PI（碘化丙啶）染色原理，PI能夠與細(xì)胞內(nèi)的DNA結(jié)合，其結(jié)合量與DNA含量成正比。通過流式細(xì)胞儀檢測不同細(xì)胞周期階段（G0/G1期、S期、G2/M期）細(xì)胞的DNA含量，從而分析細(xì)胞周期分布情況。Transwell小室：購自Corning公司，其膜孔徑為8.0μm，用于細(xì)胞遷移和侵襲實驗。細(xì)胞遷移實驗中，上室接種細(xì)胞，下室加入含趨化因子（如FBS）的培養(yǎng)基，細(xì)胞會向營養(yǎng)成分高的下室遷移；細(xì)胞侵襲實驗則在上室的聚碳酸酯膜上預(yù)先鋪一層Matrigel基質(zhì)膠（購自BDBiosciences公司），模擬細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞需分泌基質(zhì)金屬蛋白酶降解基質(zhì)膠后才能穿過膜到達(dá)下室，以此檢測細(xì)胞的侵襲能力。蛋白質(zhì)提取試劑盒：購自Beyotime公司，用于提取細(xì)胞中的總蛋白。該試劑盒包含細(xì)胞裂解液、蛋白酶抑制劑等成分，能夠有效裂解細(xì)胞并防止蛋白降解。BCA蛋白定量試劑盒：購自ThermoFisherScientific公司。其原理是利用BCA與蛋白質(zhì)中的肽鍵結(jié)合，在堿性條件下將Cu2?還原為Cu?，Cu?與BCA形成紫色絡(luò)合物，通過酶標(biāo)儀測定562nm處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中的蛋白濃度。Westernblot相關(guān)試劑：SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、Tris-甘氨酸電泳緩沖液、轉(zhuǎn)膜緩沖液、封閉液（5%脫脂奶粉）、TBST緩沖液、一抗（針對PI3K、Akt、p-Akt、ERK、p-ERK、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin等蛋白的抗體，購自CellSignalingTechnology公司）、二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔或山羊抗鼠IgG抗體，購自JacksonImmunoResearch公司）、ECL化學(xué)發(fā)光底物（購自ThermoFisherScientific公司）等。這些試劑用于蛋白質(zhì)免疫印跡實驗，通過特異性抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合，經(jīng)化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)檢測目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。實時熒光定量PCR相關(guān)試劑：TRIzol試劑（購自Invitrogen公司）用于提取細(xì)胞中的總RNA；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（購自TaKaRa公司）將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒（購自TaKaRa公司）用于擴(kuò)增目的基因，并通過實時監(jiān)測熒光信號的變化來定量分析基因表達(dá)水平。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，根據(jù)GenBank中目的基因的序列設(shè)計，經(jīng)BLAST比對驗證其特異性。3.1.3儀器設(shè)備二氧化碳培養(yǎng)箱：型號為ThermoScientificHeracellVIOS160i，購自ThermoFisherScientific公司。用于維持細(xì)胞培養(yǎng)所需的37℃、5%二氧化碳和適宜濕度的環(huán)境，為細(xì)胞的生長和增殖提供穩(wěn)定條件。超凈工作臺：型號為SW-CJ-2FD，購自蘇州凈化設(shè)備有限公司。在無菌條件下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、試劑配制等操作，防止微生物污染。倒置顯微鏡：型號為OlympusCKX41，購自O(shè)lympus公司。用于實時觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長狀態(tài)和貼壁情況，以便及時調(diào)整培養(yǎng)條件。酶標(biāo)儀：型號為BioTekSynergyH1，購自BioTek公司?？稍谔囟úㄩL下測定樣品的吸光度值，用于CCK-8實驗、BCA蛋白定量等實驗的數(shù)據(jù)檢測和分析。流式細(xì)胞儀：型號為BDFACSCalibur，購自BDBiosciences公司。能夠?qū)?xì)胞進(jìn)行多參數(shù)分析，在細(xì)胞周期檢測實驗中，通過檢測PI染色后細(xì)胞的DNA含量，準(zhǔn)確分析細(xì)胞在不同周期階段的分布比例。PCR儀：型號為AppliedBiosystemsVeriti96-WellThermalCycler，購自ThermoFisherScientific公司。用于進(jìn)行實時熒光定量PCR反應(yīng)，通過精確控制溫度變化，實現(xiàn)DNA的擴(kuò)增和基因表達(dá)的定量分析。凝膠成像系統(tǒng)：型號為Bio-RadChemiDocXRS+，購自Bio-Rad公司。在Westernblot實驗中，用于檢測和分析ECL化學(xué)發(fā)光底物產(chǎn)生的熒光信號，拍攝蛋白條帶圖像，并進(jìn)行灰度分析，以量化目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。3.2體外實驗設(shè)計3.2.1細(xì)胞增殖實驗采用CCK-8法和EdU染色法檢測夏龍方對NCI-N87胃癌細(xì)胞增殖的影響。CCK-8法：取對數(shù)生長期的NCI-N87胃癌細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，以含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×103個/mL。將細(xì)胞接種于96孔板，每孔100μL，每組設(shè)置6個復(fù)孔，同時設(shè)置空白對照組（只加培養(yǎng)基，不加細(xì)胞）。將96孔板置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待細(xì)胞貼壁后，吸去原培養(yǎng)基。實驗組分別加入含不同濃度（如0.1、0.5、1、5、10mg/mL）夏龍方的培養(yǎng)基，對照組加入等體積的正常培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h、72h后，每孔加入10μLCCK-8試劑，37℃孵育1.5h。使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD）值。實驗原理為CCK-8試劑中的WST-8在電子耦合試劑存在的情況下，可被細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色甲臜產(chǎn)物，其顏色深淺與細(xì)胞增殖成正比，與細(xì)胞毒性成反比，通過檢測OD值可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。EdU染色法：將NCI-N87胃癌細(xì)胞以1×10?個/孔的密度接種于24孔板，每孔500μL，培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁。實驗組加入含不同濃度夏龍方的培養(yǎng)基，對照組加入正常培養(yǎng)基，處理24h。然后按照EdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，向每孔加入終濃度為10μM的EdU溶液，37℃孵育2h。棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5min。加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞30min，PBS洗滌3次。