基于外周血淋巴細(xì)胞亞群分析的免疫力檢測(cè)評(píng)估及臨床應(yīng)用 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語(yǔ)和定義 1 15檢測(cè)原理 26實(shí)驗(yàn)條件 27試劑與材料 28儀器設(shè)備 39性能驗(yàn)證 310技術(shù)流程圖 311檢驗(yàn)前過程 312樣本處理 413樣本檢測(cè)和分析 514檢測(cè)報(bào)告 615質(zhì)量控制 6附錄A(規(guī)范性)淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)系統(tǒng)的性能驗(yàn)證 7附錄B(資料性)使用細(xì)胞保存液多色流式細(xì)胞免疫表型分析散點(diǎn)圖及淋巴細(xì)胞百分率變化對(duì)比 9附錄C(資料性)樣本分析示例 附錄D(資料性)免疫檢測(cè)指標(biāo)參考范圍 TT/CAWAORG054.1—本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定本文件由北京銘道眾緣生物科技有限公司和中國(guó)老年保健協(xié)會(huì)老年健康標(biāo)準(zhǔn)分會(huì)聯(lián)合提出。本文件由中國(guó)老年保健協(xié)會(huì)歸口。本文件起草單位：北京銘道眾緣生物科技有限公司、北京朝陽(yáng)醫(yī)院、中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院、北京銘道醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室有限公司。本文件主要起草人：李先亮、紀(jì)智禮、賀強(qiáng)、周林、王巍、張繼紅、竇亞玲、郭瑛、孫彥波、姚偉免疫力是人體健康的基石。2023年8月28日，國(guó)家自然科學(xué)基金T/CAWAORG054-2025旨在規(guī)范基于外周血淋巴細(xì)胞亞群分析的免疫力檢測(cè)評(píng)估及臨床應(yīng)用，由兩第1部分：檢測(cè)方法第2部分：評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)及臨床應(yīng)用本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)提請(qǐng)注意，聲明符合本文bloodmononuclearcell,PBMC)提取相關(guān)的專利的使用。專利持有人姓名：銘道創(chuàng)新(北京)醫(yī)療技術(shù)有限公司T/CAWAORG1第1部分：檢測(cè)方法僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本W(wǎng)S/T360-2024流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞白細(xì)胞分化抗原、前向散射光、側(cè)向散射光、設(shè)門、熒光強(qiáng)度、熒光補(bǔ)償、熒光微球。人體自身的防御保護(hù)機(jī)制，是人體識(shí)別和消滅外來侵入的任何異物(病毒、細(xì)菌等)、處理衰老、損傷、死亡、變性的自身細(xì)胞，以及識(shí)別和處理體為以下五個(gè)方面：(1)調(diào)節(jié)性細(xì)胞和效應(yīng)性細(xì)胞之間的平衡；(2)T細(xì)胞與抗原遞呈細(xì)胞之間的平衡；(3)T細(xì)胞與B細(xì)胞以及自然殺傷naturalkiller,NK)細(xì)胞之間的平衡；(4)CD4T細(xì)胞和CD8T細(xì)胞之間的平衡；(5)CD4T細(xì)胞或CD8T細(xì)胞亞群內(nèi)部調(diào)節(jié)性細(xì)胞和效應(yīng)性細(xì)胞亞群的平衡。這種良T/CAWAORG054.1—2EDTA/EDTA-K2:乙二胺四乙酸/乙二胺四乙酸二鉀胞免疫系統(tǒng)、非特異免疫系統(tǒng)和抗原識(shí)別系統(tǒng)選擇特異性指標(biāo)(如T細(xì)胞表面的CD3、CD4、CD8;B細(xì)的CD25、CD127),這些抗原或受體具有組織細(xì)胞特異性(僅表達(dá)于特定淋巴細(xì)胞亞群)和功能相關(guān)性 (參與細(xì)胞活化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)),用熒光標(biāo)記的抗體與細(xì)胞表面相應(yīng)抗原結(jié)合，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)這些6實(shí)驗(yàn)條件6.1實(shí)驗(yàn)室溫度：實(shí)驗(yàn)室溫度應(yīng)穩(wěn)定(20℃~25℃)。