諾如病毒的實驗室檢測

（一）標本采集

多種病原體可引起急性胃腸炎聚集性或暴發(fā)疫情，應充分考慮不

同病原體檢測對標本采集和保存的特殊要求。因此對同一采集對象,

應按照細菌、病毒、寄生蟲等不同要求，采集、分裝和保存多份標本，

以備必要時做其他病原體檢測、復核實驗結(jié)果或進一步鑒定。采樣時

需填寫標本信息登記表（見附件4）。

L標本類型

⑴糞便

諾如病毒檢測首選糞便標本。每份標本5g或5ml以上，直接放

置于清潔、無菌、干燥的密閉容器內(nèi)。容器內(nèi)不可加入任何保護劑、

培養(yǎng)基、去污劑或金屬離子，不可稀釋。

⑵肛拭子

肛拭子標本不能長期保存，且檢出率低于糞便標本。肛拭子含糞

便量很低時，如檢測結(jié)果呈弱陽性，結(jié)果容易被誤判，導致假陰性。

采集時需注意肛拭子上應有可見的糞便，放入無菌帶蓋密閉采樣管。

采樣管中應有2ml無菌PBS緩沖液或Hank為液，液體需沒過肛拭子

棉簽部分，并盡快檢驗。

⑶嘔吐物

嘔吐物每份標本采集5g或5ml以上，直接放置于清潔、無菌、

干燥的密閉容器內(nèi),容器內(nèi)不可加入任何保護劑、培養(yǎng)基、去污劑或

金屬離子，不可稀釋。

⑷水

目前沒有水樣品采集量的權(quán)威規(guī)定。懷疑水源性暴發(fā)時，建議盡

量采集1升以上的水樣品。桶裝水、瓶裝水等直接采集原包裝，自來

水需要以無菌容器采集。采用膜過濾法濃縮后檢驗，有助于提高檢出

率。

⑸食品

由于食品成分復雜、病毒含量不高，從食品樣品中提取諾如病毒

RNA的回收率受限。本指南僅提供海產(chǎn)品、草莓、藍莓和部分蔬菜的

參考方法。推薦采集牡蠣、海虹至少10個，三文魚200克，扇貝、

毛蠟、文蛤等250克，草莓、藍莓250克，生菜和芽苗菜等500克。

食品樣品應置于無菌容器中，立即冷藏，當天運至實驗室進行檢

驗。

⑹環(huán)境涂抹樣

根據(jù)疫情調(diào)查需要采集疫情發(fā)生機構(gòu)相關(guān)場所如廚房、廁所、門

把手、玩具等環(huán)境涂抹樣品。可用無菌拭子在無菌PBS里蘸濕，用力

涂抹待采表面（最大面積100cm2）后，立即浸入核酸提取試劑盒裂解

緩沖液中（QIAamp試劑盒560ul,Genaid試劑盒400ul）。

2.標本采集對象

⑴病例

采集病例發(fā)病2.5天內(nèi)的糞便、帶便肛拭子或嘔吐物標本。若病

例在10例以下，全部采集；病例在10例以上，至少采集10例病例

的標本。根據(jù)初步流行病學調(diào)查結(jié)果，盡量采集重點病例（如首發(fā)病

例、指示病例、住院病例、發(fā)病的食品從業(yè)人員、重點崗位的病例等）

的標本。

⑵重點人群

根據(jù)疫情調(diào)查需要，可采集食品從業(yè)人員、護理員等工作人員的

糞便、帶便肛拭子標本。重點采集近期出現(xiàn)過胃腸不適癥狀、直接接

觸食品的食品從業(yè)人員、直接接觸早期病例的護理人員等。

3.標本保存和運輸

標本在4℃冰箱可暫存12小時，之后標本應放置-20C以下冷凍

保存，需長期保存的標本應儲存在-70℃冰箱，避免反復凍融。依據(jù)