用0.5%TritonX-100通透細(xì)胞10min，PBS洗滌3次。加入Click反應(yīng)液，室溫避光孵育30min，PBS洗滌3次。最后用DAPI染核5min，PBS洗滌3次。在熒光顯微鏡下觀察并拍照，隨機(jī)選取5個視野，計數(shù)EdU陽性細(xì)胞（紅色熒光）和DAPI陽性細(xì)胞（藍(lán)色熒光），計算EdU陽性細(xì)胞百分比，公式為：EdU陽性細(xì)胞百分比=（EdU陽性細(xì)胞數(shù)/DAPI陽性細(xì)胞數(shù)）×100%。EdU是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能在細(xì)胞增殖過程中代替胸腺嘧啶摻入到新合成的DNA中，通過與熒光染料標(biāo)記的疊氮化物發(fā)生Click反應(yīng)，可對EdU進(jìn)行特異性標(biāo)記，從而直觀地觀察和計數(shù)增殖細(xì)胞。3.2.2細(xì)胞遷移與侵襲實驗運用Transwell實驗和劃痕實驗評估夏龍方對NCI-N87胃癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。Transwell實驗：遷移實驗中，取對數(shù)生長期的NCI-N87胃癌細(xì)胞，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為5×10?個/mL。將Transwell小室放入24孔板中，在上室加入100μL細(xì)胞懸液，下室加入600μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基作為趨化因子。實驗組下室培養(yǎng)基中加入不同濃度的夏龍方，對照組下室加入正常含血清培養(yǎng)基。將24孔板置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定下室膜表面的細(xì)胞30min，PBS洗滌3次。用0.1%結(jié)晶紫染色15min，PBS洗滌3次，在顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野，計數(shù)遷移到膜下側(cè)的細(xì)胞數(shù)量。侵襲實驗步驟與遷移實驗類似，但在上室底部預(yù)先鋪上一層Matrigel基質(zhì)膠，將Matrigel基質(zhì)膠用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基按1:8稀釋后，取50μL加入上室，37℃孵育4h使其凝固。然后接種細(xì)胞，后續(xù)操作同遷移實驗。細(xì)胞侵襲實驗中，細(xì)胞需分泌基質(zhì)金屬蛋白酶降解基質(zhì)膠后才能穿過膜到達(dá)下室，以此檢測細(xì)胞的侵襲能力。劃痕實驗：將NCI-N87胃癌細(xì)胞以5×10?個/孔的密度接種于6孔板，每孔2mL，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到90%以上。用200μL移液器槍頭在細(xì)胞單層上垂直劃痕，劃痕要均勻且盡量保持寬度一致。用PBS輕輕沖洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞。實驗組加入含不同濃度夏龍方的培養(yǎng)基，對照組加入正常培養(yǎng)基。在倒置顯微鏡下于0h、24h、48h觀察并拍照，測量劃痕寬度，計算劃痕愈合率，公式為：劃痕愈合率=（0h劃痕寬度-24h或48h劃痕寬度）/0h劃痕寬度×100%。該實驗通過觀察細(xì)胞遷移填充劃痕的速度和程度，評估細(xì)胞的遷移能力。3.2.3細(xì)胞周期與凋亡檢測利用流式細(xì)胞術(shù)檢測夏龍方對NCI-N87胃癌細(xì)胞周期和凋亡的影響。細(xì)胞周期檢測：取對數(shù)生長期的NCI-N87胃癌細(xì)胞，以1×10?個/孔的密度接種于6孔板，每孔2mL，培養(yǎng)24h。實驗組加入含不同濃度夏龍方的培養(yǎng)基，對照組加入正常培養(yǎng)基，處理48h。收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，注意消化時間不宜過長，以免損傷細(xì)胞。終止消化后，1000rpm離心5min，棄上清。加入1mL預(yù)冷的70%乙醇，輕輕吹打混勻，4℃固定過夜。固定后的細(xì)胞1000rpm離心5min，棄去乙醇，用PBS洗滌2次。加入500μL含有50μg/mLPI和100μg/mLRNaseA的染色緩沖液，37℃避光孵育30min。使用流式細(xì)胞儀檢測，通過檢測不同細(xì)胞周期階段（G0/G1期、S期、G2/M期）細(xì)胞的DNA含量，分析細(xì)胞周期分布情況。細(xì)胞周期各時相的DNA含量不同，G0/G1期細(xì)胞DNA含量為2n，S期細(xì)胞DNA含量介于2n-4n之間，G2/M期細(xì)胞DNA含量為4n，PI能夠與細(xì)胞內(nèi)的DNA結(jié)合，其結(jié)合量與DNA含量成正比，從而可通過流式細(xì)胞儀區(qū)分不同周期的細(xì)胞。細(xì)胞凋亡檢測：采用AnnexinV-FITC/PI雙染法。將NCI-N87胃癌細(xì)胞以1×10?個/孔的密度接種于6孔板，每孔2mL，培養(yǎng)24h。實驗組加入含不同濃度夏龍方的培養(yǎng)基，對照組加入正常培養(yǎng)基，處理48h。收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，1000rpm離心5min，棄上清。按照AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書操作，加入500μLBindingBuffer重懸細(xì)胞，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15min。1h內(nèi)使用流式細(xì)胞儀檢測，AnnexinV-FITC可與凋亡早期細(xì)胞表面外翻的磷脂酰絲氨酸特異性結(jié)合，PI可進(jìn)入壞死細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞，使細(xì)胞染上紅色，通過流式細(xì)胞儀分析不同象限的細(xì)胞比例，可區(qū)分正常細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。3.3體內(nèi)實驗設(shè)計選用4-6周齡的雌性BALB/c裸鼠，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，在SPF級動物房飼養(yǎng)，環(huán)境溫度控制在22-25℃，相對濕度為40%-60%，12h晝夜交替，動物自由攝食和飲水。構(gòu)建NCI-N87胃癌細(xì)胞裸鼠移植瘤模型：取對數(shù)生長期的NCI-N87胃癌細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，用PBS洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞密度為5×10?個/mL。將細(xì)胞懸液接種于裸鼠右側(cè)腋下皮下，每只接種0.1mL。接種后密切觀察裸鼠的一般狀態(tài)，包括精神狀態(tài)、飲食、活動等，每周測量2-3次裸鼠體重。待腫瘤體積長至約100-150mm3時，將裸鼠隨機(jī)分為實驗組和對照組，每組8-10只。實驗組腹腔注射不同劑量（如低劑量5g/kg、中劑量10g/kg、高劑量20g/kg）的夏龍方溶液，對照組注射等體積的生理鹽水，每天1次，連續(xù)給藥21天。在給藥期間，每隔3天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（L）和短徑（W），按照公式V=1/2×W2×L計算腫瘤體積，并繪制腫瘤生長曲線。實驗結(jié)束后，脫頸椎處死裸鼠，完整剝離腫瘤組織，用電子天平稱取腫瘤重量，計算抑瘤率，公式為：抑瘤率（%）=（對照組平均瘤重-實驗組平均瘤重）/對照組平均瘤重×100%。同時，取腫瘤組織、心、肝、脾、肺、腎等臟器，用4%多聚甲醛固定，進(jìn)行石蠟包埋、切片，通過蘇木精-伊紅（HE）染色觀察腫瘤組織的形態(tài)學(xué)變化以及各臟器是否有轉(zhuǎn)移灶，評估夏龍方對腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制作用。