專題突破10綜合PCR的基因工程問題課標(biāo)要求闡明PCR的原理、反應(yīng)條件、反應(yīng)過程；用PCR擴(kuò)增DNA片段并完成電泳鑒定。考情分析引物的選擇和設(shè)計(jì)、PCR擴(kuò)增結(jié)果的電泳鑒定與分析、PCR的應(yīng)用2024·湖南·T·山東·T32024·黑吉遼·T72023·江蘇·T·遼寧·T·江蘇·T24類型一PCR引物堿基序列的設(shè)計(jì)1．土壤鹽漬化影響水稻生長(zhǎng)發(fā)育。將水稻耐鹽堿基因OsMYB56導(dǎo)入不耐鹽堿水稻品種吉粳88中，培育耐鹽堿水稻新品種，過程①PCR擴(kuò)增OsMYB56需要添加引物，應(yīng)選用的引物組合為()A．5′－CTTGGATGAT－3′和5′－TCTGTTGAAT－3′B．5′－CTTGGATGAT－3′和5′－TAAGTTGTCT－3′C．5′－ATTCAACAGA－3′和5′－ATCATCCAAG－3′D．5′－ATTCAACAGA－3′和5′－GAACCTACTA－3′2．(2021·湖北，16)某實(shí)驗(yàn)利用PCR技術(shù)獲取目的基因，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示除目的基因條帶(引物與模板完全配對(duì))外，還有2條非特異條帶(引物和模板不完全配對(duì))。為了減少反應(yīng)非特異條帶的產(chǎn)生，以下措施中有效的是()A．增加模板DNA的量B．延長(zhǎng)熱變性的時(shí)間C．延長(zhǎng)延伸的時(shí)間D．提高復(fù)性的溫度3．以下兩組引物設(shè)計(jì)的均不合理的原因是___________________________________________________________________________________________________________________________。引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸。引物設(shè)計(jì)的優(yōu)劣對(duì)PCR反應(yīng)的效率和特異性影響很大，引物設(shè)計(jì)的原則主要包括：(1)引物長(zhǎng)度一般為20～30bp，可定位目的基因并為子鏈的延伸提供3′端。(2)引物中CG含量要適宜，CG含量越高，復(fù)性(退火)溫度越高，產(chǎn)物特異性越高。(3)引物自身、引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基互補(bǔ)，否則引物會(huì)折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或二聚體，影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。(4)引物的5′端可以修飾(添加酶切位點(diǎn)、引入突變序列)，但3′端不可修飾(與模板DNA配對(duì))。類型二利用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物4．(2024·黑吉遼，7)關(guān)于采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物的實(shí)驗(yàn)，下列敘述正確的是()A．瓊脂糖凝膠濃度的選擇需考慮待分離DNA片段的大小B．凝膠載樣緩沖液中指示劑的作用是指示DNA分子的具體位置C．在同一電場(chǎng)作用下，DNA片段越長(zhǎng)，向負(fù)極遷移速率越快D．瓊脂糖凝膠中的DNA分子可在紫光燈下被檢測(cè)出來1．DNA電泳鑒定中的“兩液兩劑”兩液：電泳緩沖液與凝膠載樣緩沖液。電泳緩沖液能維持整個(gè)電泳體系的pH穩(wěn)定，提供導(dǎo)電介質(zhì)；凝膠載樣緩沖液可影響物質(zhì)的電泳遷移速率，主要用于樣品的稀釋和保護(hù)，同時(shí)通過指示劑指示樣品在凝膠中的位置。兩劑：核酸染料與指示劑。核酸染料是用來染色DNA或RNA分子的一種化學(xué)物質(zhì)，以便在紫外燈下觀察和檢測(cè)核酸條帶，最常用的核酸染料是溴化乙錠。最常用的指示劑是溴酚藍(lán)，它在電泳凝膠中的遷移速度與DNA或RNA分子的遷移速度相近。在電泳過程中，溴酚藍(lán)通常位于樣品的前沿，形成一個(gè)明顯的藍(lán)色條帶，這有助于實(shí)驗(yàn)者判斷電泳是否完成，以及何時(shí)停止電泳。2．DNA遷移速率的影響因素(1)凝膠濃度：凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，DNA遷移受到的阻力越大，速率越慢。(2)DNA分子的大?。篋NA的分子量越大，遷移速率越慢。