《人間傳染的病原微生物名錄》，含諾如病毒的標本屬于B類包裝分

類，需按照UN3373規(guī)定進行包裝和手續(xù)申報，并在冷藏或冷凍條件

下運送。通常對于短途運輸（1天以內(nèi)），包裝盒內(nèi)放冰袋或冰排,

長途運輸（1-2天）需用干冰。但無論短途或長途運輸，均需保證凍

存標本在運輸過程沒有出現(xiàn)融化。標本送達實驗室時應包裝完整，包

裝盒內(nèi)應有未融化的冰。在運輸中應避免強烈震動、重力擠壓等現(xiàn)象。

標本保存和運送的條件應有詳細記錄。

（二）標本檢測

為避免實驗室污染，食品、水、環(huán)境樣品與病人標本不能在同一

實驗室檢測，必須分別在獨立的空間進行樣品處理和檢驗。

1.核酸檢測和基因型鑒定

完整的檢測流程應包括以下6個步驟，見圖1。

圖1諾如病毒核酸檢測和基因型鑒定流程圖

（DReal-timeRT-PCR

0RF1/0RF2區(qū)是諾如病毒基因組中最保守的區(qū)域，在同一基因

型不同毒株間有相同的保守序列，根據(jù)這段保守區(qū)域可用于設計

TaqMan為基礎的Real-timeRT-PCR的引物和探針。除可檢測病例臨

床標本中的諾如病毒RNA外，引物和探針經(jīng)優(yōu)化提高靈敏度后，還

可用于環(huán)境樣本（如食物和水）的檢測。Real-timeRT-PCR的敏感性

高于傳統(tǒng)RT-PCR,可檢測諾如病毒GI辭和GII群。

⑵傳統(tǒng)RT-PCR

采用傳統(tǒng)RT-PCR對Real-timeRT-PCR陽性標本的PCR產(chǎn)物進

行測序，通過序列分析確定諾如病毒的基因型。測定ORF2完整衣殼

蛋白基因序列，是諾如病毒基因分型的金標準?；蚪M中四種不同的

區(qū)域（RegionA-D）均可用于諾如病毒基因分型，基于衣殼蛋白區(qū)

RegionC和D兩區(qū)域分型效果更好。但對于GII.4變異株的進一步分

型，僅根據(jù)RegionC序列不足以區(qū)別，需進一步擴增RegionD。

2.抗原檢測

由于諾如病毒抗原高度變異（基因型超過29個）且某些基因型

存在抗原漂移（如GII.4型），開發(fā)廣泛反應的ELISA方法存在較大

挑戰(zhàn)。雖然目前已有商品化的試劑盒如IDEIA（Oxiod,英國）、

SRSV（II）-AD（DenkaSeiken,日本）以及RIDASCREEN（r-Biopharm

AG,德國），但其敏感性（36%-80%）和特異性（47%-100%）均不

太理想。即使已通過美國FDA認證的RIDASCREEN諾如病毒第三

代ELISA試劑盒，也沒有在美國廣泛應用。ELISA可適用于暴發(fā)疫

情中大量樣本的篩查，但不適合散發(fā)病例的檢測。ELISA檢測結(jié)果陰

性的樣本還需要通過Real-timeRT-PCR進行第二次檢驗確認。鑒于

ELISA試劑盒成本高、敏感性低，ELISA方法僅可作為輔助檢測手

段。標本處理、核酸提取和檢測、測序和基因定型，抗原檢測的操作

方法和要求見附件5。

附件4/病例或重點人群標本采集登記一覽表

標本姓名性別年齡發(fā)病日期采樣日期標本備

編號類型注

附件4?2水、食品和環(huán)境標本采集登記一覽表

標本

暴發(fā)編號采樣日期采樣數(shù)量標本類型備注

編號

附件5諾如病毒標本處理和實驗室檢測技術(shù)方案

諾如病毒完整的檢測及分型流程包括標本前處理、RNA提取、

Real-timeRT-PCR檢測、傳統(tǒng)RT-PCR檢測、測序和基因分型6個步

驟。Rcal-timeRT-PCR方法靈敏度和準確度高，是檢測諾如病毒的金

標準。用傳統(tǒng)RT-PCR可對Real-timeRT-PCR陽性標本的PCR產(chǎn)物

進行測序，通過序列分析確定諾如病毒的基因群和基因型。在發(fā)生聚

集或暴發(fā)時，ELISA方法可作為輔助的手段快速檢測諾如病毒抗原。

食品、水、環(huán)境涂抹樣檢測方法的靈敏度不穩(wěn)定，僅作為參考方法。

1標本前處理

1.1糞便、嘔吐物

1.1.1設備和材料

微量移液器、無菌過濾器、漩渦振蕩器、微量離心機、1.5ml無

菌離心管、磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS)10mMpH7.0-7.4o

LL2操作方法

(1)離心管每管分裝0.5mlPBS。用一次性移液管(或無菌棒)添

加豌豆大小的糞便(約().1克)，稀釋成約10%至20%(重量/體積)