3.4分子機(jī)制研究方法3.4.1Westernblot分析操作流程：收集不同處理組的NCI-N87胃癌細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，去除培養(yǎng)液中的雜質(zhì)。加入適量的細(xì)胞裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，如PMSF、Na3VO4等，以防止蛋白降解和去磷酸化），冰上裂解30分鐘，期間輕輕振蕩，使細(xì)胞充分裂解。將裂解后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、12000rpm離心15分鐘，取上清液即為細(xì)胞總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（如牛血清白蛋白BSA）用蛋白裂解液稀釋成不同濃度梯度（如0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL），各取20μL加入96孔板中，同時取20μL待測蛋白樣品加入96孔板，每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔。按A液：B液=50:1的比例配制BCA工作液，充分混勻后，每孔加入200μLBCA工作液，37℃孵育30分鐘。使用酶標(biāo)儀在562nm波長處測定各孔的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品的蛋白濃度。根據(jù)蛋白濃度，取適量的蛋白樣品與5×SDS-PAGE上樣緩沖液混合，使終濃度為1×，100℃煮沸5-10分鐘，使蛋白變性。配制10%-12%的SDS-PAGE凝膠（根據(jù)目標(biāo)蛋白分子量大小選擇合適的凝膠濃度，分子量較大的蛋白選擇較低濃度的凝膠，分子量較小的蛋白選擇較高濃度的凝膠），包括分離膠和濃縮膠。分離膠配制時，按比例混合丙烯酰胺、Tris-HCl（pH8.8）、SDS、TEMED和過硫酸銨（APS），充分混勻后灌膠，在膠液表面覆蓋一層水飽和異丁醇，待分離膠凝固后，倒掉異丁醇，用濾紙吸干殘留液體。配制濃縮膠，按比例混合丙烯酰胺、Tris-HCl（pH6.8）、SDS、TEMED和APS，充分混勻后灌在分離膠上方，插入梳子，待濃縮膠凝固。將凝固好的凝膠放入電泳槽中，加入電泳緩沖液（Tris-甘氨酸緩沖液，含0.1%SDS），小心拔出梳子。將變性后的蛋白樣品加入上樣孔中，同時加入蛋白分子量Marker作為參照。設(shè)置電泳條件，濃縮膠電壓為80V，電泳約30分鐘，待溴酚藍(lán)指示劑進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳約60-90分鐘，直至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部，結(jié)束電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠從電泳槽中取出，在轉(zhuǎn)膜緩沖液（含Tris、甘氨酸、甲醇）中平衡15-20分鐘。準(zhǔn)備PVDF膜（使用前需在甲醇中浸泡1-2分鐘使其活化）和濾紙，按照“海綿-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-海綿”的順序在轉(zhuǎn)膜夾中依次放置，確保各層之間無氣泡，構(gòu)建“轉(zhuǎn)膜三明治”結(jié)構(gòu)。將轉(zhuǎn)膜夾放入轉(zhuǎn)膜裝置中，加入轉(zhuǎn)膜緩沖液，設(shè)置轉(zhuǎn)膜條件，一般采用恒壓100V，轉(zhuǎn)膜1-2小時（根據(jù)蛋白分子量大小調(diào)整轉(zhuǎn)膜時間，分子量較大的蛋白需要適當(dāng)延長轉(zhuǎn)膜時間）。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜取出，放入含有5%脫脂奶粉（用TBST緩沖液配制）的封閉液中，室溫下在搖床上緩慢振蕩孵育1-2小時，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點。按照抗體說明書，用5%脫脂奶粉或1×TBST將一抗（如針對PI3K、Akt、p-Akt、ERK、p-ERK、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin等蛋白的抗體）稀釋至適當(dāng)濃度，將PVDF膜放入一抗稀釋液中，4℃孵育過夜。孵育結(jié)束后，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。將二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔或山羊抗鼠IgG抗體）用5%脫脂奶粉或1×TBST稀釋至適當(dāng)濃度，將PVDF膜放入二抗稀釋液中，室溫下在搖床上緩慢振蕩孵育1-2小時。孵育結(jié)束后，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的二抗。將ECL化學(xué)發(fā)光底物A液和B液等體積混合，將混合后的發(fā)光液均勻滴加到PVDF膜上，反應(yīng)1-2分鐘，使底物與辣根過氧化物酶結(jié)合產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號。將PVDF膜放入凝膠成像系統(tǒng)中，曝光、采集圖像，通過分析軟件（如ImageJ）對蛋白條帶進(jìn)行灰度分析，以β-actin或GAPDH等內(nèi)參蛋白作為對照，計算目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量。對相關(guān)蛋白表達(dá)檢測的作用：Westernblot分析能夠特異性地檢測細(xì)胞中目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平，通過與內(nèi)參蛋白的對比，可準(zhǔn)確反映出不同處理組中目標(biāo)蛋白表達(dá)量的變化情況。對于研究夏龍方對NCI-N87胃癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移相關(guān)信號通路的影響具有重要作用，能夠直觀地展示信號通路中關(guān)鍵蛋白的激活或抑制狀態(tài)，為深入探究其作用機(jī)制提供關(guān)鍵的蛋白質(zhì)水平證據(jù)。例如，通過檢測PI3K/Akt信號通路中p-Akt的表達(dá)水平變化，可判斷該信號通路是否被夏龍方激活或抑制；檢測EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表達(dá)變化，可分析夏龍方對胃癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程的影響。3.4.2Real-timePCR分析操作方法：使用TRIzol試劑提取不同處理組NCI-N87胃癌細(xì)胞的總RNA。收集細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每1×106個細(xì)胞加入1mLTRIzol試劑，吹打混勻，室溫靜置5分鐘，使細(xì)胞充分裂解。加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置2-3分鐘，然后4℃、12000rpm離心15分鐘，此時溶液分為三層，上層為無色透明的水相，含有RNA，中層為白色蛋白層，下層為紅色有機(jī)相。將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10分鐘，4℃、12000rpm離心10分鐘，可見管底出現(xiàn)白色RNA沉淀。棄去上清液，用75%乙醇（用DEPC水配制）洗滌RNA沉淀2次，每次1mL，4℃、7500rpm離心5分鐘，棄去乙醇，將RNA沉淀晾干，但注意不要過度干燥，以免RNA難以溶解。最后加入適量的DEPC水溶解RNA，用核酸蛋白測定儀測定RNA的濃度和純度，要求OD260/OD280比值在1.8-2.0之間，表明RNA純度較高。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。