(3)DNA分子的構(gòu)象：三種構(gòu)象的質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠電泳的前后順序?yàn)榄h(huán)形超螺旋(DNA兩條鏈都是完整的質(zhì)粒)>線形>開環(huán)(DNA雙鏈斷了一條成為松弛的環(huán))。類型三利用PCR技術(shù)鑒定目的基因的連接方式——正向連接和反向連接5．(2019·江蘇，33節(jié)選)為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質(zhì)粒，擬設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR鑒定。圖示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質(zhì)粒中的相應(yīng)位置，PCR鑒定時(shí)應(yīng)選擇的一對(duì)引物是______。某學(xué)生嘗試用圖中另外一對(duì)引物從某一菌落的質(zhì)粒中擴(kuò)增出了400bp片段，原因是________________。類型四利用PCR技術(shù)引導(dǎo)基因定點(diǎn)突變及融合基因的重組構(gòu)建——重疊延伸PCR6．水蛭素是一種蛋白質(zhì)，可用于預(yù)防和治療血栓。某科研團(tuán)隊(duì)運(yùn)用重疊延伸PCR技術(shù)在水蛭素基因中的特定位點(diǎn)引入特定突變，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密碼子為AAC、AAU)替換為賴氨酸(密碼子為AAA、AAG)，從而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如圖。注：圖中的引物2和3的突起處代表與模板鏈不能互補(bǔ)的突變位點(diǎn)。(1)由以上事例可知，要對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，需要通過________________來完成。(2)若擬突變位點(diǎn)的堿基對(duì)為A－T，則需要讓其突變?yōu)開_____________才能達(dá)到目的。引物2的突變位點(diǎn)(突起處)應(yīng)設(shè)計(jì)為______________(假設(shè)引物為單鏈DNA)。(3)在第一階段獲得2種具有重疊片段DNA的過程中，引物1、引物2組成的反應(yīng)系統(tǒng)和引物3、引物4組成的反應(yīng)系統(tǒng)中均進(jìn)行一次復(fù)制，共產(chǎn)生____種DNA分子。該階段必須將引物1、2和引物3、4置于不同反應(yīng)系統(tǒng)中，這是因?yàn)開____________________________________________________________________________________________________。(4)利用重疊延伸PCR技術(shù)還可以將兩個(gè)不同來源的DNA片段拼接起來。有人想利用該技術(shù)把基因M和N拼接在一起，設(shè)計(jì)基因M的引物M1、M2，基因N的引物N1、N2。在設(shè)計(jì)這4種引物時(shí)，特別要注意的問題是___________________________________________________________________________________________________________________。重疊延伸PCR技術(shù)：采用具有互補(bǔ)配對(duì)片段的引物，分別進(jìn)行PCR，獲得有重疊鏈的兩種DNA片段，再在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過重疊鏈的延伸獲得想要的目的基因或?qū)⒉煌瑏碓吹娜我釪NA片段連接起來。類型五利用PCR技術(shù)擴(kuò)增未知基因序列——反向PCR7．(2020·江蘇，33節(jié)選)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，簡(jiǎn)捷地分析出已知序列兩側(cè)的序列，具體流程如圖(以EcoRⅠ酶切為例)：請(qǐng)據(jù)圖回答問題：(1)步驟Ⅰ用的EcoRⅠ是一種______________酶，它通過識(shí)別特定的________________切割特定位點(diǎn)。(2)步驟Ⅱ用的DNA連接酶催化相鄰核苷酸之間的3′－羥基與5′－磷酸間形成________________；PCR循環(huán)中，升溫到95℃是為了獲得____________；TaqDNA聚合酶的作用是催化_______________________________________________________________。