的糞便懸浮液。當糞便樣品是液態(tài)時，不必在PBS中稀釋，直接使用

500ul的樣品。

(2)漩渦振蕩每個樣品1分鐘。在5000rpm下離心5分鐘，使

得固體沉淀。澄清上清液可以直接用于病毒核酸提取或貯存于?70。€\

(3)取澄清的上清液200ul進行RNA提取。

1.2水

通過陰離子濾膜過濾水樣品。用牛肉膏(1.5%w/v)含0.05M甘

氨酸(pH9.0)緩沖液洗脫附在膜上的病毒。使用Microsep100TM或

CentriconTMcolumns離心管進一步濃縮洗脫液。

1.2.1設備和材料

DEPC水、新配置次氯酸鹽(至少1%)或等效消毒劑、Millipore

HAfilter(孔徑0.45um、)、換膜過濾器、真空泵、計時器、PH值酸度

計、磁力攪拌器及轉(zhuǎn)子、低溫冰箱(-2(TC、?7(TC)、Microsep100K

columns(PALL公司)、CentriprepYM-50(MiHipore公司)、洗脫液

(BE-().()5GlypH7.0).PBS(pH7.2)、離心機、氯仿、丁醇。

1.2.2操作方法

1.2.2.1過濾裝置準備

(1)使用無菌的鏡子將濾膜放在濾器架上，濾膜有三層，型號分

別為MilliporeHAfilterAPI5和AP20,放置順序為MilliporeHAfilter

fAP15fAP20。

注意：暴露出濾膜表面使其能與水樣接觸，請將濾膜光滑表面的

那邊向下。所有的玻璃器皿應干凈無菌。每批水樣使用不同的漏斗。

(2)將濾膜置中，將有刻度的漏斗放在濾器的上邊。

(3)使用不銹鋼濾器夾進行水的密封。

(4)真空泵連接1000ml的錐形瓶。

注意：為防止氣溶膠的污染，應在無菌的環(huán)境中過濾，在生物安

全柜進行操作。

(5)向濾器中倒入20ml無菌水(DEPC水)檢查濾膜的密封情

況。

(6)打開泵，調(diào)整水的流速至形成緩受的細流。

1.2.2.2水樣品的過濾

(1)向玻璃漏斗里倒水樣，當水樣完全濾過立刻關(guān)閉真空泵。

(2)用不銹鋼的濾器夾，小心移開濾膜上的刻度漏斗。

1.2.2.3用酸漂洗濾膜

將膜用無菌的鑲子夾放在有200ml0.05mMH2SO4(pH3.0)的無

菌500ml燒杯中進行漂洗濾膜去除Mg2%

1.2.2.4洗脫

(1)將膜夾出放在無菌的60mm培養(yǎng)皿中，加5ml洗脫液。蓋

上鋁箔。

注意：要將濾膜的上邊向下(倒置)放在錐形瓶里。

(2)將錐形瓶放在恒溫搖床上，轉(zhuǎn)速45rpm,室溫(23寸±3℃),

15mino

(3)關(guān)閉搖床，將洗脫液(大約5ml)轉(zhuǎn)移到管子里。

1.2.2.5中和洗脫液

用1NHC1或INNaOH調(diào)整洗脫液的pH到7.0-7.4。檢測前，洗

脫液在-7CTC儲藏。

1.2.2.6二次濃縮

方法一：用Microsep100Kcolumns或Centripr叩YM-50濃縮病

毒

(1)為防止病毒的附著，先用無病毒粒子的洗脫液浸濕過濾器。

(2)將水標本濾膜洗脫液(大約5ml)加入到濃縮柱中，5()00rpm

離心5mino

(3)吸取濃縮液(約150g),轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中。

方法二：PEG沉淀

(1)向標本洗脫液中加入NaCl終濃度是O.3mol/L(若洗脫液為

5ml加0.08775g的NaCl),有助于病毒的沉淀，再等量加入PEG-6000

終濃度為12.5%(w/v)(若洗脫液為5ml,加0.0625g的PEG-6000o

4℃過夜。

(2)4℃,lOOOOrpm離心30分鐘，一集沉淀。

(3)MilliporeHAfilter,傾倒并棄掉上清液。每個離心管添加150-

500plpH7.2(±0.2)PBS重懸沉淀物。將離心管放置在離心管架上，

為更好的讓緩沖液與沉淀物接觸，將離心管架成一定角度放置。室溫

