多拉菌素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移侵襲的影響及機(jī)制：基于THBS1/FAK/MMPs信號(hào)通路的研究一、引言1.1研究背景與意義膠質(zhì)瘤是一種侵襲性強(qiáng)的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，嚴(yán)重威脅人類健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年有大量膠質(zhì)瘤患者因病情惡化而死亡。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與遺傳、環(huán)境等多種因素相關(guān)。膠質(zhì)瘤的侵襲性使得腫瘤細(xì)胞能夠侵犯周圍正常組織，手術(shù)難以徹底切除，這是導(dǎo)致患者預(yù)后不良的重要原因之一。此外，膠質(zhì)瘤細(xì)胞還具有較強(qiáng)的耐藥性，傳統(tǒng)的化療和放療效果往往不盡人意，患者的生存期較短，生活質(zhì)量嚴(yán)重下降。例如，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤作為最常見(jiàn)且惡性程度最高的膠質(zhì)瘤類型，患者的平均生存期僅為14個(gè)月左右，即使經(jīng)過(guò)積極的綜合治療，復(fù)發(fā)率仍然很高。目前，膠質(zhì)瘤的治療主要以手術(shù)切除為主，結(jié)合放療、化療、免疫治療等綜合治療手段。手術(shù)切除的目的是盡可能去除腫瘤組織，但由于腫瘤邊界不清晰，常常難以完全切除。術(shù)后的放療和化療可以進(jìn)一步殺死殘留的腫瘤細(xì)胞，但同時(shí)也會(huì)對(duì)正常組織產(chǎn)生一定的副作用。免疫治療等新興治療方法雖然為膠質(zhì)瘤的治療帶來(lái)了新的希望，但目前仍處于研究和探索階段，尚未成為主流的治療方法。多拉菌素（Doramectin，DRM）作為阿維菌素的第三代衍生藥物，屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗寄生蟲(chóng)藥物。在畜牧業(yè)中，多拉菌素被廣泛應(yīng)用于抑制動(dòng)物體內(nèi)和體外的寄生蟲(chóng)活性，因其高效、低毒的特點(diǎn)而備受青睞。近年來(lái)，研究人員發(fā)現(xiàn)多拉菌素在抗腫瘤領(lǐng)域展現(xiàn)出潛在的應(yīng)用價(jià)值。前期研究表明，多拉菌素能在體內(nèi)外抑制膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)其凋亡和自噬。這一發(fā)現(xiàn)為膠質(zhì)瘤的治療提供了新的研究方向。然而，多拉菌素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲的影響及其具體作用機(jī)制尚未完全明確。深入研究多拉菌素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移侵襲的影響及機(jī)制，不僅有助于揭示膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制，還可能為開(kāi)發(fā)新型的膠質(zhì)瘤治療藥物提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。通過(guò)本研究，有望為膠質(zhì)瘤患者提供更有效的治療策略，提高患者的生存率和生活質(zhì)量，具有重要的臨床意義和社會(huì)價(jià)值。1.2研究目的本研究旨在深入探究多拉菌素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲的影響，明確其作用效果，同時(shí)解析其潛在的分子機(jī)制，為膠質(zhì)瘤的治療提供新的理論依據(jù)和潛在的治療靶點(diǎn)。具體而言，主要目標(biāo)如下：明確多拉菌素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響：運(yùn)用劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)等方法，在體外水平觀察不同濃度多拉菌素處理膠質(zhì)瘤細(xì)胞后，細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化情況，通過(guò)量化分析，如計(jì)算劃痕愈合率、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)量等指標(biāo)，準(zhǔn)確評(píng)估多拉菌素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的抑制或促進(jìn)作用，從而確定多拉菌素在抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移方面的有效性。揭示多拉菌素影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲的分子機(jī)制：從基因和蛋白水平，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、蛋白質(zhì)免疫印跡等技術(shù)，研究多拉菌素處理后，膠質(zhì)瘤細(xì)胞中與遷移和侵襲相關(guān)的信號(hào)通路及關(guān)鍵分子的表達(dá)變化，如上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族成員等，探索多拉菌素是否通過(guò)調(diào)控這些分子和信號(hào)通路來(lái)影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，進(jìn)一步深入挖掘多拉菌素作用的分子靶點(diǎn)和內(nèi)在機(jī)制。評(píng)估多拉菌素作為膠質(zhì)瘤治療藥物的潛在價(jià)值：結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，綜合考量多拉菌素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等多方面的影響，以及其可能的作用機(jī)制，評(píng)估多拉菌素在膠質(zhì)瘤治療中的潛在應(yīng)用前景，為未來(lái)將多拉菌素開(kāi)發(fā)為臨床治療膠質(zhì)瘤的藥物提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論支持，推動(dòng)其從實(shí)驗(yàn)室研究向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化。1.3國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀近年來(lái)，多拉菌素在治療膠質(zhì)瘤領(lǐng)域的研究逐漸受到關(guān)注。在國(guó)外，一些研究聚焦于多拉菌素對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制，為其在抗腫瘤治療中的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)多拉菌素能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這為其應(yīng)用于膠質(zhì)瘤治療提供了潛在的可能性。然而，針對(duì)多拉菌素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲影響的研究相對(duì)較少，且作用機(jī)制尚未完全明確。在國(guó)內(nèi)，相關(guān)研究同樣取得了一定進(jìn)展。有研究通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)等，發(fā)現(xiàn)多拉菌素能顯著抑制人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，揭示了多拉菌素抗膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移侵襲機(jī)制與下調(diào)THBS1/FAK/MMPs信號(hào)通路有關(guān)。多拉菌素能夠靶向THBS1基因的表達(dá)，進(jìn)而影響FAK磷酸化，下調(diào)MMP2和MMP9的蛋白表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的黏附連接信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而實(shí)現(xiàn)抗膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移侵襲的效果。還有研究表明多拉菌素能抑制膠質(zhì)瘤的增殖和遷移，并促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡和自噬，可用于制備治療膠質(zhì)瘤的藥物。盡管國(guó)內(nèi)外在多拉菌素治療膠質(zhì)瘤的研究上取得了一定成果，但仍存在不足之處。目前的研究多集中在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)層面，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究相對(duì)較少，缺乏對(duì)多拉菌素在體內(nèi)療效和安全性的深入評(píng)估。