(3)若如表所列為已知的DNA序列和設(shè)計(jì)的一些PCR引物，步驟Ⅲ選用的PCR引物必須是________(從引物①②③④中選擇，填編號(hào))。DNA序列(虛線處省略了部分核苷酸序列)已知序列PCR引物①5′－AACTATGCGCTCATGA－3′②5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′③5′－AGAGGCTACGCATTGC－3′④5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′反向PCR是反向互補(bǔ)引物來擴(kuò)增兩引物以外的未知序列的片段。利用在已知序列內(nèi)部沒有切點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶對(duì)此段DNA進(jìn)行酶切，在DNA連接酶作用下自連形成環(huán)狀DNA分子，然后利用方向合適并與已知序列兩端互補(bǔ)的引物，以連接成環(huán)的DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增，得到已知序列的旁側(cè)DNA片段。類型六利用PCR技術(shù)快速檢測(cè)病原體——熒光定量PCR8．猴痘是由猴痘病毒(一種RNA病毒)感染所致的一種病毒性人畜共患病，臨床上表現(xiàn)為發(fā)熱、皮疹、淋巴結(jié)腫大等。猴痘病毒感染的常規(guī)檢測(cè)方法是通過實(shí)時(shí)熒光PCR鑒定。(1)首先，從樣本中提取病毒RNA，經(jīng)________酶作用生成cDNA；然后以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，測(cè)定樣品中病毒核酸量。(2)通過實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增目的基因，需額外添加熒光標(biāo)記探針(一小段單鏈DNA，可與目的基因中部分序列特異性結(jié)合)。當(dāng)探針完整時(shí)，不產(chǎn)生熒光。在PCR過程中，與目的基因結(jié)合的探針被TaqDNA聚合酶水解，R與Q分離后，R發(fā)出的熒光可被檢測(cè)到(如圖1)。①當(dāng)樣本中有目的基因時(shí)，引物和探針與目的基因復(fù)性時(shí)，通過________________原則而特異性結(jié)合。②在PCR循環(huán)的延伸階段，TaqDNA聚合酶催化子鏈的合成并水解探針。檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度與反應(yīng)體系中DNA分子數(shù)呈__________(填“正相關(guān)”或“負(fù)相關(guān)”)。(3)通過實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)猴痘病毒感染時(shí)，檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度變化如圖2所示。①與指數(shù)增長(zhǎng)期相比，線性增長(zhǎng)期目的基因數(shù)量的增長(zhǎng)率下降，原因可能有____________________________________________________________________________________。②Ct值的含義：在PCR擴(kuò)增過程中，每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的熒光閾值時(shí)所經(jīng)歷的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。因此，當(dāng)樣本中初始模板越多時(shí)，Ct值就____________。③某新猴痘病毒核酸檢測(cè)說明書標(biāo)明，Ct≤37判定為陽性，Ct>40或無Ct值判定為陰性。圖2所示猴痘病毒核酸檢測(cè)結(jié)果應(yīng)判定為____________。(4)陰性結(jié)果也不能排除猴痘病毒感染，可能產(chǎn)生假陰性的因素有____________(多選)。a．取樣太早，樣本中病毒量少，達(dá)不到實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)閾值b．樣本被污染，RNA酶將病毒RNA降解c．病毒發(fā)生變異熒光定量PCR通過在反應(yīng)體系中加入能夠指示反應(yīng)進(jìn)程的熒光探針，當(dāng)耐高溫的DNA聚合酶催化子鏈延伸至探針處會(huì)水解探針，使熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一次，就有一個(gè)熒光分子生成，通過熒光信號(hào)的積累來監(jiān)測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的積累。