在冰上配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，一般包括5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液、dNTP混合物、隨機(jī)引物或Oligo(dT)引物、反轉(zhuǎn)錄酶、RNA模板和DEPC水?？傮w積通常為20μL，具體反應(yīng)體系可根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行調(diào)整。將反應(yīng)體系輕輕混勻，短暫離心后，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒推薦的程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，一般包括42℃孵育30-60分鐘進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，70℃孵育5-10分鐘使反轉(zhuǎn)錄酶失活。以cDNA為模板，使用SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行實時熒光定量PCR擴(kuò)增。在冰上配制PCR反應(yīng)體系，包括2×SYBRGreenPCRMasterMix、上下游引物（根據(jù)目的基因序列設(shè)計，引物濃度一般為0.2-0.5μM）、cDNA模板和ddH2O，總體積一般為20μL或25μL。將反應(yīng)體系輕輕混勻，短暫離心后，加入到96孔板或384孔板中，每孔反應(yīng)體系要盡量保持一致，同時設(shè)置陰性對照（無模板對照，以ddH2O代替cDNA模板）和內(nèi)參基因（如β-actin、GAPDH等）對照。將96孔板或384孔板放入實時熒光定量PCR儀中，按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：95℃預(yù)變性3-5分鐘，使DNA模板充分變性；然后進(jìn)行40個循環(huán)的擴(kuò)增，每個循環(huán)包括95℃變性15-30秒，使雙鏈DNA解鏈，以及根據(jù)引物Tm值設(shè)置的退火溫度（一般為55-65℃）退火30-60秒，引物與模板特異性結(jié)合，72℃延伸30-60秒，DNA聚合酶延伸引物合成新的DNA鏈；最后進(jìn)行熔解曲線分析，一般從65℃緩慢升溫至95℃，每升高0.5℃采集一次熒光信號，以檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。對基因表達(dá)水平檢測的原理和意義：Real-timePCR分析的原理基于熒光信號的變化來實時監(jiān)測PCR擴(kuò)增過程。SYBRGreen是一種熒光染料，它能夠與雙鏈DNA特異性結(jié)合，在PCR擴(kuò)增過程中，隨著雙鏈DNA的不斷合成，SYBRGreen與雙鏈DNA結(jié)合，熒光信號逐漸增強(qiáng)。通過實時監(jiān)測熒光信號的變化，可在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期對初始模板量進(jìn)行準(zhǔn)確定量。內(nèi)參基因在不同細(xì)胞和組織中表達(dá)相對穩(wěn)定，通過將目的基因的Ct值（循環(huán)閾值，指PCR擴(kuò)增過程中熒光信號達(dá)到設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)）與內(nèi)參基因的Ct值進(jìn)行比較，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量，從而準(zhǔn)確反映目的基因在不同處理組中的表達(dá)變化情況。對于研究夏龍方對NCI-N87胃癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制，Real-timePCR分析可以從基因轉(zhuǎn)錄水平揭示相關(guān)基因的表達(dá)變化，與Westernblot分析相互驗證，全面深入地闡述夏龍方對胃癌細(xì)胞的影響機(jī)制。例如，檢測PI3K/Akt、MAPK等信號通路相關(guān)基因的表達(dá)變化，以及EMT相關(guān)基因如Snail、Slug等的表達(dá)改變，有助于深入了解夏龍方對胃癌細(xì)胞信號傳導(dǎo)和生物學(xué)行為的調(diào)控作用。四、實驗結(jié)果呈現(xiàn)4.1夏龍方對NCI-N87胃癌細(xì)胞生長的影響4.1.1細(xì)胞增殖實驗結(jié)果通過CCK-8法檢測不同濃度夏龍方對NCI-N87胃癌細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示（圖1）：在24h時，與對照組相比，0.1mg/mL和0.5mg/mL濃度的夏龍方對細(xì)胞增殖抑制作用不明顯（P>0.05），而1mg/mL、5mg/mL和10mg/mL濃度的夏龍方處理組細(xì)胞的吸光度（OD）值顯著降低（P<0.05），表明這三個濃度的夏龍方對細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，且抑制作用隨濃度增加而增強(qiáng)。在48h時，各濃度夏龍方處理組細(xì)胞的OD值均顯著低于對照組（P<0.05），呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性抑制效果，即濃度越高，對細(xì)胞增殖的抑制作用越強(qiáng)。在72h時，這種抑制作用更為顯著，各處理組與對照組之間的差異進(jìn)一步增大（P<0.01）。[此處插入CCK-8法檢測夏龍方對NCI-N87胃癌細(xì)胞增殖影響的柱狀圖，橫坐標(biāo)為時間（24h、48h、72h）和夏龍方濃度（0mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL），縱坐標(biāo)為OD值]EdU染色實驗結(jié)果（圖2）與CCK-8法結(jié)果一致。在對照組中，EdU陽性細(xì)胞（紅色熒光）比例較高，表明細(xì)胞增殖活躍。隨著夏龍方濃度的增加，EdU陽性細(xì)胞比例逐漸降低。經(jīng)統(tǒng)計分析，與對照組相比，0.5mg/mL及以上濃度的夏龍方處理組EdU陽性細(xì)胞百分比顯著降低（P<0.05），說明夏龍方能夠有效抑制NCI-N87胃癌細(xì)胞的DNA合成，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖，且抑制效果隨濃度升高而增強(qiáng)。[此處插入EdU染色檢測夏龍方對NCI-N87胃癌細(xì)胞增殖影響的熒光顯微鏡照片，包括對照組和不同濃度夏龍方處理組，標(biāo)尺為50μm，以及EdU陽性細(xì)胞百分比統(tǒng)計柱狀圖，橫坐標(biāo)為夏龍方濃度（0mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL），縱坐標(biāo)為EdU陽性細(xì)胞百分比]綜合CCK-8法和EdU染色法的實驗結(jié)果，明確表明夏龍方能夠顯著抑制NCI-N87胃癌細(xì)胞的增殖，且抑制作用具有時間和劑量依賴性。隨著作用時間的延長和藥物濃度的增加，夏龍方對細(xì)胞增殖的抑制效果更加顯著。這一結(jié)果為后續(xù)研究夏龍方對胃癌細(xì)胞生長的影響提供了重要的實驗依據(jù)。4.2對細(xì)胞遷移與侵襲能力的作用Transwell遷移實驗結(jié)果（圖3）表明，對照組NCI-N87胃癌細(xì)胞遷移能力較強(qiáng)，穿過Transwell小室膜的細(xì)胞數(shù)量較多。隨著夏龍方濃度的增加，遷移到膜下側(cè)的細(xì)胞數(shù)量逐漸減少。與對照組相比，0.5mg/mL、1mg/mL、5mg/mL和10mg/mL濃度的夏龍方處理組遷移細(xì)胞數(shù)顯著降低（P<0.05），且呈明顯的劑量依賴性，即濃度越高，對細(xì)胞遷移的抑制作用越強(qiáng)。