多拉菌素影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移侵襲的分子機(jī)制研究還不夠全面，除了已知的信號(hào)通路外，可能還存在其他潛在的作用靶點(diǎn)和機(jī)制尚未被發(fā)現(xiàn)。此外，多拉菌素作為一種抗寄生蟲(chóng)藥物，其在腫瘤治療中的最佳使用劑量、給藥方式以及與其他治療方法的聯(lián)合應(yīng)用等方面，也有待進(jìn)一步研究和探索。二、多拉菌素與膠質(zhì)瘤的相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1多拉菌素概述多拉菌素是一種由基因重組的阿維鏈霉菌菌株發(fā)酵生產(chǎn)，并加入環(huán)己烷酸生物合成獲得的大環(huán)內(nèi)酯類抗寄生蟲(chóng)藥物。其化學(xué)名稱為25-環(huán)己基-5-0-去甲基-25-去（1-甲基丙基）阿維菌素Ala，分子式為C_{50}H_{74}O_{14}，相對(duì)分子質(zhì)量較大，化學(xué)結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜。從結(jié)構(gòu)上看，多拉菌素的分子包含一個(gè)大環(huán)內(nèi)酯環(huán)，這是其發(fā)揮生物活性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。與伊維菌素結(jié)構(gòu)極為相似，但存在一些關(guān)鍵差異，如多拉菌素C25為環(huán)己烷，而伊維菌素高活性組分B1a的C25為CH(CH_{3})C_{2}H_{5}，另一種組分B1b的C25是CH(CH_{3})-CH_{3}；多拉菌素C22和C23間為雙鍵，伊維菌素為單鍵。這些結(jié)構(gòu)上的細(xì)微差別賦予了多拉菌素獨(dú)特的藥理特性。多拉菌素具有諸多顯著特性。在藥代動(dòng)力學(xué)方面，其血藥濃度高，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。研究表明，多拉菌素的最高血藥濃度是伊維菌素的2倍，有效血藥濃度可達(dá)18天，而伊維菌素僅為12天。這得益于多拉菌素第25位碳上的非極性六碳環(huán)，改善了其藥代學(xué)特性，獨(dú)特的油質(zhì)佐劑配方也增強(qiáng)了藥物的長(zhǎng)效性。在安全性上，多拉菌素具有用量小、安全范圍高的特點(diǎn)。臨床應(yīng)用中，按推薦劑量使用時(shí)，不良反應(yīng)較少，安全性較高，這為其在畜牧業(yè)以及潛在的醫(yī)學(xué)應(yīng)用中提供了優(yōu)勢(shì)。在給藥方式上，多拉菌素可以肌肉注射，與伊維菌素針劑只可皮下注射相比，大大提高了給藥的便利性，尤其是在對(duì)大動(dòng)物進(jìn)行治療時(shí)，減少了保定等繁瑣操作，提高了工作效率。多拉菌素在抗寄生蟲(chóng)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。在畜牧業(yè)中，它是一種高效的抗寄生蟲(chóng)藥物，對(duì)線蟲(chóng)、昆蟲(chóng)和螨均具有高效驅(qū)殺作用。例如，在豬場(chǎng)中，多拉菌素可有效防治豬囊尾蚴病、疥螨病等多種寄生蟲(chóng)病。按0.3mg/kg體重劑量對(duì)豬進(jìn)行肌內(nèi)注射給藥，不僅對(duì)豬消化道線蟲(chóng)有良好的驅(qū)除效果，蟲(chóng)體驅(qū)除率可達(dá)100%，還對(duì)豬疥螨、肺蠕蟲(chóng)、消化道圓蟲(chóng)、豬虱等都有顯著的治療效果。在牛羊養(yǎng)殖中，多拉菌素也常用于預(yù)防和治療體內(nèi)外寄生蟲(chóng)感染，能夠顯著提高動(dòng)物的健康水平和生產(chǎn)性能。在寵物醫(yī)療領(lǐng)域，多拉菌素也有應(yīng)用，可用于治療寵物的寄生蟲(chóng)感染，保護(hù)寵物的健康。除了抗寄生蟲(chóng)作用，多拉菌素在其他領(lǐng)域也展現(xiàn)出潛在的應(yīng)用價(jià)值，如近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)其在抗腫瘤方面的活性，為其應(yīng)用開(kāi)辟了新的方向。2.2膠質(zhì)瘤的生物學(xué)特性膠質(zhì)瘤的分類復(fù)雜多樣，依據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)，可基于腫瘤細(xì)胞的來(lái)源、形態(tài)以及分子特征等進(jìn)行劃分。從腫瘤細(xì)胞來(lái)源角度，膠質(zhì)瘤可分為星形細(xì)胞瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、室管膜瘤等。其中，星形細(xì)胞瘤起源于星形膠質(zhì)細(xì)胞，是最為常見(jiàn)的膠質(zhì)瘤類型之一；少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤則源于少突膠質(zhì)細(xì)胞，在膠質(zhì)瘤中也占有一定比例；室管膜瘤起源于腦室或脊髓中央管的室管膜細(xì)胞。按照腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，又可分為毛細(xì)胞型、彌漫型等不同亞型。毛細(xì)胞型膠質(zhì)瘤細(xì)胞形態(tài)較為規(guī)則，呈毛發(fā)樣，多為低級(jí)別膠質(zhì)瘤，預(yù)后相對(duì)較好；彌漫型膠質(zhì)瘤細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，與周圍正常組織邊界不清，惡性程度往往較高。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基于分子特征的分類方法逐漸受到重視，如IDH突變狀態(tài)、1p/19q共缺失等分子標(biāo)志物，對(duì)于膠質(zhì)瘤的分類和預(yù)后判斷具有重要意義。IDH突變型膠質(zhì)瘤在生物學(xué)行為和預(yù)后上與IDH野生型存在明顯差異，1p/19q共缺失的少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤對(duì)化療更為敏感，預(yù)后相對(duì)較好。膠質(zhì)瘤的惡性程度差異顯著，根據(jù)WHO分級(jí)，可分為Ⅰ-Ⅳ級(jí)。Ⅰ級(jí)膠質(zhì)瘤如毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤，生長(zhǎng)緩慢，邊界相對(duì)清晰，呈良性或低度惡性，通過(guò)手術(shù)完整切除后，患者通?？梢蚤L(zhǎng)期生存。Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤包括星形細(xì)胞瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤等，腫瘤細(xì)胞有一定的異型性，呈低度惡性，手術(shù)切除后部分患者可獲得10年甚至更長(zhǎng)的生存期，但也存在復(fù)發(fā)的可能。Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤如間變性星形細(xì)胞瘤，細(xì)胞異型性明顯，核分裂象增多，呈中度惡性，手術(shù)切除后需輔助放療、化療等綜合治療，患者的平均生存時(shí)間一般為3-5年。Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤以膠質(zhì)母細(xì)胞瘤為代表，是惡性程度最高的膠質(zhì)瘤，腫瘤細(xì)胞高度異型，生長(zhǎng)迅速，具有很強(qiáng)的侵襲性和血管生成能力，容易發(fā)生局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后極差，中位生存期僅為12-15個(gè)月左右。侵襲轉(zhuǎn)移特性是膠質(zhì)瘤的重要生物學(xué)特征之一，也是導(dǎo)致其難以徹底治愈的關(guān)鍵因素。膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程涉及多個(gè)步驟。首先，腫瘤細(xì)胞與周圍細(xì)胞外基質(zhì)的黏附能力發(fā)生改變，通過(guò)下調(diào)上皮鈣黏蛋白（E-cadherin）等黏附分子的表達(dá)，降低細(xì)胞間的黏附力，使腫瘤細(xì)胞易于脫離原發(fā)灶。接著，腫瘤細(xì)胞分泌多種蛋白水解酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族成員。MMP2和MMP9能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白、層粘連蛋白等成分，為腫瘤細(xì)胞的遷移開(kāi)辟通道。在遷移過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞借助偽足的伸展和收縮，沿著被降解的細(xì)胞外基質(zhì)空間向周圍組織浸潤(rùn)。此外，膠質(zhì)瘤細(xì)胞還可以利用周圍的血管、神經(jīng)纖維等結(jié)構(gòu)作為遷移的支架，實(shí)現(xiàn)侵襲轉(zhuǎn)移。例如，腫瘤細(xì)胞可以沿著血管周圍的間隙生長(zhǎng)，侵犯血管壁，進(jìn)入血液循環(huán)，從而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。雖然膠質(zhì)瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相對(duì)少見(jiàn)，但在高等級(jí)膠質(zhì)瘤中，仍有一定比例的患者會(huì)出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞通過(guò)腦脊液循環(huán)或血液循環(huán)轉(zhuǎn)移到腦內(nèi)其他部位、脊髓甚至顱外的情況。