放置30mino

注意：如果沉淀物沒有溶解，可用緩沖液反復的輕輕吹打沉淀物。

吹打過力會產(chǎn)生氣泡。

(4)向懸液中加入等體積的氯仿/丁醇(1:1vol/vol)混合。去除

病毒懸液中的抑制劑。

(5)4℃,lOOOOrpm,離心20分鐘。

(6)分離出水相(上清液)，-8(TC儲藏。

(7)取200酎上清液進行核酸提取。

1.3環(huán)境涂抹樣

1.3.1將棉簽在PBS里蘸濕，用力涂抹待測表面(最大面積

100cm2）后，立即浸入核酸提取試劑盒裂解緩沖液中（QIAamp試劑

盒560g,Genaid試劑盒400限），將棉簽用力壓EP管的側(cè)壁，釋放棉

簽中的液體。重復浸入和壓側(cè)壁的步驟3-4次，確保病毒最大釋放

量，直接進入核酸提取步驟。

1.4食品

1.4.1貝類

1.4.1.1設備和材料

諾如病毒質(zhì)控樣（中國食品藥品檢定研究院）、高速離心機（可

離心15mL?50mL體積）、臺式離心機、碎花制冰機、生物安全柜、實

時熒光定量PCR檢測系統(tǒng)、眼科剪、眼科鑲、一次性無菌培養(yǎng)皿、

恒溫搖床、高壓滅菌器、電磨均質(zhì)器（LX134M0）、一次性研磨杵（上

海生工）、15mL去RNAase離心管、1.5mL去RNAaseEppendorf管、

20回、200匹、lOOOpL微量移液器、PBS溶液pH7.2（Gebico）、

蛋白酶K（PCR級Roche）o

1.4.1.2貝類樣品處理程序

1.4.1.3解剖方法

5個貝類個體作為一件樣品，分別解剖，取其消化腺和腸道，用于

檢測。如果一件樣品的消化腺和腸道的總質(zhì)量不夠2.0g,應適當增加

取樣量，使得每件樣品檢驗的總質(zhì)量達到2.0g。

(1)牡蠣的解剖方法

使用滅菌的刀具將牡蠣殼撬開，使用滅菌的眼科剪和眼科鑲，先

將牡蠣的內(nèi)臟部分剪取下來放到一個滅菌的平皿里，沿腸道將牡蠣軟

體部分剪開，暴露出腸道和消化腺，將多余的組織去掉，取其消化腺

和腸道用于檢測。牡蠣的解刨過程及解剖結(jié)構(gòu)見下圖。

(2)海虹

用滅菌刀具將雙殼撬開，將消化腺用鑲子直接夾下，同時盡量將

腸道取下。由于海虹的消化腺相對牡蠣較小，所以需要增加取樣的海

虹個體數(shù)，以使得總質(zhì)量達到2.0g,用于后續(xù)的檢測。海虹的解剖結(jié)

構(gòu)見下圖，圖中鑲子所指的位置為海虹的消化腺。

(圖片由中國食品藥品檢定研究院生物檢測室提供)

(3)扇貝、毛蠟與文蛤

扇貝與毛蠟的解剖結(jié)構(gòu)與海虹相似，參照海虹的方法將殼打開

后，直接判斷消化腺所處的位置，用眼科鑲和眼科剪，將其消化腺

和腸道取下用于諾如病毒的檢測。文蛤的消化腺包在內(nèi)臟團里，在

解剖時可以直接用鑲子在內(nèi)臟團消化腺位置撕開，將消化腺取下，

同時將腸道取出，用于檢測，文蛤的消化腺體積較小，需要適當增

加取樣量以滿足檢驗的要求。

1.4.1.4均質(zhì)

將上述解剖下的消化腺和腸道放到50mL滅菌的小燒杯內(nèi)，用電

磨均質(zhì)器(LX134MO)將消化腺仔細打碎，成糊狀。

1.4.1.5蛋白酶K消化

將上述均質(zhì)的消化腺，分別稱取2.0±0.1g,加入15mL的離心管，

然后每管加入2mL的PBS溶液，加入2()mg/mL蛋白酶K(Roche)

溶液10pL進行消化，另外取1件樣品加入諾如病毒的陽性質(zhì)控球,

作為外部質(zhì)控陽性對照。

1.4.1.6將上述樣品于搖床372,320rpm振蕩lh。恒溫水浴6（TC,

保持15min；將15mL離心管,3000g離心5min,取200四用于

RNA的提取，剩余部分冷凍保存，用于復檢。

1.4.2三文魚

1.4.2.1設備和材料

諾如病毒質(zhì)控樣（中國食品藥品檢定研究院）、恒溫振蕩器、食

品均值器、天平:感量0.1g、高速低溫離心機（4℃,10000g）.