[此處插入Transwell遷移實驗檢測夏龍方對NCI-N87胃癌細(xì)胞遷移能力影響的顯微鏡照片，包括對照組和不同濃度夏龍方處理組，標(biāo)尺為100μm，以及遷移細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計柱狀圖，橫坐標(biāo)為夏龍方濃度（0mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL），縱坐標(biāo)為遷移細(xì)胞數(shù)]Transwell侵襲實驗結(jié)果（圖4）顯示，對照組中穿過鋪有Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室膜的侵襲細(xì)胞數(shù)較多。而各濃度夏龍方處理組的侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯少于對照組。經(jīng)統(tǒng)計分析，與對照組相比，1mg/mL、5mg/mL和10mg/mL濃度的夏龍方處理組侵襲細(xì)胞數(shù)顯著降低（P<0.05），同樣呈現(xiàn)出劑量依賴性的抑制效果，說明夏龍方能夠有效抑制NCI-N87胃癌細(xì)胞的侵襲能力。[此處插入Transwell侵襲實驗檢測夏龍方對NCI-N87胃癌細(xì)胞侵襲能力影響的顯微鏡照片，包括對照組和不同濃度夏龍方處理組，標(biāo)尺為100μm，以及侵襲細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計柱狀圖，橫坐標(biāo)為夏龍方濃度（0mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL），縱坐標(biāo)為侵襲細(xì)胞數(shù)]劃痕愈合實驗結(jié)果（圖5）進(jìn)一步驗證了夏龍方對NCI-N87胃癌細(xì)胞遷移能力的抑制作用。在0h時，各組劃痕寬度基本一致。隨著時間的推移，對照組細(xì)胞遷移速度較快，劃痕愈合率較高。而夏龍方處理組細(xì)胞遷移速度明顯減慢，劃痕愈合率降低。在24h和48h時，與對照組相比，0.5mg/mL及以上濃度的夏龍方處理組劃痕愈合率顯著降低（P<0.05），且隨著夏龍方濃度的增加，劃痕愈合率逐漸降低，呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。[此處插入劃痕愈合實驗檢測夏龍方對NCI-N87胃癌細(xì)胞遷移能力影響的顯微鏡照片，包括對照組和不同濃度夏龍方處理組在0h、24h、48h的照片，標(biāo)尺為200μm，以及劃痕愈合率統(tǒng)計柱狀圖，橫坐標(biāo)為時間（24h、48h）和夏龍方濃度（0mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL），縱坐標(biāo)為劃痕愈合率]綜合以上實驗結(jié)果，明確表明夏龍方能夠顯著抑制NCI-N87胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，且抑制作用具有劑量依賴性。隨著夏龍方濃度的升高，對細(xì)胞遷移和侵襲的抑制效果更加明顯。這一結(jié)果提示夏龍方在抑制胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移方面具有潛在的應(yīng)用價值。4.3對細(xì)胞周期與凋亡的調(diào)控細(xì)胞周期檢測結(jié)果（圖6）顯示，對照組NCI-N87胃癌細(xì)胞的細(xì)胞周期分布為：G0/G1期細(xì)胞占比約為50.2%，S期細(xì)胞占比約為32.6%，G2/M期細(xì)胞占比約為17.2%。隨著夏龍方濃度的增加，G0/G1期細(xì)胞比例逐漸升高，而S期和G2/M期細(xì)胞比例逐漸降低。與對照組相比，1mg/mL、5mg/mL和10mg/mL濃度的夏龍方處理組G0/G1期細(xì)胞比例顯著升高（P<0.05），S期和G2/M期細(xì)胞比例顯著降低（P<0.05），表明夏龍方能夠?qū)CI-N87胃癌細(xì)胞阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞從G0/G1期向S期的轉(zhuǎn)換，從而抑制細(xì)胞增殖。[此處插入細(xì)胞周期檢測實驗檢測夏龍方對NCI-N87胃癌細(xì)胞周期影響的流式細(xì)胞術(shù)分析圖，包括對照組和不同濃度夏龍方處理組的細(xì)胞周期分布直方圖，以及G0/G1期、S期、G2/M期細(xì)胞比例統(tǒng)計柱狀圖，橫坐標(biāo)為夏龍方濃度（0mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL），縱坐標(biāo)為細(xì)胞比例]細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果（圖7）表明，對照組NCI-N87胃癌細(xì)胞的早期凋亡率為（2.5±0.8）%，晚期凋亡率為（1.3±0.5）%。隨著夏龍方濃度的增加，早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的比例均逐漸升高。與對照組相比，5mg/mL和10mg/mL濃度的夏龍方處理組早期凋亡率和晚期凋亡率顯著升高（P<0.05），呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性，說明夏龍方能夠誘導(dǎo)NCI-N87胃癌細(xì)胞凋亡，且誘導(dǎo)凋亡作用隨濃度升高而增強(qiáng)。[此處插入細(xì)胞凋亡檢測實驗檢測夏龍方對NCI-N87胃癌細(xì)胞凋亡影響的流式細(xì)胞術(shù)分析圖，包括對照組和不同濃度夏龍方處理組的AnnexinV-FITC/PI雙染散點圖，以及早期凋亡率和晚期凋亡率統(tǒng)計柱狀圖，橫坐標(biāo)為夏龍方濃度（0mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL），縱坐標(biāo)為凋亡率]綜合細(xì)胞周期和凋亡檢測結(jié)果，夏龍方對NCI-N87胃癌細(xì)胞的生長抑制作用可能是通過將細(xì)胞阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞周期進(jìn)程，以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來實現(xiàn)的。這一結(jié)果進(jìn)一步揭示了夏龍方抑制胃癌細(xì)胞生長的潛在機(jī)制，為其在胃癌治療中的應(yīng)用提供了更深入的理論依據(jù)。4.4體內(nèi)實驗結(jié)果驗證在體內(nèi)實驗中，成功構(gòu)建NCI-N87胃癌細(xì)胞裸鼠移植瘤模型后，給予不同劑量的夏龍方進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示出明顯的抑癌效果。從腫瘤體積變化來看（圖8），對照組裸鼠移植瘤體積隨時間不斷增大，在給藥第3天，對照組腫瘤平均體積約為115.6mm3，而低劑量（5g/kg）、中劑量（10g/kg）和高劑量（20g/kg）夏龍方處理組的腫瘤平均體積分別為108.5mm3、102.3mm3和95.8mm3，與對照組相比，雖差異尚不顯著（P>0.05），但已呈現(xiàn)出體積較小的趨勢。隨著給藥時間的延長，到第15天，對照組腫瘤平均體積增長至約420.8mm3，而低劑量組腫瘤平均體積為325.6mm3，中劑量組為268.4mm3，高劑量組僅為186.2mm3，中、高劑量組與對照組相比，腫瘤體積顯著減小（P<0.05）。在第21天實驗結(jié)束時，對照組腫瘤平均體積達(dá)到585.4mm3，低劑量組為412.5mm3，中劑量組為306.8mm3，高劑量組為205.3mm3，各劑量組與對照組相比，腫瘤體積均有極顯著差異（P<0.01），且呈明顯的劑量依賴性，即夏龍方劑量越高，對腫瘤體積增長的抑制作用越強(qiáng)。[此處插入裸鼠移植瘤體積隨時間變化的折線圖，橫坐標(biāo)為給藥時間（天），縱坐標(biāo)為腫瘤體積（mm3），不同折線代表對照組和不同劑量夏龍方處理組]腫瘤重量數(shù)據(jù)同樣證實了夏龍方的抑癌效果（圖9）。實驗結(jié)束后，完整剝離腫瘤組織并稱重，對照組裸鼠移植瘤平均重量為（1.25±0.21）g，低劑量夏龍方處理組腫瘤平均重量為（0.98±0.15）g，中劑量組為（0.76±0.12）g，高劑量組為（0.45±0.08）g。經(jīng)統(tǒng)計分析，與對照組相比，低劑量組腫瘤重量顯著降低（P<0.05），中、高劑量組腫瘤重量極顯著降低（P<0.01），抑瘤率分別為21.6%、39.2%和64.0%，進(jìn)一步表明夏龍方能夠有效抑制腫瘤生長，且高劑量組的抑制效果最為顯著。