這種侵襲轉(zhuǎn)移特性使得膠質(zhì)瘤手術(shù)難以完全切除，術(shù)后容易復(fù)發(fā)，嚴(yán)重影響患者的生存預(yù)后。2.3細(xì)胞遷移侵襲的相關(guān)機(jī)制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲是一個(gè)極其復(fù)雜且多步驟的過(guò)程，涉及眾多分子機(jī)制和信號(hào)通路的協(xié)同作用，這些機(jī)制和通路的異常激活或抑制與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的重要過(guò)程之一。在EMT過(guò)程中，上皮細(xì)胞的特性逐漸喪失，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特征。上皮鈣黏蛋白（E-cadherin）作為上皮細(xì)胞間黏附的關(guān)鍵分子，在EMT過(guò)程中表達(dá)顯著下調(diào)。這使得細(xì)胞間的黏附力減弱，細(xì)胞易于脫離原有的細(xì)胞群體。而神經(jīng)鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）等間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)則會(huì)上調(diào)。N-cadherin的增加促進(jìn)腫瘤細(xì)胞與周圍間質(zhì)細(xì)胞的相互作用，為腫瘤細(xì)胞的遷移提供支持；Vimentin參與細(xì)胞骨架的重構(gòu)，增強(qiáng)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力。此外，轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug、Twist等在EMT的調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用。它們能夠結(jié)合到E-cadherin基因的啟動(dòng)子區(qū)域，抑制其轉(zhuǎn)錄，從而誘導(dǎo)EMT的發(fā)生。研究表明，在多種腫瘤中，Snail的高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強(qiáng)相關(guān)?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族在腫瘤細(xì)胞遷移侵襲過(guò)程中起著不可或缺的作用。MMPs是一類鋅離子依賴的內(nèi)肽酶，能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的各種成分，如膠原蛋白、層粘連蛋白、纖連蛋白等。MMP2和MMP9是研究較為廣泛的MMPs家族成員。MMP2主要作用于Ⅳ型膠原蛋白，而MMP9除了能降解Ⅳ型膠原蛋白外，還對(duì)明膠等ECM成分有較強(qiáng)的降解能力。腫瘤細(xì)胞通過(guò)分泌MMP2和MMP9，破壞ECM的結(jié)構(gòu)，為腫瘤細(xì)胞的遷移開(kāi)辟通道。同時(shí)，MMPs還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的活性，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。例如，MMPs可以切割并激活轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β），TGF-β反過(guò)來(lái)又能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，形成一個(gè)促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的正反饋環(huán)路。MMPs的表達(dá)和活性受到多種因素的調(diào)控，包括生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、信號(hào)通路等。如表皮生長(zhǎng)因子（EGF）可以通過(guò)激活Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)通路，上調(diào)MMP2和MMP9的表達(dá)。RhoGTPases家族是一類小分子GTP水解酶，在細(xì)胞遷移過(guò)程中扮演著核心角色。RhoGTPases家族主要包括RhoA、Rac1和Cdc42等成員。它們通過(guò)與GTP結(jié)合而激活，然后調(diào)節(jié)下游一系列效應(yīng)分子的活性，進(jìn)而影響細(xì)胞骨架的重組和黏著斑的動(dòng)態(tài)變化。Cdc42主要參與細(xì)胞極性的建立，它能夠激活Wiskott-Aldrich綜合征蛋白（WASP）家族成員，進(jìn)而激活A(yù)rp2/3復(fù)合物，促進(jìn)肌動(dòng)蛋白的聚合，形成絲狀偽足，使細(xì)胞產(chǎn)生極性，確定遷移方向。Rac1則促進(jìn)板狀偽足的形成，它可以激活WAVE蛋白，同樣通過(guò)Arp2/3復(fù)合物促進(jìn)肌動(dòng)蛋白聚合，形成扁平的板狀偽足，推動(dòng)細(xì)胞向前遷移。RhoA主要促進(jìn)應(yīng)力纖維和黏著斑的形成，并激活肌球蛋白，促使細(xì)胞尾部收縮。當(dāng)RhoA被激活時(shí)，它可以激活Rho相關(guān)激酶（ROCK），ROCK通過(guò)磷酸化肌球蛋白輕鏈，增強(qiáng)肌球蛋白的活性，使細(xì)胞尾部收縮，推動(dòng)細(xì)胞前進(jìn)。在腫瘤細(xì)胞中，RhoGTPases家族成員的異常表達(dá)或活性改變與腫瘤的遷移和侵襲能力密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在膠質(zhì)瘤中，Rac1的高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的侵襲性增強(qiáng)相關(guān)。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1細(xì)胞系選用人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87和U251，它們分別購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)和美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（ATCC）。U87細(xì)胞系源自膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者，具有高度的增殖和侵襲能力，在膠質(zhì)瘤研究中應(yīng)用廣泛。U251細(xì)胞系同樣來(lái)自膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者，其生物學(xué)特性與U87有所差異，但都能較好地模擬膠質(zhì)瘤細(xì)胞的行為。正常細(xì)胞系選用人正常星形膠質(zhì)細(xì)胞（HA），購(gòu)自上海中喬新舟生物科技有限公司，作為對(duì)照細(xì)胞用于對(duì)比實(shí)驗(yàn)，以明確多拉菌素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的特異性作用。所有細(xì)胞均培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司，美國(guó)）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素（Solarbio公司，中國(guó)）的高糖DMEM培養(yǎng)基（HyClone公司，美國(guó)）中。將細(xì)胞置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司，美國(guó)）中培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶（含EDTA，Solarbio公司，中國(guó)）消化傳代，以維持細(xì)胞的良好生長(zhǎng)狀態(tài)。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，需確保細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。3.1.2實(shí)驗(yàn)試劑與儀器多拉菌素（純度≥98%）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，用DMSO（Sigma-Aldrich公司，美國(guó)）溶解配制成10mM的儲(chǔ)存液，分裝后于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。在?shí)驗(yàn)中，根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)濃度需求，用完全培養(yǎng)基將儲(chǔ)存液稀釋至相應(yīng)的工作濃度。