實時熒光定量PCR技術(shù)的腫瘤分子病理檢測臨床實踐專家共識2026惡性腫瘤分子病理檢測是個體化治療的前提子病理檢測平臺包括實時熒光定量PCR(quantitativereal-timePCR,qPCR)、熒光原位雜交、Sanger測序和高通量測序等，其中qPCR技術(shù)多重連接依賴性探針擴增PCR技術(shù)和數(shù)字PCR技術(shù)等，能夠?qū)螯c突qPCR技術(shù)近年來在腫瘤分子病理檢測領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，檢測標準化和規(guī)范化對提升腫瘤分子病理檢測水平和促進共識由具有豐富理論和檢測實踐經(jīng)驗的病理、分定，旨在為qPCR技術(shù)檢測實踐提供指導和幫助。本共識包括qPCR技術(shù)的樣本選擇、前處理、檢測流程、性能測條件充分的環(huán)境下優(yōu)先推薦開展的措施)、成基本一致共識，基于特定實際檢測條件推目前腫瘤分子病理檢測常用樣本主要包括福爾馬林固定石蠟包埋組織檢組織樣本)、細胞學樣本和體液樣本(包括外上清液、唾液和尿液等),應(yīng)依據(jù)臨床需求、樣本可及性及qPCR檢測平本不可及時，推薦采用細胞學樣本進行檢測及，推薦外周血等體液樣本進行循環(huán)腫瘤DNA(circulatingtumorDNA,(standardoperatingprocedure,SOP),詳盡規(guī)范樣本采集、運輸、接1.組織學樣本：標本離體后應(yīng)在30min內(nèi)浸泡于10~15倍體積的4%中性甲醛(10%福爾馬林)固定液中，大樣本應(yīng)注意逐層切開以充分固定，根據(jù)樣本大小和組織類型適當調(diào)整固定時間，一般不超過72h。樣本浸蠟和包埋溫度一般在58~60℃,不宜過高。薦將細胞學樣本制備成細胞蠟塊，使用4%中性甲醛(10%中性福爾馬林)固定液或者95%乙醇固定，后續(xù)操作可參照組織樣本處理要求及病理質(zhì)控。對于質(zhì)控合格的細胞學樣本，收集細胞沉渣，直接裂解提取核酸。此外，3.體液樣本：外周血是分子檢測最常用的體液樣本，主要通過分離血漿存情況及細胞成分進行評估。對于體液樣本，應(yīng)1.組織或細胞學樣本：推薦使用2年以內(nèi)的FFPE樣本，病理醫(yī)師須對腫瘤細胞含量進行評估，推薦采用腫瘤細胞不少于200個，且占比不少于20%的蠟塊，避免使用強酸脫鈣處理后的樣本，避免選取存在組織自溶、退變、大片出血、明顯壞死或結(jié)構(gòu)不清等情況的蠟塊。在應(yīng)用qPCR檢測和細胞學樣本的腫瘤細胞含量常低于試劑盒2.體液樣本：推薦治療間期采集，如在化療、放療或手術(shù)治療1~2周后采集。盡量避免在患者伴隨其他疾病如嚴重感染等耗材，防止不同樣本間交叉污染。對于腫瘤細胞占比<20%的樣本，推薦對腫瘤細胞進行富集。石蠟切片和蠟卷可存時間不超過2周。體液樣本(胸腹水、心包積液和腦脊液等)需要盡快處理，若不能及時處理建議2~8℃下保存不超過24h。外周血樣本若選用專用采血管可常溫運輸保存，時間不超過7d,若選用EDTA抗凝管采血，推薦采血后2h內(nèi)完成血漿分離。分離后的血漿，可暫存于-20℃(不超過1周)或-80℃(可保存1個月以上),建議1周內(nèi)完成后繼檢測。推薦剩余生物樣本和核酸等進行分類保存，以備后續(xù)檢測發(fā)現(xiàn)問題時追溯原因。據(jù)自身實際條件，選擇合適的提取方法和試劑盒督管理局(NationalMedicalProductsAdministration,NMPA)注冊/2.核酸質(zhì)量評估：核酸質(zhì)量是qPCR檢測結(jié)果準確可靠的前提，因此在進行qPCR檢測前，需充分評估核酸總量、濃度和純度等指標。推薦使用紫外分光光度計進行檢測，合格的DNA吸光度(A)值260/280比值在1.8左右(一般在1.7~2.0之間),合格的RNAA260/280比值在2.0左右(一般在1.8~2.1之間)。核酸總量和濃度應(yīng)符合后續(xù)qPCR檢測要求。不符合質(zhì)控標準的核酸樣本應(yīng)重新進行核酸提取時，可嘗試進行qPCR檢測，并在報告中注明核酸質(zhì)控情況及對結(jié)果的潛3.qPCR檢測與結(jié)果分析：強烈推薦采用經(jīng)NMPA注冊/備案的商品化試劑盒進行qPCR檢測，并根據(jù)試劑盒說明書和實驗室實際情況建立盒要求將樣本核酸稀釋到規(guī)定濃度范圍。