樣本處理推薦在低溫條件(例如：在冰盒上)6.2實(shí)驗(yàn)室濕度：濕度應(yīng)控制在30%～70%。6.5實(shí)驗(yàn)室電源要求：連接儀器的電源應(yīng)使用不間斷電源(UPS)。密度為1.077±0.001g/mL。T/CAWAORG054.1—37.2.6流式管12mm×75mm流式專用管。7.2.7樣本離心管15ml尖嘴離心管。8儀器設(shè)備8.1流式細(xì)胞儀應(yīng)為兩激光或三激光檢測(cè)系統(tǒng)，至少配備488nm和640nm激光器，具備六個(gè)熒光檢測(cè)通道。8.2血細(xì)胞分析儀應(yīng)為五分類血細(xì)胞分析儀。8.3離心機(jī)離心力300～500g,水平轉(zhuǎn)子。建議配置低溫離心機(jī)。8.4移液器量程(0.5～10μL、10～100μL、20～200μL、100～1000μL)。8.5漩渦振蕩器點(diǎn)動(dòng)式，圓周振蕩。9性能驗(yàn)證9.1流式細(xì)胞儀的性能驗(yàn)證驗(yàn)證時(shí)機(jī)和驗(yàn)證參數(shù)參考WS/T360-2024第5.1條流式細(xì)胞儀的性能驗(yàn)證執(zhí)行。9.2淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)系統(tǒng)的性能驗(yàn)證包括試劑精密度驗(yàn)證、穩(wěn)定性驗(yàn)證、線性范圍驗(yàn)證、不同檢測(cè)人員可比性驗(yàn)證。具體見附錄A。10技術(shù)流程圖技術(shù)流程見圖1。11檢驗(yàn)前過程4T/CAWAORG選擇含有EDTA-K?抗凝管采集靜脈血樣品5ml。,靜脈血的采集過程按照WS/T661-2020第5條執(zhí)1)選擇手臂肘前區(qū)靜脈，優(yōu)先順序?yàn)檎徐o脈、貴要靜脈。2)用消毒棉簽以穿刺點(diǎn)為中心，以圓形方式由內(nèi)向外螺旋式消毒(直徑≥5cm),待干(約30秒)。3)在靜脈采血部位近心端用手指按壓靜脈，使靜脈充盈暴露。4)保持針頭斜面向上，使采血針與手臂呈30°左右的角度刺入靜脈。6)完成采血，拔出采血針，進(jìn)行止血。1)推薦血液樣本采集后進(jìn)行即刻檢測(cè)，最長(zhǎng)保存時(shí)間不超過室溫6h。2)對(duì)于6h內(nèi)不能完成檢測(cè)的樣本，應(yīng)將樣本轉(zhuǎn)入有細(xì)胞保存液的專用保存管中。添加保存液的血液樣本也應(yīng)該盡早完成檢測(cè)處理，最佳保存時(shí)間不超過72小時(shí)。3)標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)：常規(guī)樣本應(yīng)在18℃~25℃環(huán)境進(jìn)行運(yùn)輸和保存。加入保存液的樣本需冷藏(2℃~8℃)運(yùn)輸。4)保存液：應(yīng)用經(jīng)過驗(yàn)證的細(xì)胞保存液，可以在7天內(nèi)保存細(xì)胞表面標(biāo)志物的水平，保證檢驗(yàn)效果穩(wěn)定。保存液效果驗(yàn)證見附錄C。12.3.2樣本管中加入紅細(xì)胞裂解液2ml,點(diǎn)振混勻，4℃避光15min裂解紅細(xì)胞。12.3.3檢查紅細(xì)胞是否完全裂解(樣本管肉眼觀呈透明酒紅色),若未完全裂解，可適當(dāng)延長(zhǎng)孵育時(shí)12.3.4離心5min,離心力400g,棄去上清。T/CAWAORG054.1—5正常染色，為避免細(xì)胞染色受到不同熒光補(bǔ)償?shù)母蓴_，每個(gè)檢測(cè)細(xì)胞亞群13.1.2穩(wěn)定性驗(yàn)證在流式細(xì)胞儀開機(jī)后，使用質(zhì)控微球進(jìn)行光路/液路穩(wěn)定性驗(yàn)證，確保檢測(cè)通(CV)達(dá)到廠家規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)(參照廠家儀器說明書)。13.1.4熒光補(bǔ)償根據(jù)檢測(cè)項(xiàng)目，分別建立模板，包括B細(xì)胞檢測(cè)、NK細(xì)胞及NKT細(xì)胞檢測(cè)、T細(xì)胞及精細(xì)亞群檢測(cè)和13.1.6數(shù)據(jù)獲取13.1.6.1設(shè)定閾值排除細(xì)胞碎片、血13.1.6.2每一管標(biāo)本至少收集10000個(gè)淋巴細(xì)胞。