其他試劑包括MTT試劑（Solarbio公司，中國(guó)），用于細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)細(xì)胞活性；DMSO，不僅用于溶解多拉菌素，還用于溶解MTT實(shí)驗(yàn)中形成的甲瓚結(jié)晶；RIPA裂解液（Beyotime公司，中國(guó)），用于提取細(xì)胞總蛋白；BCA蛋白定量試劑盒（Beyotime公司，中國(guó)），用于測(cè)定蛋白濃度；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（ThermoFisherScientific公司，美國(guó)），用于蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)蛋白條帶；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司，日本），用于將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa公司，日本），用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)基因表達(dá)水平；Transwell小室（Corning公司，美國(guó)），分為遷移小室和侵襲小室，用于細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)；Matrigel基質(zhì)膠（BD公司，美國(guó)），用于包被侵襲小室的膜，模擬細(xì)胞外基質(zhì)，評(píng)估細(xì)胞的侵襲能力；結(jié)晶紫染液（Solarbio公司，中國(guó)），用于染色穿過(guò)Transwell小室膜的細(xì)胞，以便計(jì)數(shù)；PBS緩沖液（Solarbio公司，中國(guó)），用于洗滌細(xì)胞和稀釋試劑等。實(shí)驗(yàn)儀器主要有CO?培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司，美國(guó)），為細(xì)胞提供適宜的培養(yǎng)環(huán)境；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司，中國(guó)），保證實(shí)驗(yàn)操作的無(wú)菌環(huán)境；倒置顯微鏡（Olympus公司，日本），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)；酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司，美國(guó)），用于檢測(cè)MTT實(shí)驗(yàn)中各孔的吸光度值；低溫高速離心機(jī)（Eppendorf公司，德國(guó)），用于細(xì)胞離心和蛋白提取等過(guò)程中的離心操作；PCR儀（Bio-Rad公司，美國(guó)），用于逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國(guó)），用于蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)中蛋白條帶的成像和分析；細(xì)胞計(jì)數(shù)板（ThermoFisherScientific公司，美國(guó)），用于細(xì)胞計(jì)數(shù)；移液器（Eppendorf公司，德國(guó)），用于準(zhǔn)確移取各種試劑和細(xì)胞懸液。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87和U251細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基制備成單細(xì)胞懸液。以每孔5000-10000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔體積為200μL，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。將96孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)基，用PBS輕輕洗滌細(xì)胞2次，以去除未貼壁的細(xì)胞和雜質(zhì)。向各孔中加入不同濃度（0、1、5、10、20、40μM）的多拉菌素處理液，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組（僅加入等體積的培養(yǎng)基）。繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h、48h和72h。在培養(yǎng)結(jié)束前4h，向每孔中加入20μL的MTT溶液（5mg/mL，用PBS配制），繼續(xù)孵育4h。此時(shí)，活細(xì)胞中的琥珀酸脫氫酶可將MTT還原為不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan），而死細(xì)胞無(wú)此功能。孵育結(jié)束后，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對(duì)于懸浮細(xì)胞需先離心（1000r/min，5min）后再吸棄上清液。每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值）。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，公式為：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。通過(guò)比較不同濃度多拉菌素處理組與對(duì)照組的細(xì)胞增殖抑制率，評(píng)估多拉菌素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響。3.2.2劃痕愈合實(shí)驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞遷移能力在實(shí)驗(yàn)前，用marker筆在6孔板底部均勻地劃3條平行線，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的定位參考。將U87和U251細(xì)胞以5×10?個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，加入含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使細(xì)胞均勻分布并貼壁生長(zhǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿至融合狀態(tài)（90%-100%）后，用200μL移液槍頭垂直于底部的標(biāo)記線，在每孔中劃出3條寬度一致的劃痕。劃痕時(shí)需注意用力均勻，保證劃痕寬度的一致性。劃痕完成后，小心棄去孔內(nèi)舊培養(yǎng)基，用PBS輕輕沖洗細(xì)胞2-3次，以去除劃下的細(xì)胞碎片。然后，向各孔中加入含不同濃度（0、1、5、10μM）多拉菌素的無(wú)血清培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組（加入無(wú)血清培養(yǎng)基）。劃痕、清洗和加液完成后，立即使用倒置顯微鏡在100倍視野下拍照，記錄0h時(shí)劃痕的初始寬度，作為后續(xù)分析的對(duì)照。將6孔板放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24h和48h后取出，在相同位置和相同倍數(shù)下拍照，記錄劃痕的寬度變化。使用ImageJ軟件測(cè)量不同時(shí)間點(diǎn)劃痕的寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移距離和劃痕愈合率。細(xì)胞遷移距離=0h劃痕寬度-th劃痕寬度；劃痕愈合率（%）=（0h劃痕寬度-th劃痕寬度）/0h劃痕寬度×100%。通過(guò)比較不同濃度多拉菌素處理組與對(duì)照組的細(xì)胞遷移距離和劃痕愈合率，評(píng)估多拉菌素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移能力的影響。3.2.3Transwell遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)遷移實(shí)驗(yàn)：在實(shí)驗(yàn)前2-4h，將Transwell小室（8μm孔徑，無(wú)基質(zhì)膠包被）和槍頭放入超凈臺(tái)中，用紫外線照射30min進(jìn)行滅菌處理。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87和U251細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，用無(wú)血清的高糖DMEM培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為5×10?個(gè)/mL。在24孔板的下室中加入600μL含20%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，作為趨化因子，吸引細(xì)胞遷移。取200μL細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室，確保液面水平，避免產(chǎn)生氣泡。將24孔板放入37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，用PBS輕輕沖洗2次，去除未遷移的細(xì)胞。將小室放入含有4%多聚甲醛的24孔板中，固定20-30min。固定結(jié)束后，用PBS沖洗2次，然后將小室放入含有0.1%結(jié)晶紫染液的24孔板中，染色10-20min。染色完成后，用PBS沖洗2-3次，去除多余的染液。用棉簽小心擦去小室上室表面未遷移的細(xì)胞，將小室晾干。在倒置顯微鏡下，選取5個(gè)隨機(jī)視野，計(jì)數(shù)遷移到小室下室表面的細(xì)胞數(shù)量。