5xPEG8（）0（）/NaCl溶液（PEG8000500±2g,NaCl87±1g,先用450mL

蒸儲水溶解，稍微加熱，待溶解后定容至1000mL,121℃,15min滅

菌）、磷酸鹽緩沖液（PBSpH7.2）、Tris/甘氨酸/牛肉膏緩沖液（TGBE）

（Trisbase12.1±0.2g,甘氨酸3.8±0.1g,牛肉膏10±1.0g,蒸倍水

1000±lmL,121℃,15min滅菌）、氯仿/正丁醇（1:1體積比）溶液。

1.4.1.2樣品處理程序及方法

三文億25g

4亡.lOOOOg

附心30min

1/4示枳的

5xPEG溶液

4X??60r/min

賽防60min

▲

4T?.lOOOOg

閥心30mln

PBS4（

XtZF/iETW（l：l）

$""

4X?.1OOOOg

肉心工5min

(1)取三文魚樣品25g,剪碎后置于帶濾網(wǎng)的均質(zhì)袋中，加人

TGBE緩沖液40mL,均質(zhì)均勻，于室溫60r/min震蕩20min。

(2)取濾液至50mL新的離心管中，4℃,10000g離心30min。

(3)取上清液(小心避開液體表面的油脂層)，加入上清液1/4

體積的5xPEG/NaCl溶液，顛倒60s,4℃,60r/min震蕩60min。

(4)將上述溶液于4℃,10000g離心30min,棄去上清淺。

向沉淀物中加入PBS溶液700叱，震蕩重懸。

(5)加入與上述重懸液等體積的氯仿/正丁醇(1:1)溶液，充分

振蕩，室溫孵育5min。于4°C,10000g離心15min。

(6)取上層水相液體200HL用于提取病毒RNA。

1.4.3草莓、藍莓

1.4.3.1設備和材料

諾如病毒質(zhì)控樣(中國食品藥品檢定研究院)、PEG8000

(Polyethyleneglycol).氯化鈉(NaCl)>氯化鉀(KC1)、碳酸氫鈉

(NaHCO3)、磷酸二氫鉀(KH2PO3)、磷酸氫二鈉(Na2HPO3)、NaOH

溶液(5M)、HC1溶液(1M)、純水(MilliQ系統(tǒng)凈化)、氯仿(Methenyl

trichoride)、丁醇(1-Butanol)、牛肉膏(BeefExtract)、甘氨酸(Glycine)、

蛋白酶K(ProteinaseK)、果膠醋(PectinasefromAspergilusniger,

Sigma)、5xPEG/NaCl緩沖液(PEG8000500±2g,NaC187±lg,先用

450mL蒸偏水溶解，稍微加熱，待溶解后定容至1000mL,121℃,

15min滅菌)、TGBE緩沖液(Trisbase12沼±0.2g,甘氨酸3.8±0.1g,

牛肉膏l(xiāng)()±1.0g,蒸儲水1000±lmL,121℃,15min滅菌)、DHZ-D

型冷凍恒溫振蕩器、FE20K型酸度計、小型高速離心機、CR22E型高

速冷凍離心機。

143.2樣品處理程序及方法

(1)取樣稱取25g草莓(藍莓)樣本放入濾膜均質(zhì)袋中，加入

40mITGBE緩沖液，(取一份樣本作為陽性對照，可在這步加入諾如

病毒的陽性質(zhì)控球)，以及30單位果膠酶(PectinasefromAspergikis

niger,Sigma)o

(2)樣品提取室溫振蕩孵育lOmin,測量pH值。若pH<90,

用NaOH(5M)溶液小心調(diào)節(jié)至9.5,再振蕩孵育10mino每調(diào)節(jié)一次

pH值后，孵育lOmin,直至pH>9.0；將流出液倒至離心管中(必要

情況下使用2個離心管)，4℃,10000g離心30min；上清移至一新管

或瓶，用HC1(1M)調(diào)節(jié)pH至7.0±0.5。

(3)樣品富集濃縮加入1/4體積的5xPEG/NaCI緩沖液，在42

條件下，于振蕩孵育器孵育60min；4℃,H)OO()g離心30min(必要

情況下將液體分裝于2只離心管)。

棄去上層溶液，4℃,再次10000g離心5min以使顆粒緊湊。

棄去上層溶液，用5003PBS重懸沉淀。如果一個樣品分兩管離

心，則用同樣體積PBS依次重懸。