核酸質(zhì)量差的組織/細胞學樣本心后備用。融化試劑可2~8℃暫存(建議不超過24h),避免反復凍融。(3)加樣時，避免移液器反復用力吹打，以減少氣泡和核酸機械損傷。(4)加樣完成后，將PCR管瞬時離心，分散對稱放置于PCR儀內(nèi)，避免儀器熱蓋加壓時受力不平衡，按照SOP設(shè)置擴增程序。qPCR擴增完成后，先確認陰性質(zhì)控和陽性/弱陽性質(zhì)控是否在控，再分析樣本檢測結(jié)果，對于處于臨界值或灰區(qū)的樣本，記錄并分析可能原因，4.檢測報告出具：各醫(yī)療機構(gòu)應(yīng)根據(jù)實際情況，設(shè)置符合規(guī)范的結(jié)果報報告，為患者診療提供參考。共識推薦qPCR基因檢測報告至少包括以下異度、局限性以及檢測范圍和位點等)。(位點與檢測結(jié)果。基因變異位點命名推薦使用在"位點變異。如有其他意見或建議可以在結(jié)果中審核和簽發(fā)，qPCR檢測報告須經(jīng)具有分子病理診斷資格的授權(quán)簽字為保證實驗室的規(guī)范運行以及qPCR實驗結(jié)果的準確可靠，應(yīng)建立完善的質(zhì)量管理體系。對實驗室人員、儀器設(shè)備、試劑耗材、樣本、實驗方法、能驗證或性能確認。使用NMPA注冊/備案的qPCR檢測試劑盒和相關(guān)耗材，在開展臨床檢測前需要進行性能驗證，即盒開展其預(yù)期用途以外的檢測(如應(yīng)用于非進行性能驗證時，推薦根據(jù)試劑盒說明書和檢測項方案，側(cè)重驗證對檢測結(jié)果有重要影響的性1.準確度：一般采用標準品和已知結(jié)果的臨床樣本進行驗證，通過陽性本和弱陽性樣本。陽性樣本盡量覆蓋試劑的檢測盡量涵蓋常見突變位點，并在后續(xù)日常檢2.檢出限：使用已知濃度標準品和稀釋液，梯度稀釋至檢出限濃度，重3.精密度：精密度包括重復性和重現(xiàn)性兩個方面。重復性推薦使用一定數(shù)量的臨床樣本或標準品，在同樣的條件下短時間內(nèi)進行多次重復檢測。重現(xiàn)性推薦使用一定數(shù)量的臨床樣本或標準4.交叉反應(yīng)：對于基因突變檢測，可對該試劑盒覆蓋范圍內(nèi)的不同突變類型進行交叉反應(yīng)驗證，并可對序列相近或具有一定同源性的突變或野生型基因序列進行交叉反應(yīng)驗證?？蛇x取已知突變陽性樣本與其他突變陽性標準品混合，重復檢測多次，預(yù)期突變陽性位點檢測結(jié)果應(yīng)為檢出，其余位點的檢測結(jié)果應(yīng)為未檢出。5.抗干擾能力：實驗室可根據(jù)試劑說明書和臨床實際情況，選擇需要驗證的干擾物質(zhì)及濃度。對于外周血和細胞學樣本，可評估抗凝劑和樣本保存液等對結(jié)果的影響。(二)室內(nèi)質(zhì)控實驗室應(yīng)注重常規(guī)進行室內(nèi)質(zhì)量控制。室內(nèi)質(zhì)控品可以使用商品化質(zhì)控品或?qū)嶒炇易灾瀑|(zhì)控品。推薦使用商品化質(zhì)控品，如為自制質(zhì)控品，應(yīng)有制備和驗證的程序及記錄。設(shè)置陽性質(zhì)控、弱/臨界陽性質(zhì)控(一般建議為檢出限的2~4倍濃度)和陰性質(zhì)控，質(zhì)控品與待測樣本一同進行核酸提取和擴增檢測。注意質(zhì)控品的分裝，最好當次用完，避免反復凍融。此外，可對日常檢測中各突變位點陽性率進行回顧和持續(xù)動態(tài)監(jiān)測，以及時發(fā)現(xiàn)異常。檢測結(jié)果失控時，應(yīng)有失控分析處理程序、糾正和預(yù)防措施及相關(guān)記錄等。(三)室間質(zhì)評實驗室應(yīng)定期參加室間質(zhì)量評價或能力驗證，推薦每個檢測項目每年應(yīng)參加不少于1次。此外，實驗室還可選擇已獲得臨床基因擴增實驗室資質(zhì)、且已開展相同項目的同級別或更高級別實驗室進行室間比對活動。對于室間質(zhì)評中發(fā)現(xiàn)的問題，實驗室應(yīng)建立分析處理程序，并由實驗人員、質(zhì)控人員和實驗室負責人共同采取糾正措施并記錄，消除隱患并防止同類問題再次發(fā)生。四常見問題與處理建議形態(tài)異常、臨界值、假陽性、假陰性和檢測失敗等情況。