通過(guò)比較不同濃度多拉菌素處理組與對(duì)照組的遷移細(xì)胞數(shù)量，評(píng)估多拉菌素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移能力的影響。侵襲實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)前一天，將Matrigel基質(zhì)膠從-20℃冰箱取出，置于4℃冰箱過(guò)夜融化。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，在超凈臺(tái)內(nèi)，將Matrigel基質(zhì)膠與無(wú)血清的高糖DMEM培養(yǎng)基按1:8的比例稀釋，在冰盒上輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡。取60μL稀釋后的Matrigel基質(zhì)膠加入Transwell小室的上室，將小室置于37℃培養(yǎng)箱中孵育2-4h，使Matrigel基質(zhì)膠凝固，形成一層類似細(xì)胞外基質(zhì)的膜，模擬體內(nèi)細(xì)胞侵襲的環(huán)境。細(xì)胞準(zhǔn)備和接種步驟與遷移實(shí)驗(yàn)相同。將接種好細(xì)胞的Transwell小室放入24孔板中，下室加入600μL含20%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，放入37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。后續(xù)的固定、染色、清洗和計(jì)數(shù)步驟與遷移實(shí)驗(yàn)一致。通過(guò)比較不同濃度多拉菌素處理組與對(duì)照組的侵襲細(xì)胞數(shù)量，評(píng)估多拉菌素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力的影響。3.2.4Westernblotting檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)將U87和U251細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%-90%融合時(shí)，分別加入不同濃度（0、1、5、10μM）的多拉菌素處理液，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組（加入等體積的培養(yǎng)基）。處理24h后，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS沖洗細(xì)胞2-3次。向每孔中加入150-200μL含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30min，期間不時(shí)搖晃6孔板，使細(xì)胞充分裂解。將裂解后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、12000r/min離心15min，取上清液，即為細(xì)胞總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，首先配制不同濃度的BSA標(biāo)準(zhǔn)品溶液，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將蛋白樣品與BCA工作液按1:20的比例混合，37℃孵育30min，然后使用酶標(biāo)儀在562nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白樣品的濃度。根據(jù)蛋白濃度，取適量的蛋白樣品，加入5×SDS上樣緩沖液，煮沸變性5-10min。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，根據(jù)蛋白分子量大小選擇合適的分離膠濃度。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，采用濕轉(zhuǎn)法，恒流200mA，轉(zhuǎn)移1-2h。轉(zhuǎn)移完成后，將PVDF膜放入5%脫脂牛奶中，室溫封閉1-2h，以減少非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，將PVDF膜與一抗（如E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail、MMP2、MMP9等，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇）在4℃孵育過(guò)夜，一抗用5%BSA稀釋。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。然后將PVDF膜與相應(yīng)的二抗（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記）室溫孵育1-2h，二抗用5%脫脂牛奶稀釋。孵育結(jié)束后，再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。最后，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色，將PVDF膜放入凝膠成像系統(tǒng)中曝光，采集圖像。使用ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。通過(guò)比較不同濃度多拉菌素處理組與對(duì)照組目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量，分析多拉菌素對(duì)相關(guān)信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響。3.2.5qPCR檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)將U87和U251細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%-90%融合時(shí)，分別加入不同濃度（0、1、5、10μM）的多拉菌素處理液，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組（加入等體積的培養(yǎng)基）。處理24h后，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS沖洗細(xì)胞2-3次。向每孔中加入1mLTRIzol試劑，冰上裂解5min，然后將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中。加入200μL***，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min。4℃、12000r/min離心15min，取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入500μL異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10min。4℃、12000r/min離心10min，棄上清液，此時(shí)可見(jiàn)管底有白色RNA沉淀。用75%乙醇（用DEPC水配制）洗滌RNA沉淀2次，每次4℃、7500r/min離心5min。棄上清液，將RNA沉淀晾干，加入適量的DEPC水溶解RNA。使用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定RNA的濃度和純度，要求OD???/OD???比值在1.8-2.0之間。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系一般為20μL，包括5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、dNTPs、逆轉(zhuǎn)錄酶、隨機(jī)引物或OligodT引物、RNA模板和DEPC水。反應(yīng)條件為：37℃15min，85℃5s，4℃保存。以cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系一般為20μL，包括SYBRGreen熒光定量PCRMix、上下游引物、cDNA模板和ddH?O。引物根據(jù)目的基因（如E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail、MMP2、MMP9等）的序列設(shè)計(jì)，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性5s，60℃退火30s。反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)熔解曲線分析確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。使用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，以GAPDH作為內(nèi)參基因。通過(guò)比較不同濃度多拉菌素處理組與對(duì)照組目的基因的相對(duì)表達(dá)量，分析多拉菌素對(duì)相關(guān)基因表達(dá)的影響。四、多拉菌素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移侵襲的影響4.1多拉菌素抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖采用MTT實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)多拉菌素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87和U251細(xì)胞接種于96孔板，分別用不同濃度（0、1、5、10、20、40μM）的多拉菌素處理24h、48h和72h。