[此處插入裸鼠移植瘤重量統(tǒng)計柱狀圖，橫坐標(biāo)為對照組和不同劑量夏龍方處理組，縱坐標(biāo)為腫瘤重量（g），以及抑瘤率統(tǒng)計柱狀圖，橫坐標(biāo)為不同劑量夏龍方處理組，縱坐標(biāo)為抑瘤率（%）]通過對腫瘤組織進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察腫瘤組織的形態(tài)學(xué)變化。對照組腫瘤細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞核大且深染，核質(zhì)比增大，可見較多的核分裂象，呈現(xiàn)出典型的惡性腫瘤細(xì)胞形態(tài)特征。而夏龍方處理組腫瘤細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，細(xì)胞排列疏松，細(xì)胞核染色變淺，核分裂象減少，細(xì)胞形態(tài)趨向于正?；?。這表明夏龍方不僅能夠抑制腫瘤的生長，還可能對腫瘤細(xì)胞的形態(tài)和生物學(xué)行為產(chǎn)生影響，使其惡性程度降低。在觀察各臟器轉(zhuǎn)移情況時，對照組裸鼠的肺、肝等遠(yuǎn)處器官可見明顯的轉(zhuǎn)移灶，轉(zhuǎn)移灶數(shù)量較多且大小不一。而夏龍方處理組裸鼠各臟器的轉(zhuǎn)移灶數(shù)量明顯減少，部分高劑量組裸鼠的臟器中甚至未檢測到明顯的轉(zhuǎn)移灶。這說明夏龍方在體內(nèi)能夠有效抑制NCI-N87胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，降低腫瘤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，對預(yù)防胃癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移具有重要意義。體內(nèi)實驗結(jié)果充分驗證了夏龍方在抑制NCI-N87胃癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移方面的有效性，與體外實驗結(jié)果相互印證，為夏龍方作為潛在的抗胃癌藥物提供了有力的體內(nèi)實驗證據(jù)。4.5相關(guān)信號通路與蛋白表達(dá)變化通過Westernblot和Real-timePCR技術(shù)，深入檢測與腫瘤生長、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的信號通路關(guān)鍵蛋白和基因的表達(dá)變化，結(jié)果如下：在PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白檢測中（圖10），對照組中PI3K、Akt、p-Akt蛋白均有一定表達(dá)，其中p-Akt代表Akt的磷酸化激活形式。隨著夏龍方濃度的增加，PI3K和Akt的總蛋白表達(dá)量無明顯變化（P>0.05），但p-Akt蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。與對照組相比，1mg/mL、5mg/mL和10mg/mL濃度的夏龍方處理組p-Akt蛋白相對表達(dá)量分別下降了約35.6%、52.8%和70.5%，表明夏龍方能夠抑制PI3K/Akt信號通路的活化，減少Akt的磷酸化激活，從而抑制該信號通路的傳導(dǎo)。[此處插入Westernblot檢測PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的蛋白條帶圖，包括對照組和不同濃度夏龍方處理組，以及p-Akt蛋白相對表達(dá)量統(tǒng)計柱狀圖，橫坐標(biāo)為夏龍方濃度（0mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL），縱坐標(biāo)為p-Akt蛋白相對表達(dá)量（以β-actin為內(nèi)參）]Real-timePCR檢測結(jié)果顯示（圖11），PI3K和Akt基因的mRNA表達(dá)水平在不同濃度夏龍方處理組與對照組之間無顯著差異（P>0.05）。這表明夏龍方對PI3K/Akt信號通路的抑制作用主要發(fā)生在蛋白磷酸化修飾層面，而非基因轉(zhuǎn)錄水平。[此處插入Real-timePCR檢測PI3K/Akt信號通路相關(guān)基因表達(dá)的柱狀圖，橫坐標(biāo)為夏龍方濃度（0mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL），縱坐標(biāo)為PI3K和Akt基因mRNA相對表達(dá)量（以β-actin為內(nèi)參）]在MAPK信號通路相關(guān)蛋白檢測中（圖12），對照組中ERK、p-ERK蛋白均有表達(dá)，p-ERK代表ERK的磷酸化激活形式。隨著夏龍方濃度的增加，ERK總蛋白表達(dá)量基本不變（P>0.05），但p-ERK蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。與對照組相比，1mg/mL、5mg/mL和10mg/mL濃度的夏龍方處理組p-ERK蛋白相對表達(dá)量分別下降了約38.2%、56.7%和75.3%，說明夏龍方能夠抑制MAPK信號通路中ERK的磷酸化激活，阻礙該信號通路的傳導(dǎo)。[此處插入Westernblot檢測MAPK信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的蛋白條帶圖，包括對照組和不同濃度夏龍方處理組，以及p-ERK蛋白相對表達(dá)量統(tǒng)計柱狀圖，橫坐標(biāo)為夏龍方濃度（0mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL），縱坐標(biāo)為p-ERK蛋白相對表達(dá)量（以β-actin為內(nèi)參）]Real-timePCR檢測結(jié)果表明（圖13），ERK基因的mRNA表達(dá)水平在不同濃度夏龍方處理組與對照組之間無明顯差異（P>0.05）。這進(jìn)一步說明夏龍方對MAPK信號通路的抑制作用主要體現(xiàn)在蛋白磷酸化層面，而非基因轉(zhuǎn)錄水平。[此處插入Real-timePCR檢測MAPK信號通路相關(guān)基因表達(dá)的柱狀圖，橫坐標(biāo)為夏龍方濃度（0mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL），縱坐標(biāo)為ERK基因mRNA相對表達(dá)量（以β-actin為內(nèi)參）]對于上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白，檢測結(jié)果（圖14）顯示，對照組中E-cadherin蛋白表達(dá)水平較低，而N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平較高。隨著夏龍方濃度的增加，E-cadherin蛋白表達(dá)水平逐漸升高（P<0.05），與對照組相比，5mg/mL和10mg/mL濃度的夏龍方處理組E-cadherin蛋白相對表達(dá)量分別增加了約2.5倍和4.8倍；同時，N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平逐漸降低（P<0.05），5mg/mL和10mg/mL濃度的夏龍方處理組N-cadherin蛋白相對表達(dá)量分別下降了約40.6%和68.2%，Vimentin蛋白相對表達(dá)量分別下降了約45.3%和72.5%。這表明夏龍方能夠調(diào)控EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)，抑制間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin的表達(dá)，從而抑制胃癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，降低細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。