Ct值是熒光信號(hào)達(dá)到熒光閾值時(shí)PCR循環(huán)數(shù)，模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在一定線性關(guān)系，起始模板量濃度越高，Ct值越?。黄鹗寄０辶繚舛仍降?，Ct值越大。答案精析1．A[圖中所示堿基序列磷酸端為5′端，羥基端為3′端，在進(jìn)行PCR操作時(shí)，引物應(yīng)分別與基因兩條鏈的3′端結(jié)合，根據(jù)圖中兩端的堿基序列，通常選擇5′－CTTGGATGAT－3′(上面鏈的引物)和5′－TCTGTTGAAT－3′(下面鏈的引物)作為引物對(duì)，A符合題意。]2．D[增加模板DNA的量可以提高反應(yīng)速度，但不能有效減少反應(yīng)非特異條帶的產(chǎn)生，A不符合題意；延長(zhǎng)熱變性的時(shí)間不影響引物和模板配對(duì)，故不能有效減少反應(yīng)非特異條帶的產(chǎn)生，B不符合題意；一般根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度適當(dāng)延長(zhǎng)延伸的時(shí)間，但延伸時(shí)間過長(zhǎng)可能會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，C不符合題意；復(fù)性溫度過低會(huì)造成引物與模板的結(jié)合位點(diǎn)增加，故可通過提高復(fù)性的溫度來減少反應(yīng)非特異條帶的產(chǎn)生，D符合題意。]3．引物Ⅰ和引物Ⅱ局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效，引物Ⅰ′自身折疊后會(huì)出現(xiàn)局部堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效4．A[在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象等有關(guān)，需根據(jù)待分離DNA片段的大小配制瓊脂糖溶液，故瓊脂糖凝膠濃度的選擇需要考慮待分離DNA片段的大小，A正確；凝膠載樣緩沖液指示劑通常是一種顏色較深的染料，可以作為電泳進(jìn)度的指示分子，B錯(cuò)誤；DNA片段的遷移速率與其大小成反比，且DNA在電場(chǎng)中從負(fù)極向正極移動(dòng)，C錯(cuò)誤；瓊脂糖凝膠中的DNA分子可在波長(zhǎng)為300nm的紫外燈(不是紫光燈)下被檢測(cè)，并且需染色，D錯(cuò)誤。]5．乙、丙目的基因反向連接解析分析題圖可知，理論上可以選擇的引物組合有甲和丙、乙和丙兩種情況。如果選擇甲和丙這對(duì)引物，則無論目的基因是否正確插入，擴(kuò)增的片段都是50＋300＋100＝450(bp)，不符合要求；如果選擇乙和丙這對(duì)引物，正向連接和反向連接后所得結(jié)果不同，所以應(yīng)選擇乙和丙這對(duì)引物進(jìn)行PCR鑒定。如果目的基因和質(zhì)粒反向連接，則引物乙會(huì)出現(xiàn)在重組質(zhì)粒的外側(cè)，此時(shí)若加入引物甲和乙，則可以擴(kuò)增出300＋100＝400(bp)的片段。6．(1)改造基因(或基因定點(diǎn)突變)(2)T－A或C－GA或G(3)3引物2和3中存在互補(bǔ)配對(duì)片段，置于同一反應(yīng)系統(tǒng)時(shí)會(huì)結(jié)合而失去作用(4)M1、M2中的一種引物與N1、N2中的一種引物必須具有互補(bǔ)配對(duì)的片段解析(2)若擬突變位點(diǎn)的堿基對(duì)為A－T，則需要讓其突變?yōu)門－A或C－G，對(duì)應(yīng)的密碼子由AAU變成AAA或由AAC變成AAG，可使天冬酰胺替換為賴氨酸。(3)若兩個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)均進(jìn)行一次復(fù)制，則會(huì)產(chǎn)生3種不同的DNA分子，因?yàn)橐?和4產(chǎn)生的DNA分子是一樣的。(4)重疊互補(bǔ)引物的設(shè)計(jì)是重疊延伸PCR技術(shù)成功的關(guān)鍵。拼接基因M和N時(shí)，需要找到兩種基因的重疊部分，即M1、M2中的一種引物與N1、N2中的一種引物必須具有互補(bǔ)配對(duì)的片段。7．(1)限制性內(nèi)切核酸(或限制)核苷酸序列(2)磷酸二酯鍵DNA單鏈以DNA為模板的DNA鏈的延伸(3)②④解析