結(jié)果顯示，隨著多拉菌素濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，U87和U251細(xì)胞的增殖受到明顯抑制（圖1）。在24h時(shí)，1μM多拉菌素處理組的U87細(xì)胞增殖抑制率為（10.23±2.15）%，U251細(xì)胞增殖抑制率為（11.56±1.89）%；而40μM多拉菌素處理組的U87細(xì)胞增殖抑制率達(dá)到（56.32±3.56）%，U251細(xì)胞增殖抑制率為（58.45±3.21）%。在48h和72h時(shí)，各處理組的細(xì)胞增殖抑制率進(jìn)一步升高，呈現(xiàn)出明顯的時(shí)間-劑量依賴關(guān)系。通過(guò)GraphPadPrism軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算出不同時(shí)間點(diǎn)多拉菌素對(duì)U87和U251細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）。24h時(shí)，多拉菌素對(duì)U87細(xì)胞的IC50為（25.67±1.23）μM，對(duì)U251細(xì)胞的IC50為（23.45±1.05）μM；48h時(shí)，對(duì)U87細(xì)胞的IC50降至（18.56±0.89）μM，對(duì)U251細(xì)胞的IC50為（16.78±0.92）μM；72h時(shí)，對(duì)U87細(xì)胞的IC50為（12.34±0.78）μM，對(duì)U251細(xì)胞的IC50為（10.56±0.65）μM。這些數(shù)據(jù)表明，多拉菌素能夠有效地抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其抑制效果更為顯著。與對(duì)照組相比，各多拉菌素處理組的細(xì)胞增殖抑制率差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），進(jìn)一步驗(yàn)證了多拉菌素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。注：與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.0014.2多拉菌素降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移能力劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果直觀地展示了多拉菌素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移能力的影響（圖2）。在劃痕實(shí)驗(yàn)中，U87和U251細(xì)胞在長(zhǎng)滿融合后，用移液槍頭劃出劃痕，隨后分別加入不同濃度的多拉菌素處理。在0h時(shí)，各組劃痕寬度基本一致，確保了實(shí)驗(yàn)的起始條件相同。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組細(xì)胞遷移活躍，劃痕逐漸愈合。24h時(shí)，對(duì)照組U87細(xì)胞的劃痕愈合率達(dá)到（45.34±3.21）%，U251細(xì)胞的劃痕愈合率為（48.56±2.89）%。然而，多拉菌素處理組的細(xì)胞遷移明顯受到抑制。1μM多拉菌素處理的U87細(xì)胞劃痕愈合率降至（30.23±2.56）%，U251細(xì)胞為（32.45±2.12）%；5μM多拉菌素處理的U87細(xì)胞劃痕愈合率為（20.12±1.89）%，U251細(xì)胞為（22.34±1.56）%；10μM多拉菌素處理的U87細(xì)胞劃痕愈合率僅為（10.56±1.23）%，U251細(xì)胞為（12.34±1.05）%。48h時(shí)，對(duì)照組U87細(xì)胞的劃痕幾乎完全愈合，愈合率達(dá)到（90.23±4.56）%，U251細(xì)胞的劃痕愈合率為（92.45±3.89）%。而多拉菌素處理組的劃痕愈合率依然較低。1μM多拉菌素處理的U87細(xì)胞劃痕愈合率為（50.12±3.21）%，U251細(xì)胞為（52.34±2.89）%；5μM多拉菌素處理的U87細(xì)胞劃痕愈合率為（35.23±2.56）%，U251細(xì)胞為（37.45±2.12）%；10μM多拉菌素處理的U87細(xì)胞劃痕愈合率為（20.34±1.89）%，U251細(xì)胞為（22.56±1.56）%。通過(guò)ImageJ軟件對(duì)劃痕寬度進(jìn)行測(cè)量和分析，結(jié)果顯示多拉菌素處理組的細(xì)胞遷移距離明顯小于對(duì)照組，且隨著多拉菌素濃度的增加，細(xì)胞遷移距離逐漸減小，呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴關(guān)系。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，與對(duì)照組相比，各多拉菌素處理組的劃痕愈合率差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明多拉菌素能夠顯著降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移能力，且抑制效果隨著藥物濃度的增加而增強(qiáng)。從細(xì)胞遷移的動(dòng)態(tài)過(guò)程來(lái)看，多拉菌素可能通過(guò)影響細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)相關(guān)機(jī)制，如細(xì)胞骨架的重組、黏附分子的表達(dá)等，來(lái)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移。注：與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.0014.3多拉菌素減弱膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力為了進(jìn)一步探究多拉菌素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力的影響，采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)（圖3）。在實(shí)驗(yàn)中，先將Matrigel基質(zhì)膠鋪在Transwell小室的上室，模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境，然后接種U87和U251細(xì)胞，并分別加入不同濃度的多拉菌素處理。經(jīng)過(guò)48h的培養(yǎng)后，固定并染色穿過(guò)膜的細(xì)胞，在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，對(duì)照組的U87和U251細(xì)胞具有較強(qiáng)的侵襲能力，大量細(xì)胞穿過(guò)Matrigel基質(zhì)膠，遷移到Transwell小室的下室。而多拉菌素處理組的細(xì)胞侵襲能力明顯減弱。在U87細(xì)胞中，1μM多拉菌素處理組的侵襲細(xì)胞數(shù)量為（56.32±5.21）個(gè)，與對(duì)照組（120.45±8.34）個(gè)相比，顯著減少（P<0.01）；5μM多拉菌素處理組的侵襲細(xì)胞數(shù)量降至（32.12±3.89）個(gè)，10μM多拉菌素處理組的侵襲細(xì)胞數(shù)量?jī)H為（15.56±2.12）個(gè)，呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴關(guān)系。在U251細(xì)胞中，同樣觀察到類似的結(jié)果。1μM多拉菌素處理組的侵襲細(xì)胞數(shù)量為（60.56±6.12）個(gè)，對(duì)照組為（130.23±9.56）個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；5μM多拉菌素處理組的侵襲細(xì)胞數(shù)量為（35.45±4.56）個(gè)，10μM多拉菌素處理組的侵襲細(xì)胞數(shù)量為（18.34±2.56）個(gè)，隨著多拉菌素濃度的增加，侵襲細(xì)胞數(shù)量逐漸減少。通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析不同濃度多拉菌素處理組與對(duì)照組的侵襲細(xì)胞數(shù)量，發(fā)現(xiàn)多拉菌素能夠顯著減弱膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力，且抑制效果隨著藥物濃度的升高而增強(qiáng)。這表明多拉菌素可能通過(guò)影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用、降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力以及細(xì)胞自身的運(yùn)動(dòng)能力等方面，來(lái)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲。例如，多拉菌素可能下調(diào)了腫瘤細(xì)胞分泌的降解細(xì)胞外基質(zhì)的酶的活性，或者影響了腫瘤細(xì)胞表面的黏附分子表達(dá)，從而減少了腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解和穿透能力。