13.2.3在T細(xì)胞檢測(cè)模板下，分析CD4、CD8T細(xì)胞亞群及其比例以及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞T/CAWAORG613.2.4在DC細(xì)胞檢測(cè)模板下，分析13.3.1驗(yàn)證T、B和NK細(xì)胞相對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)的一致性，其總和應(yīng)接近淋巴細(xì)胞總數(shù)的100%±5%。數(shù)據(jù)完成驗(yàn)證無誤后，可導(dǎo)入實(shí)驗(yàn)室信息系統(tǒng)(LIS)生成淋巴細(xì)胞亞群免疫力檢測(cè)報(bào)告。報(bào)告中實(shí)驗(yàn)室應(yīng)每年參加國(guó)家衛(wèi)健委或當(dāng)?shù)嘏R檢中心組織的全血細(xì)胞分析室和淋巴細(xì)胞分析室間質(zhì)評(píng)活15.4.2實(shí)驗(yàn)室應(yīng)定期組織人員進(jìn)行專業(yè)培訓(xùn)，考核內(nèi)容包括理論知識(shí)T/CAWAORG7(規(guī)范性)臨床開展初期、更換試劑品牌(自購(gòu)試劑)或儀器的重大部件維修后。心對(duì)應(yīng)項(xiàng)目可接受范圍確定自己實(shí)驗(yàn)室可接受的CV值，推薦CV值<5%,最大不超過10%。圍確定自己實(shí)驗(yàn)室可接受的CV值，推薦CV值<5%,最大不超過10%。樣品5份，各轉(zhuǎn)入細(xì)胞保存管中2ml,即刻染色一裂解一固定并上機(jī)測(cè)定，以此結(jié)果作為基線參考水平，旨在明確處理后標(biāo)本的最長(zhǎng)待檢時(shí)間。采集健康人樣品5份，對(duì)完成染色一裂解一固定50%、75%、100%),并計(jì)算稀釋后樣本理論濃度。通過染色一裂解一固定后，上機(jī)測(cè)定，每個(gè)標(biāo)本重復(fù)4次，取均值。分析實(shí)際測(cè)定值與理論值的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)r應(yīng)≥0.975,確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可8分別取5份新鮮EDTA樣本，由不同檢測(cè)人員獨(dú)立進(jìn)行白膜提取一染色一洗滌一上機(jī)檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析，計(jì)算各人員間檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)偏差或絕對(duì)偏差。不同檢測(cè)人員間結(jié)果的相對(duì)偏差或絕對(duì)偏差應(yīng)在實(shí)驗(yàn)室預(yù)設(shè)范圍內(nèi)。驗(yàn)證結(jié)果需詳細(xì)記錄，作為實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制的依據(jù)。9使用細(xì)胞保存液多色流式細(xì)胞免疫表型分析散點(diǎn)圖及淋巴細(xì)胞百分率變化對(duì)比第一天第七天第一天魚三2三15單:=草3l2畫圖B.1EDTA抗凝血樣本第七天c第七天c33三多TT圖B.2細(xì)胞保存液樣本B.2未使用細(xì)胞保存液的EDTA抗凝血樣本和使用細(xì)胞保存液樣本多色流式淋巴細(xì)胞亞群變化比對(duì)見圖B淋巴細(xì)胞(CD19)總T淋巴細(xì)胞(B淋巴細(xì)胞(CD19)第5天第5天0第7天第1天第3天第7天第1天第5天第1天第3天第5天第1天第3天—EDTA抗凝血樣本一—細(xì)胞保存液樣本——EDTA抗凝血樣本一—細(xì)胞保存液樣本NK淋巴細(xì)胞(CD3/CD16'NK淋巴細(xì)胞(CD3/CD16'CD56')5第7天第7天第5天第3天第1天第1天第3天第5天第7天第7天第5天第3天第1天—EDTA抗凝血樣本—細(xì)胞保存液樣本——EDTA抗凝血樣本—細(xì)胞保存液樣本抑制/細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CD3'CD8*)天數(shù)圖B.3使用細(xì)胞保存液前后各淋巴細(xì)胞百分率變化比對(duì)T/CAWAORG054.1—11 (資料性)◎8dCdT/CAWAORG(資料性)免疫檢測(cè)指標(biāo)參考范圍免疫檢測(cè)指標(biāo)