將重懸液移至新的EP管中，加入等體積的氯仿/丁醇溶液，渦旋

混勻，室溫孵育5min。4℃,10000g離心15min,小心將水相轉(zhuǎn)移至

新管待提取RNA。

1.4.4生菜和苗芽菜

1.4.4.1設備和討料

食品均質(zhì)器(可拆卸、可清洗、可高壓滅菌)、電子天平(感量

0.01g)、臺式離心機(最高轉(zhuǎn)速15000g).微型離心機、電熱恒溫水

浴鍋(0-100℃),渦旋振蕩器、實時熒光PCR儀、Roche,LightCycler

480o

144.2樣品處理程序及方法

(1)同一批次的生菜或苗芽菜樣品，隨機抽取樣品數(shù)不少于5

件，并用滅菌處理的剪刀剪碎至2.5cmx2.5cmx2.5cm大小的形狀，稱

量25g放入帶有濾膜均質(zhì)袋一側(cè)中，作為待試樣品。另稱取200g樣

品放入50mL離心管中，-8(TC保存，留作備樣，并做好標記。

(2)向上述均質(zhì)袋中加入40mLTGBEbuffer,均質(zhì)器拍打混勻，

尼龍扎帶封口后，室溫振蕩約20min0

(3)將均質(zhì)袋濾膜一側(cè)液體傾入50mL離心管，42條件下

1OOOOxg離心30mino

(4)離心結(jié)束后，將上清轉(zhuǎn)移至另一50mL離心管，加入1/4

倍體積的5xPEG/NaCl溶液，室溫條件振蕩60mino

(5)振蕩完畢，4℃條件下1OOOOxg離心30min。

(6)離心結(jié)束，棄上清，繼續(xù)4七條件下10000xg離心5mm壓

實沉淀。

(7)向沉淀加入500PLpBS溶液以溶解沉淀。吸取溶解沉淀后

的PBS溶液200|iL轉(zhuǎn)移至無菌離心管中，作為試樣。剩余的溶液分

裝到離心管中標記作為備樣，?8()。(2凍存。

2核酸提取

各類樣品經(jīng)前處理后，每個樣品分別取200ul,下面表格中提供

的RNA提取試劑盒供參考，按試劑盒說明書操作提取RNA。

樣品種類試劑盒

糞便或嘔吐物QIAGEN病毒核酸提取試劑盒(QIAamp?viral

RNAminikit)或Geneaid病毒核酸提取試劑盒

(ViralNucleicAcidExtractionKitII)

水和環(huán)境標本NucliSENSLysisBuffer和NucliSENSMagnetic試

劑盒(梅里埃公司)

食品標本HighPureViralRNAKit(羅氏公司)

3諾如病毒核酸檢測方法

3.1糞便、嘔吐物、肛拭子、水、環(huán)境涂抹樣

3.1.1諾如病毒雙重Real-time(TaqMan?)RT-PCR分析

3.1.13使用范圍:ABI7500realtimePCR.Smartcycler(Cepheid),

Mx3()()5P,Mx3()()()P(Stratagene)和ICycleriQTMReal-TimePCR檢測

系統(tǒng)(BioRad)等。

本設計應用QuantiTectMultiplexRT-PCRKits(Qiagen),引物和

探針濃度分別被優(yōu)化為終濃度400nM和200nM。每個試劑盒特異

的RT最適環(huán)境和活化步驟，需要遵循制造說明書使用。

該試驗方法來自美國CDC諾如病毒暴發(fā)網(wǎng)絡(CaliciNetUSA)

雙重Real-timeRT-PCR操作標準，引物設計參考文獻［59］。

3.1.1.2設備和材料

渦流混合器、微量離心機、移液器(量程為P20、P200和

P1000)、Real-timePCR儀可以是ABI7500(ABI)、Smartcycler

(Cepheid)、Mx3005PorMx3000P(Strategene)或BioRadiCycleriQTM

Real-TimePCR檢測系統(tǒng)(BioRad)。一次性手套、帶濾芯槍頭、無菌

1.5ml微量離心管、RNA酶去除劑、96■孔反應板、蓋子或薄膜。

3.1.1.3諾如病毒寡核甘酸引物/探針

表1多重熒光定量RT-PCR擴增諾如病毒的引物和探針

引物/工作濃

基因型序列(5'?3')

探針度nM)