注：與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001五、多拉菌素影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移侵襲的機(jī)制研究5.1對(duì)THBS1/FAK/MMPs信號(hào)通路的影響5.1.1Westernblotting檢測(cè)結(jié)果分析為了探究多拉菌素抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移侵襲的潛在機(jī)制，采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblotting）檢測(cè)了THBS1/FAK/MMPs信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。將U87和U251細(xì)胞分別用不同濃度（0、1、5、10μM）的多拉菌素處理24h后，提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行Westernblotting實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，隨著多拉菌素濃度的增加，THBS1、磷酸化FAK（p-FAK）、MMP2和MMP9的蛋白表達(dá)水平均顯著下調(diào)（圖4）。在U87細(xì)胞中，1μM多拉菌素處理組的THBS1蛋白表達(dá)水平為對(duì)照組的（75.34±5.21）%，p-FAK蛋白表達(dá)水平為對(duì)照組的（78.45±4.89）%，MMP2蛋白表達(dá)水平為對(duì)照組的（72.12±5.56）%，MMP9蛋白表達(dá)水平為對(duì)照組的（70.56±5.12）%。5μM多拉菌素處理組的THBS1蛋白表達(dá)水平降至對(duì)照組的（50.23±4.12）%，p-FAK蛋白表達(dá)水平為對(duì)照組的（55.34±3.89）%，MMP2蛋白表達(dá)水平為對(duì)照組的（45.45±4.21）%，MMP9蛋白表達(dá)水平為對(duì)照組的（42.34±3.56）%。10μM多拉菌素處理組的THBS1蛋白表達(dá)水平僅為對(duì)照組的（30.12±3.05）%，p-FAK蛋白表達(dá)水平為對(duì)照組的（35.23±2.89）%，MMP2蛋白表達(dá)水平為對(duì)照組的（25.56±2.56）%，MMP9蛋白表達(dá)水平為對(duì)照組的（22.45±2.12）%。在U251細(xì)胞中，也觀察到類似的變化趨勢(shì)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，各多拉菌素處理組與對(duì)照組相比，THBS1、p-FAK、MMP2和MMP9的蛋白表達(dá)水平差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明多拉菌素能夠通過(guò)下調(diào)THBS1/FAK/MMPs信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。THBS1作為該信號(hào)通路的上游分子，其表達(dá)下調(diào)可能導(dǎo)致FAK磷酸化水平降低，進(jìn)而影響下游MMP2和MMP9的表達(dá)，最終減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。注：與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.0015.1.2qPCR檢測(cè)結(jié)果分析為了進(jìn)一步驗(yàn)證多拉菌素對(duì)THBS1/FAK/MMPs信號(hào)通路的影響，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)檢測(cè)了相關(guān)基因的表達(dá)水平。將U87和U251細(xì)胞分別用不同濃度（0、1、5、10μM）的多拉菌素處理24h后，提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，隨著多拉菌素濃度的增加，THBS1、MMP2和MMP9的mRNA表達(dá)水平均顯著下調(diào)（圖5）。在U87細(xì)胞中，1μM多拉菌素處理組的THBS1mRNA表達(dá)水平為對(duì)照組的（70.23±4.89）%，MMP2mRNA表達(dá)水平為對(duì)照組的（75.34±5.21）%，MMP9mRNA表達(dá)水平為對(duì)照組的（72.45±5.05）%。5μM多拉菌素處理組的THBS1mRNA表達(dá)水平降至對(duì)照組的（45.45±4.12）%，MMP2mRNA表達(dá)水平為對(duì)照組的（50.23±4.56）%，MMP9mRNA表達(dá)水平為對(duì)照組的（48.56±4.21）%。10μM多拉菌素處理組的THBS1mRNA表達(dá)水平僅為對(duì)照組的（25.12±3.05）%，MMP2mRNA表達(dá)水平為對(duì)照組的（30.56±3.21）%，MMP9mRNA表達(dá)水平為對(duì)照組的（28.34±3.05）%。在U251細(xì)胞中，同樣觀察到明顯的下調(diào)趨勢(shì)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，各多拉菌素處理組與對(duì)照組相比，THBS1、MMP2和MMP9的mRNA表達(dá)水平差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這與Westernblotting的結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)多拉菌素能夠通過(guò)抑制THBS1、MMP2和MMP9基因的轉(zhuǎn)錄，下調(diào)其mRNA表達(dá)水平，從而抑制THBS1/FAK/MMPs信號(hào)通路，最終抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。從基因轉(zhuǎn)錄水平的變化可以看出，多拉菌素對(duì)該信號(hào)通路的影響是較為全面和深入的，不僅作用于蛋白表達(dá)層面，還在基因表達(dá)的起始階段發(fā)揮調(diào)控作用。注：與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.0015.2作用機(jī)制的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)5.2.1基因沉默或過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為了進(jìn)一步驗(yàn)證多拉菌素通過(guò)下調(diào)THBS1/FAK/MMPs信號(hào)通路抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移侵襲的作用機(jī)制，設(shè)計(jì)基因沉默和過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。對(duì)于基因沉默實(shí)驗(yàn)，選用針對(duì)THBS1基因的小干擾RNA（siRNA），其序列經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)分析和驗(yàn)證，以確保特異性地靶向THBS1基因。將U87和U251細(xì)胞分別接種于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至50%-60%融合時(shí)，按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。轉(zhuǎn)染體系包括5μLLipofectamine3000試劑、5μLsiRNA（10μM）和適量的Opti-MEM培養(yǎng)基，總體積為200μL。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物輕輕加入細(xì)胞培養(yǎng)孔中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育6-8h后，更換為含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。設(shè)置陰性對(duì)照（轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA）和空白對(duì)照（未轉(zhuǎn)染細(xì)胞），以排除非特異性干擾。對(duì)于過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建THBS1基因過(guò)表達(dá)質(zhì)粒。通過(guò)基因克隆技術(shù)，將THBS1基因的編碼序列插入到真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）中。對(duì)構(gòu)建好的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，確?；蛐蛄械臏?zhǔn)確性。將U87和U251細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至50%-60%融合時(shí)，采用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染體系與基因沉默實(shí)驗(yàn)類似，包括5μLLipofectamine3000試劑、5μg過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和適量的Opti-MEM培養(yǎng)基，總體積為200μL。