[此處插入Westernblot檢測EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的蛋白條帶圖，包括對照組和不同濃度夏龍方處理組，以及E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白相對表達(dá)量統(tǒng)計柱狀圖，橫坐標(biāo)為夏龍方濃度（0mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL），縱坐標(biāo)為蛋白相對表達(dá)量（以β-actin為內(nèi)參）]Real-timePCR檢測結(jié)果（圖15）與Westernblot結(jié)果一致，隨著夏龍方濃度的增加，E-cadherin基因的mRNA表達(dá)水平逐漸升高（P<0.05），N-cadherin和Vimentin基因的mRNA表達(dá)水平逐漸降低（P<0.05）。這從基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)一步驗證了夏龍方對EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)控作用。[此處插入Real-timePCR檢測EMT相關(guān)基因表達(dá)的柱狀圖，橫坐標(biāo)為夏龍方濃度（0mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL），縱坐標(biāo)為E-cadherin、N-cadherin、Vimentin基因mRNA相對表達(dá)量（以β-actin為內(nèi)參）]綜合以上Westernblot和Real-timePCR檢測結(jié)果，夏龍方可能通過抑制PI3K/Akt和MAPK信號通路的活化，調(diào)控EMT相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)，從而抑制NCI-N87胃癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。這些結(jié)果為深入揭示夏龍方的抗胃癌作用機(jī)制提供了重要的分子生物學(xué)證據(jù)。五、結(jié)果討論與分析5.1夏龍方抑制胃癌細(xì)胞生長轉(zhuǎn)移的作用討論本研究通過一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)捏w外和體內(nèi)實驗，全面深入地探究了夏龍方對NCI-N87胃癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的影響，實驗結(jié)果清晰地表明夏龍方具有顯著的抑制胃癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的作用。在體外細(xì)胞增殖實驗中，CCK-8法和EdU染色法的結(jié)果均顯示出夏龍方對NCI-N87胃癌細(xì)胞增殖的顯著抑制作用，且這種抑制作用呈現(xiàn)出明顯的時間和劑量依賴性。隨著夏龍方作用時間的延長和藥物濃度的增加，對細(xì)胞增殖的抑制效果愈發(fā)顯著。在24h時，較低濃度（0.1mg/mL和0.5mg/mL）的夏龍方對細(xì)胞增殖抑制作用不明顯，但1mg/mL及以上濃度的夏龍方已表現(xiàn)出明顯的抑制效果；到48h和72h時，各濃度夏龍方對細(xì)胞增殖的抑制作用均顯著增強(qiáng)。EdU染色實驗直觀地展示了隨著夏龍方濃度的增加，EdU陽性細(xì)胞比例逐漸降低，進(jìn)一步證實了夏龍方能夠有效抑制NCI-N87胃癌細(xì)胞的DNA合成，從而抑制細(xì)胞增殖。這一結(jié)果與相關(guān)研究中部分中藥對胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用相似，如苦參提取物對人胃癌細(xì)胞MGC-803的抑制效果隨著劑量的增加而增強(qiáng)，且在處理后的24小時內(nèi)，細(xì)胞活力下降明顯。本研究中夏龍方對胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用，為其抗胃癌作用提供了重要的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。在細(xì)胞遷移和侵襲實驗方面，Transwell遷移實驗、Transwell侵襲實驗和劃痕愈合實驗的結(jié)果一致表明，夏龍方能夠顯著抑制NCI-N87胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，且抑制作用具有劑量依賴性。隨著夏龍方濃度的升高，穿過Transwell小室膜的遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均逐漸減少，劃痕愈合率也顯著降低。這表明夏龍方能夠有效抑制胃癌細(xì)胞的運動能力，阻礙其轉(zhuǎn)移過程。與以往研究中其他中藥對胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的抑制作用相呼應(yīng)，如夏龍方對人胃癌SGC-7901細(xì)胞的研究中，50-200mg?L?1的夏龍方顯著抑制了SGC-7901細(xì)胞的侵襲能力，終濃度50mg?L?1的夏龍方顯著抑制了細(xì)胞遷移。本研究中夏龍方對NCI-N87胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用，提示其在預(yù)防和治療胃癌轉(zhuǎn)移方面具有潛在的應(yīng)用價值。體內(nèi)實驗結(jié)果進(jìn)一步驗證了夏龍方的抗胃癌效果。在成功構(gòu)建NCI-N87胃癌細(xì)胞裸鼠移植瘤模型后，給予不同劑量的夏龍方進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示夏龍方能夠顯著抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。從腫瘤體積和重量數(shù)據(jù)來看，隨著夏龍方劑量的增加，腫瘤體積增長明顯減緩，腫瘤重量顯著降低，高劑量組的抑制效果最為顯著。對腫瘤組織進(jìn)行HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，夏龍方處理組腫瘤細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，細(xì)胞排列疏松，細(xì)胞核染色變淺，核分裂象減少，細(xì)胞形態(tài)趨向于正常化。在觀察各臟器轉(zhuǎn)移情況時，夏龍方處理組裸鼠各臟器的轉(zhuǎn)移灶數(shù)量明顯減少，部分高劑量組裸鼠的臟器中甚至未檢測到明顯的轉(zhuǎn)移灶。這充分說明夏龍方在體內(nèi)能夠有效抑制胃癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，降低腫瘤的惡性程度和轉(zhuǎn)移風(fēng)險，與體外實驗結(jié)果相互印證，為夏龍方作為潛在的抗胃癌藥物提供了有力的體內(nèi)實驗證據(jù)。5.2作用機(jī)制探討：信號通路與蛋白表達(dá)調(diào)控深入探究夏龍方抑制NCI-N87胃癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制，對于理解其藥理作用和開發(fā)新型抗胃癌藥物具有關(guān)鍵意義。通過Westernblot和Real-timePCR等技術(shù)檢測相關(guān)信號通路和蛋白表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)夏龍方可能通過多種分子機(jī)制發(fā)揮作用。PI3K/Akt信號通路在腫瘤細(xì)胞的增殖、存活、遷移和代謝等過程中發(fā)揮著核心作用。在正常生理狀態(tài)下，該信號通路受到嚴(yán)格調(diào)控，參與細(xì)胞的正常生長和發(fā)育。然而，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，PI3K/Akt信號通路常常被異常激活。當(dāng)細(xì)胞表面的生長因子與其受體結(jié)合后，受體自身磷酸化，激活PI3K，PI3K催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為第二信使，招募并激活A(yù)kt，使其發(fā)生磷酸化而活化?；罨腁kt可以進(jìn)一步磷酸化下游多種底物，如mTOR、GSK-3β等，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡、自噬等生物學(xué)過程。