CogIFCGYTGGATGCGITTYCATGA400

Cog1RCTTAGACGCCATCATCATTYAC400

FAM-AGATYGCGATCYCCT

GIRing1A200

GTCCA-BHQ*

FAM-AGATCGCGGTCTCCTGTC

RingIB200

CA-BHQ*

CARGARBCNATGTTYAGRTGG

Cog2F400

ATGAG

GIICog2RTCGACGCCATCTTCATTCACA400

JOE-TGGGAGGGCGATCGCAAT

Ring2200

CT—BHQ**

*GIT叫Man?探針：5,端用FAM熒光素標記，3,端用BHQ淬滅基團

標記;BHQ淬滅基團1更好。

**GIITaqMan?探針：5,端用JOE(HEX或VIC等)熒光素標記，3,端用BHQ淬滅基

團標記。

3.1.1.4操作方法

(1)實驗準備

用RNA酶去除劑擦拭工作臺表面、移液器和離心機除去潛在的

RNA酶污染。RealtimePCR儀開機預熱15分鐘。

(2)試劑準備

①所有試劑冰浴。

②輕彈管壁混合2xQuantiTectMultiplexRT-PCRMasterMix反應

液。

③渦旋所有引物和探針5秒鐘。

?QuantiTectMultiplexRTMix.引物、探針置于冰上。

(3)對照設立

每一次實驗都要包括無模板對照(NC)(第一個和最后一個孔各

設一個)和陽性對照(PC)(GI和GII諾如病毒核酸或標準品)。

(4)檢測

注意：請在PCR清潔區(qū)準備、配制反應體系(mastermix)。

①在1.5ml離心管中準備masterm漢。

②確定每次分析的反應數(shù)(N),需要多配反應數(shù)來彌補重復移液

中的小量丟失：

?如果樣本數(shù)(n)(包括NC和VC對照)=1?14,做n+1個反

應的mix。

?如果樣本數(shù)(n)(包括NC和VC對照)〉15,做n+2個反應

的mix。

③配制Real-timeRT-PCR反應混合液22.5pd(表2)

表2諾如病毒雙重反應體系配制方案

(QuantiTectMultiplexRT-PCRKits)

組成成分體積(ul)終濃度

RNase-freewater4.25

CogIF(10gM)1400nM

Cog1R(WpM)1400nM

Ring1A(10|iM)0.5200nM

RingIB(IO^IM)0.5200nM

Cog2F(lOgM)1400nM

Cog2R(lOpM)1400nM

Ring2(10|iM)0.5200nM

RNase-freewater4.25

QuantiTectMultiplexRTMix0.25

2xQuantiTectMultiplexRT-PCR

12.5lx

MasterMix

④吸打混勻MasterMix。

⑤按如下方式排列陰性對照、陽性對照和樣品，在每孔中加入

22.5plMasterMixo

123456789101112

ANSIS2S3S4S5S6S7S8NCPCPC

C(GI)(GII)

B

C

D

E

F

G

H

*陰性模板對照(NC)加入第一列，樣本加入后面的11列，檢查加

入樣本時可能的交叉污染。病毒模板對照(PC在所有樣本和NC密

封后加入到最后。

⑥加入2.5WDEPC水到第一個NC孔，蓋好。

⑦將反應平板轉(zhuǎn)移到核酸處理區(qū)域或清潔區(qū)外面。

⑧將RNA樣本從-70%：冰箱轉(zhuǎn)移在冰上融化;漩渦振蕩5秒鐘之后

快速離心5秒鐘，移液2.5KRNA樣本到標記好的孔。例如，加樣本1

(S1)到平板位置A2和B2。如果樣本體積小于2.5yl,加DEPC水至反

應管使總反應體積達到25

⑨加2.5囚水到最后的NC孔，蓋好。

⑩最后，移液GI和GII諾如病毒陽性對照各2.5可到適當?shù)腜C孔，

蓋好。

?小心混合平板。

?4℃離心平板500rpmI分鐘，以移除孔中可能存在的氣泡和液

滴。

?RT-PCR擴常條件：按照ABI7500(orotherplatform)的說明

書放置好平板。終反應體積為25M。根據(jù)QuantiTectMultiplexRT-

PCRKits說明書，RT-PCR熱循環(huán)程序為：

循環(huán)數(shù)溫度時間

150℃20min

195℃15min

4594℃45S

60℃45S

3.1.1.5結(jié)果解釋

(1)陰性對照(NC)

如果一個或更多NC反應出現(xiàn)假陽性,則可能發(fā)生了污染。這種情

況下，檢測無效，需重復檢測。

(2)陽性對照(PC)