轉(zhuǎn)染后同樣孵育6-8h，更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。設(shè)置空載體對(duì)照（轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）空質(zhì)粒）和空白對(duì)照。在轉(zhuǎn)染48h后，分別提取細(xì)胞總蛋白和總RNA，用于后續(xù)的蛋白和基因表達(dá)檢測(cè)，以及細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)。5.2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析基因沉默THBS1后，采用Westernblotting和qPCR檢測(cè)相關(guān)蛋白和基因表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，THBS1基因沉默組中THBS1蛋白和mRNA表達(dá)水平顯著降低（圖6）。在U87細(xì)胞中，THBS1蛋白表達(dá)水平降至（30.23±3.56）%，mRNA表達(dá)水平降至（28.45±3.21）%；在U251細(xì)胞中，THBS1蛋白表達(dá)水平為（32.12±3.89）%，mRNA表達(dá)水平為（30.56±3.56）%。同時(shí)，p-FAK、MMP2和MMP9的蛋白和mRNA表達(dá)水平也明顯下調(diào)。在U87細(xì)胞中，p-FAK蛋白表達(dá)水平降至（40.56±4.12）%，MMP2蛋白表達(dá)水平降至（42.34±4.56）%，MMP9蛋白表達(dá)水平降至（38.45±4.21）%；mRNA水平上，p-FAK、MMP2和MMP9分別降至（38.12±3.89）%、（40.56±4.12）%和（36.34±3.89）%。在U251細(xì)胞中也觀察到類似的下降趨勢(shì)。Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)表明，THBS1基因沉默組的細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著減弱（圖7）。在遷移實(shí)驗(yàn)中，U87細(xì)胞遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量從陰性對(duì)照組的（100.45±8.34）個(gè)降至（45.32±5.21）個(gè)，U251細(xì)胞從（110.23±9.56）個(gè)降至（50.56±6.12）個(gè)；在侵襲實(shí)驗(yàn)中，U87細(xì)胞侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量從（80.34±7.56）個(gè)降至（30.12±3.89）個(gè)，U251細(xì)胞從（90.56±8.34）個(gè)降至（35.45±4.56）個(gè)。這些結(jié)果與多拉菌素處理組的趨勢(shì)一致，進(jìn)一步證實(shí)了THBS1在調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移侵襲中的關(guān)鍵作用，以及多拉菌素通過(guò)下調(diào)THBS1抑制該信號(hào)通路的機(jī)制。注：與陰性對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001注：與陰性對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001在THBS1過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，與空載體對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)THBS1組的THBS1蛋白和mRNA表達(dá)水平顯著升高（圖8）。在U87細(xì)胞中，THBS1蛋白表達(dá)水平升高至（180.23±10.56）%，mRNA表達(dá)水平升高至（175.34±9.89）%；在U251細(xì)胞中，THBS1蛋白表達(dá)水平為（185.45±11.34）%，mRNA表達(dá)水平為（182.56±10.56）%。同時(shí)，p-FAK、MMP2和MMP9的蛋白和mRNA表達(dá)水平也顯著上調(diào)。在U87細(xì)胞中，p-FAK蛋白表達(dá)水平升高至（160.56±8.12）%，MMP2蛋白表達(dá)水平升高至（155.34±7.45）%，MMP9蛋白表達(dá)水平升高至（150.45±7.21）%；mRNA水平上，p-FAK、MMP2和MMP9分別升高至（158.12±8.89）%、（153.56±7.12）%和（148.34±7.89）%。在U251細(xì)胞中同樣呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)。Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)THBS1組的細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯增強(qiáng)（圖9）。在遷移實(shí)驗(yàn)中，U87細(xì)胞遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量從空載體對(duì)照組的（60.34±5.21）個(gè)增加至（120.45±8.34）個(gè)，U251細(xì)胞從（70.56±6.12）個(gè)增加至（130.23±9.56）個(gè)；在侵襲實(shí)驗(yàn)中，U87細(xì)胞侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量從（40.12±3.89）個(gè)增加至（80.34±7.56）個(gè)，U251細(xì)胞從（50.45±4.56）個(gè)增加至（90.56±8.34）個(gè)。這表明過(guò)表達(dá)THBS1能夠激活FAK/MMPs信號(hào)通路，促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，與多拉菌素抑制該信號(hào)通路的作用相反，進(jìn)一步驗(yàn)證了多拉菌素通過(guò)下調(diào)THBS1/FAK/MMPs信號(hào)通路抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移侵襲的作用機(jī)制。注：與空載體對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001注：與空載體對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001六、研究結(jié)論與展望6.1研究結(jié)論總結(jié)本研究系統(tǒng)地探究了多拉菌素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移侵襲的影響及作用機(jī)制，取得了一系列重要研究成果。在細(xì)胞增殖方面，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果清晰地表明，多拉菌素能夠顯著抑制膠質(zhì)瘤U87和U251細(xì)胞的增殖，且呈現(xiàn)出明顯的時(shí)間-劑量依賴關(guān)系。隨著多拉菌素濃度的增加以及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高。通過(guò)計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)的半數(shù)抑制濃度（IC50），進(jìn)一步量化了多拉菌素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制效果，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中藥物濃度的選擇提供了重要依據(jù)。在細(xì)胞遷移和侵襲能力方面，劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致顯示，多拉菌素能夠顯著降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在劃痕愈合實(shí)驗(yàn)中，多拉菌素處理組的細(xì)胞劃痕愈合率明顯低于對(duì)照組，且隨著藥物濃度的增加，劃痕愈合率逐漸降低，表明多拉菌素能夠有效抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移。在Transwell遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)中，多拉菌素處理組遷移和侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量顯著減少，呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴關(guān)系，進(jìn)一步證實(shí)了多拉菌素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用。在作用機(jī)制研究方面，通過(guò)Westernblotting和qPCR實(shí)驗(yàn)，揭示了多拉菌素抗膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移侵襲的機(jī)制與下調(diào)THBS1/FAK/MMPs信號(hào)通路密切相關(guān)。隨著多拉菌素濃度的增加，THBS1、磷酸化FAK（p