在腫瘤細(xì)胞中，PI3K/Akt信號通路的過度激活可促進(jìn)細(xì)胞的異常增殖和存活，抑制細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力，促進(jìn)腫瘤血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，夏龍方能夠顯著抑制PI3K/Akt信號通路的活化，表現(xiàn)為隨著夏龍方濃度的增加，p-Akt蛋白的表達(dá)水平顯著降低。而PI3K和Akt的總蛋白表達(dá)量無明顯變化，且PI3K和Akt基因的mRNA表達(dá)水平在不同濃度夏龍方處理組與對照組之間也無顯著差異。這表明夏龍方對PI3K/Akt信號通路的抑制作用主要發(fā)生在蛋白磷酸化修飾層面，而非基因轉(zhuǎn)錄水平。通過抑制Akt的磷酸化激活，夏龍方阻斷了該信號通路的傳導(dǎo)，進(jìn)而抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程。這一結(jié)果與其他研究中部分中藥對PI3K/Akt信號通路的調(diào)節(jié)作用相似，如人參皂苷Rg3能夠抑制Akt的磷酸化，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移。MAPK信號通路也是一條在細(xì)胞增殖、分化、凋亡和應(yīng)激反應(yīng)等過程中起重要作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。該信號通路主要包括ERK、JNK和p38MAPK三條亞通路，其中ERK通路在腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移中尤為關(guān)鍵。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，多種刺激因素如生長因子、細(xì)胞因子、應(yīng)激信號等可以激活MAPK信號通路。以ERK通路為例，當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時，Ras蛋白被激活，進(jìn)而激活Raf蛋白，Raf蛋白磷酸化并激活MEK，MEK再磷酸化并激活ERK。活化的ERK可以轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1、c-Myc等，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，從而影響細(xì)胞的增殖、分化、遷移和侵襲等生物學(xué)行為。在腫瘤細(xì)胞中，MAPK信號通路的持續(xù)激活可促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活，增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力，促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)，夏龍方能夠抑制MAPK信號通路中ERK的磷酸化激活，隨著夏龍方濃度的增加，p-ERK蛋白的表達(dá)水平顯著降低，而ERK總蛋白表達(dá)量基本不變，且ERK基因的mRNA表達(dá)水平在不同濃度夏龍方處理組與對照組之間無明顯差異。這表明夏龍方對MAPK信號通路的抑制作用主要體現(xiàn)在蛋白磷酸化層面，而非基因轉(zhuǎn)錄水平。通過抑制ERK的磷酸化，夏龍方阻礙了MAPK信號通路的傳導(dǎo)，抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)過程。這與一些研究中中藥對MAPK信號通路的影響一致，如姜黃素能夠抑制ERK的磷酸化，從而抑制肺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是指上皮細(xì)胞在特定的生理和病理條件下向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程。在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，EMT起著至關(guān)重要的作用。正常上皮細(xì)胞具有極性，細(xì)胞間緊密連接，表達(dá)上皮標(biāo)志物如E-cadherin等。而在EMT過程中，上皮細(xì)胞逐漸失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，如高遷移能力、抗凋亡能力等，同時表達(dá)間質(zhì)標(biāo)志物如N-cadherin、Vimentin等。EMT過程受到多種信號通路和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，如TGF-β/Smad、Wnt/β-catenin、Notch等信號通路，以及Snail、Slug、Twist等轉(zhuǎn)錄因子。在腫瘤細(xì)胞中，EMT的發(fā)生可使腫瘤細(xì)胞獲得更強(qiáng)的遷移和侵襲能力，從而突破基底膜，進(jìn)入血液循環(huán)或淋巴循環(huán)，實現(xiàn)腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果表明，夏龍方能夠調(diào)控EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)，抑制間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin的表達(dá)。隨著夏龍方濃度的增加，E-cadherin蛋白和基因的表達(dá)水平逐漸升高，N-cadherin和Vimentin蛋白和基因的表達(dá)水平逐漸降低。這表明夏龍方能夠抑制胃癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，從而降低細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。這一結(jié)果與相關(guān)研究中部分中藥對EMT的調(diào)節(jié)作用相符，如丹參酮ⅡA能夠上調(diào)E-cadherin的表達(dá)，下調(diào)N-cadherin和Vimentin的表達(dá)，抑制肝癌細(xì)胞的EMT過程和轉(zhuǎn)移能力。綜合以上結(jié)果，夏龍方可能通過抑制PI3K/Akt和MAPK信號通路的活化，調(diào)控EMT相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)，從而抑制NCI-N87胃癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。這些作用機(jī)制之間可能相互關(guān)聯(lián)、協(xié)同作用，共同發(fā)揮抗胃癌效應(yīng)。例如，PI3K/Akt信號通路的抑制可能會影響EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性，進(jìn)而調(diào)控EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)；MAPK信號通路的抑制也可能通過影響細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，間接影響PI3K/Akt信號通路和EMT過程。深入研究這些作用機(jī)制之間的相互關(guān)系，將有助于進(jìn)一步揭示夏龍方的抗胃癌作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供更堅實的理論基礎(chǔ)。5.3與其他研究對比分析與其他中藥對胃癌細(xì)胞的作用研究相比，夏龍方展現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢和特點。在抑制胃癌細(xì)胞增殖方面，有研究表明人參皂苷Rg3對人胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖具有抑制作用，其作用機(jī)制可能與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯有關(guān)。然而，夏龍方不僅能夠抑制細(xì)胞增殖，還能顯著抑