陽性對照產(chǎn)生超過閾值的熒光曲線或擴增圖像。

(3)檢測樣本

只有在所有質(zhì)量控制嚴格準確時，如果曲線在Ct值為W40,則

認為檢測樣本為陽性。

3.1.2諾如病毒傳統(tǒng)RT-PCR分析

3.1.2.1原理

人諾如病毒分為5個基因組(Genogroup,G),其中GI、GII和

GIV型可感染人。本方案利用衣殼蛋白的部分區(qū)域(regionC)來對

諾如病毒進行分型c本方案由四個引物組成，擴增ORF2的5,末端,

編碼主要外殼蛋白VP1。引物G1SKF和G1SKR用于GI的檢測，擴

增片段330bp。引物和CoG2F和G2SKR用于GII的監(jiān)測，擴增片段

387bpo

3.122設備與材料

渦流混合器、微量離心機、移液器、PCR儀、微波爐、電泳儀和

制膠器。一次性手套、帶濾芯槍頭、無菌1.5-ml微量離心管、RNA

酶去除劑、薄壁PCR管(Rnasefree,0.5ml)、LoadingBufferQiangen

OneStepRT-PCRKit(貨號：210212)。

322.3諾如病毒寡核苔酸引物/探針(見表3)

表3諾如病毒傳統(tǒng)RT-PCR寡核甘酸引物

Region型別引物名稱序列⑸3)產(chǎn)物(bp)

G1SKFCTGCCCGAATTYGTA

（十）AATGA

I330

G1SKRCCAACCCARCCATTR

C（十）TACA

COG2FCARGARBCNATGTTY

（十）AGRTGGATGAG

n387

G2SKRCCRCCNGCATRHCCR

（-）TTRTACAT

Y=CorT;H=A,C,orT;R=AorG;I=inosine;S=CorG;N=

G,A,T,orC;W=AorT;K=GorTo

3.224操作方法

(1)實驗準備

用RNA酶去除劑擦拭工作臺表面、移液管和離心機以去掉潛在

的RNA酶污染。

(2)試劑準備

①所有試劑冰浴。

②輕彈管壁混合5X緩沖液。

③離心酶、RNA酶抑制劑和dNTPs后將其放在冰上備用。

④渦旋所有引物5秒鐘，離心5秒鐘備用。

(3)對照設立

每次PCR實驗都應設置陰性對照和陽性對照，包括諾如病毒GI

和GIL陽性對照為陽性糞便樣品。

(4)檢測

注意：在PCR清潔區(qū)配置反應體系。

①用1.5ml離心管準備反應體系。

②確定每次分析的反應數(shù)(N),在操作需配置過量的反應體系來

校正重復移液中的小量丟失；見下面的樣本：

?如果樣本數(shù)(n)(包括NC和VC對照)=1-14,做n+1個反

應的mix。

?如果樣本數(shù)(n)(包括NC和VC對照)>15,做n+2個反應

的mix。

③將每個引物對按以下計算量添加到反應混合液中(表4和

5)o

表4諾如病毒RegionC反應體系-GenogroupI

成分體積/反應（可）最終濃度

5XRT-PCRBuffer51X

dNTPmix1

Enzymemix1

GISKF(50nM)0.25500nM

GISKR(50pM)0.25500nM

RnaseInhibitor(30-

0.50

40U/W)

Rnase-freewater12

反應體系總體積20

表5諾如病毒RegionC反應體系-GenogroupII

成分體積/反應（M）最終濃度

5xRT-PCRBuffer51X

dNTPmix1

Enzymemix1

COG2F(50|1M)0.25500nM

GIISKR(50|xM)0.25500nM

RnaseInhibitor(30-

0.50

40U/|il)

Rnase-freewater12

反應體系總體積20

④用移液管上下吹打混合液。

⑤向每個反應管中分裝20ul混合液。

⑥設立陰性對照，加5U1DEPC水。

⑦將反應管轉(zhuǎn)移到核酸處理區(qū)。

⑧將病毒核酸在冰上融化，漩渦振蕩5秒鐘之后快速離心5秒

鐘。

⑨移取5ul的RNA模板到每一個相應的反應管中。

⑩最后加印陽性對照。

血多所有的反應管放置在PCR儀上，按照下面的條件設置：

循環(huán)數(shù)時間溫度℃

130min42

115min95

30sec95

4030sec50

30sec72

1lOmin72

?準備2%的瓊脂糖凝膠，進行核酸電泳。

(5)解釋

如果陰性對照出現(xiàn)條帶，說明可能出現(xiàn)污染，需重復實驗。陽

性對照在正確位置出現(xiàn)條帶，則判定反應體系工作正常。

3.2食品諾如病毒熒光定量PCR(RocheLightMix?Kit

NorovirusGGI,GGH,MS2或等效的諾如病毒檢測試劑盒)

3.2.1反應體系及儀器設置

反應體系的添加按下表：

表6諾如病毒定量PCR體系

試劑1個反應1()個反應

PCR水4.3ul47ul

Activator激活劑1.3ul14.3ul

引物和探針lulllul

內(nèi)對照lulllul

預混液7.4ul81.4ul

模板5ul-

總體積