當qPCR實驗出現(xiàn)異常結(jié)果時，強烈推薦根據(jù)實驗記錄及SOP對實驗流程進行逐步逐項的問題排查。對于qPCR檢測，實驗污染會嚴重影響檢測結(jié)果。因此，應(yīng)采取預(yù)防、監(jiān)控、控制和消除污染的措施，無污染是PCR實驗結(jié)果準確可靠的前提。當排除qPCR檢測實驗本身的上的判讀標準進行結(jié)果判讀。如果根據(jù)經(jīng)驗或其他線索對結(jié)果產(chǎn)生疑議，分子病理實驗室qPCR檢測最常見問題主要有樣本質(zhì)量問題(表1)、擴增分析原因并針對性地給出問題解決方案，以及預(yù)防問題再次發(fā)生的措施。位點Ct值臨界，可在結(jié)果中注明。樣本內(nèi)對照和突變信號都出現(xiàn)Ct值臨抑制物。樣本本身含有的一些物質(zhì)(如血紅素及物?？煽紤]適當稀釋核酸降低抑制物濃度后重復qPCR實驗，或?qū)怂徇M在臨界值的樣本，可換用引物/探針位點設(shè)計不同的PCR試劑盒(有可能樣本在引物/探針結(jié)合位點存在突變或單核苷酸多態(tài)性位點導致結(jié)合效率其在哪些位點一般不發(fā)生翹尾，在哪些位點尾的位點發(fā)生翹尾時，需要考慮污染的可能，同時可通過內(nèi)對照Ct值大小判斷是否上樣量過大以及是否存在PCR抑制物等，排除這些因素后若仍存在該現(xiàn)象，可考慮換用不同引物探針設(shè)計的qPCR試劑盒或其他技術(shù)擴增曲線出現(xiàn)下彎、彎折、不規(guī)則形狀和部分能涉及儀器、耗材、試劑及實驗流程等方面問題?？筛鶕?jù)該現(xiàn)象是多次實驗中均出現(xiàn)、某一次實驗中整體出現(xiàn)或某一次實等現(xiàn)象。檢查儀器的電路、光源、光路、升降溫模塊及儀器校準記錄等。檢查qPCR試劑盒與儀器是否匹配，不同品牌型號儀器的升降溫速度、熒劑盒。檢查耗材與儀器是否匹配，非儀器配套PCR管可能存在透光性不均勻或與儀器孔板模塊貼合不嚴加熱不均勻劑使用時應(yīng)融化完全并充分混勻。檢查PCR誤，如溫度、循環(huán)次數(shù)、基線信號采集和上機體積等。注意上機前PCR反應(yīng)體系一旦配制完成不可過久放置，須盡快上機，且PCR管內(nèi)不應(yīng)該有液體掛壁或有氣泡，氣泡在擴增過程中破裂也可能導致熒光信號異常。上機前檢查PCR管蓋是否蓋嚴，管和管蓋表面是否存在污物影響光信號采集，管內(nèi)液體量是否正常。檢查PCR擴增后的產(chǎn)物管是否存在管蓋崩(四)常見的異常結(jié)果有假陽性、假陰性和臨床反饋異常等情況1.懷疑假時突變曲線Ct值在臨界值附近呈弱陽性或陽性時，有可能是由于上樣濃度過高引起的假陽性。建議稀釋核酸至適宜濃度范圍內(nèi)后重新檢測。(2)1例樣本強陽其余樣本弱陽的現(xiàn)象時，應(yīng)考慮污染導致的假陽性。建議重新切取組織樣本進行復測。注意減少氣溶膠的產(chǎn)生，每步操作只打開1個因包括上機樣本核酸有效濃度較低、含有PCR抑制物、或者漏加、少加胞數(shù)量少或占比低的樣本，即使qPCR實驗質(zhì)控都合格，仍存在假陰性可和試劑的差異及局限性、多次切片后蠟塊中五qPCR檢測局限性但由于該技術(shù)本身局限性，只能檢出試劑盒涵蓋的中，采用qPCR檢測試劑盒檢測表皮生長因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)基因突變時，約有5%的EGFR罕見突變無法檢出，另外，qPCR技術(shù)無法提供基因變異豐度等信息。因此，采用qPCR方法未檢出基因變異的腫瘤樣本，推薦采用高通量測序技術(shù)等作為補充，以發(fā)現(xiàn)少見突變類型的潛在治療獲益患者。對BRCA1/2,不推薦采用qPCR方法進行檢測。六總結(jié)qPCR技術(shù)應(yīng)用于腫瘤分子病理診斷具有高靈敏度和高特異度、操作便捷和閉管檢測等優(yōu)勢，適用于對已知的基因點類型或試劑盒檢測范圍以外的突變位點以及無明確熱點突變的基因時存在局限性(不推薦)。/拒收、保存和前處理流程(強烈推薦)。腫瘤基因突變檢測優(yōu)先推薦使用4%中性甲醛固定石蠟包埋的手術(shù)切除組織或活檢組織(強烈推薦)。FFPE樣本檢測前須進行病理質(zhì)控，對樣本的前處理、評估，使用2年以內(nèi)的近期樣本，并優(yōu)先選取富含通，評估是否有條件重新采集樣本；如果無法情同意后再繼續(xù)檢測，盡量富集